基于網絡藥理學的松花粉調節高脂血癥機制探討△

余澤宇，梁士兵，高凱，石麗花，張紅，劉建平*

1.北京中醫藥大學 循證醫學中心，北京 100029；2.北京中醫藥大學 國際循證中醫藥研究院，北京 100029；3.北京中醫藥大學 中醫學院，北京 100029；4.煙臺新時代健康產業有限公司，山東 煙臺 264006；5.新時代健康產業（集團）有限公司，北京 102206

高脂血癥（hyperlipidemia）是一種脂質代謝紊亂性疾病，指人體內脂肪代謝或者運轉異常，使血液中血脂含量超出正常水平，血中膽固醇、三酰甘油過高或高密度脂蛋白過低。高脂血癥是導致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的重要誘因，而CVD 是成年人死亡的主要原因之一。有研究表明，血脂異常可導致機體發生慢性炎癥反應，而炎癥因子的釋放可通過損害血管內皮細胞及血管壁，增加動脈粥樣硬化的發病風險[1]；也有研究指出，與總膽固醇水平正常的人相比，高脂血癥患者發生CVD的風險大約是其2倍[2]。目前，臨床上使用的調脂藥物主要有他汀類、貝特類等，雖然療效顯著，但是近年來研究發現他汀類藥物可能引發肝損傷、橫紋肌溶解、新發腫瘤和糖尿病等不良反應[3]。因此，尋找治療高脂血癥的其他有效藥物十分必要。

松花粉，又名松花、松黃，為淡黃色粉末，主要來源于松科植物馬尾松Pinus massonianaLamb.、油松P.tabulieformisCarr.或同屬數種植物的干燥花粉[4]。其始載于《神農本草經》，被列為上品，在后期的《新修本草》《本草綱目》《本草從新》等中醫傳統著作中均有記載[5]。有研究顯示，松花粉對高脂血癥具有一定防治效果[6-8]。然而，松花粉作為一種中藥，存在成分復雜、多作用靶點、多作用通路的特點，采用傳統藥理研究方法難以系統、完整地闡明其作用機制。網絡藥理學是系統生物學的重要組成部分，其整體性、系統性和注重藥物間相互作用的特點與中醫藥學的基本特點相吻合，可用來分析藥物在網絡中與特定節點的相互作用關系，是一門從系統層面揭示中藥對機體調控網絡作用的新興學科，為研究傳統中藥的現代藥理學作用機制提供了新的思路[9-10]。

本研究通過對文獻及多種公共數據平臺進行檢索，并借助網絡藥理學分析方法，初步揭示松花粉治療高脂血癥的潛在作用機制，為松花粉的進一步研究和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 松花粉靶點確定及篩選

以“松花粉”“化學成分”“靶點”為檢索詞，檢索并篩選中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com）[11]、中國知網（https://www.cnki.net）、PubMed 數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）中松花粉化學成分相關的數據和文獻，對其化學成分進行整理歸納，檢索日期截至2021 年6 月29 日。利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[12]獲得化學成分的標準名稱和分子式，并導入SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）[13]，設定物種為“人類”，以分子相關靶點可能性（probability）≥0.08為界值進行靶點預測和篩選。

1.2 疾病相關靶點篩選

以“hypertriglyceridemia”“hypercholesterolemia”“hyperlipidemia”為檢索詞，檢索GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org）[14]和OMIM 數據庫（https://omim.org）中與高脂血癥相關的潛在靶點，檢索日期截至2021年6月30日。其中，對GeneCards數據庫中的檢索結果進行合并后，按照相關性得分（relevance score）由高到低排序并刪除重復值，之后再以相關性得分≥1 為篩選原則對靶點進行篩選。將篩選得到的靶點與OMIM 數據庫所得靶點進行合并，從而得到所有高脂血癥相關靶點。

1.3 網絡構建與分析

利用Venny 2.1軟件將得到的松花粉相關靶點與疾病相關靶點取交集，并繪制韋恩圖。進而提交至STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/）[15]構建智人的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡模型，其中最小相互作用閾值設定為“highest confidence”，其余設置均為默認。得到PPI 網絡后，通過Cytoscape 3.8.2 軟件繪制松花粉成分-交集靶點網絡，并使用軟件中的Centiscape 插件計算各節點的中介中心性（betweenness）和度（degree）值；通過MCODE 插件進一步分析PPI 網絡，提取子網絡，得到潛在功能模塊。

1.4 富集分析

將松花粉-高脂血癥交集靶點導入Metascape 平臺（https://metascape.org/）[16]，設置P<0.01、最小通路相關基因數為3、富集因子>1.5，進行交集靶點的基因本體（GO）富集分析[17]以探索靶點可能涉及的分子功能、生物過程以及基因產物活躍位置；并進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析[18]，以探尋靶點參與的潛在通路。

2 結果

2.1 松花粉靶點確定及篩選

通過中國知網、PubMed數據庫共檢索得到松花粉化學成分相關文獻29篇，其中5篇[19-23]提及松花粉化學成分、分子式及結構式，初步獲得松花粉化學成分31 個；通過TCMSP 提取松花粉化學成分8 個。對檢索到的化學成分進行合并，最終獲取化學成分35 個，見表1。通過SwissTargetPrediction 數據庫進行靶點預測及篩選，獲取靶點953 個，對重復值進行刪除，最終共計獲取松花粉靶點300個。

2.2 高脂血癥相關靶點的獲取

通過檢索GeneCards 數據庫共得到高脂血癥相關靶點4815個，刪除重復值后剩余3061個，以相關性得分≥1為原則進行篩選，共得到相關靶點897個；通過檢索OMIM 數據庫，共得到相關靶點860 個。將兩者進行整合并刪除重復值，最終得到高脂血癥相關靶點1550個。

2.3 PPI網絡構建

松花粉成分相關靶點和疾病相關靶點取交集后，得到共同靶點68 個，韋恩圖見圖1。將共同靶點提交至STRING 數據庫構建PPI 網絡模型，見圖2。將化學成分和交集靶點導入Cytoscape軟件繪制藥物成分-交集靶點蛋白網絡，見圖3。節點大小與成分-靶點蛋白網絡內節點連接數呈正相關。山柰酚、(2R,3R) -2-(3,5-dihydroxyphenyl) -3,5,7-trihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one、香橙素、β-谷甾醇和花旗松素成分節點的連接數≥20，可能是松花粉潛在關鍵成分。使用Centiscape 插件計算中介中心性和度值，計算后排序前10 的靶點蛋白見表2；使用MCODE插件對相互作用關系進行分析，得到潛在關鍵子網絡，見圖4。子網絡內部連線密度較高，外部連線相對較少，因此被認為是潛在具有生物學意義的集合，可能為蛋白質復合體或功能模塊，具有更密切的相互作用[24]。

表2 松花粉治療高脂血癥關鍵靶點

圖2 松花粉治療高脂血癥靶點PPI網絡

圖3 松花粉成分與高脂血癥交集靶點蛋白網絡

圖4 松花粉治療高脂血癥靶點PPI網絡中子網絡

2.4 富集分析

針對68個關聯交集靶點，利用Metascape平臺進行GO 富集分析和KEGG 富集分析。GO 富集分析顯示，分子功能可能與核受體活性（GO:0004879）、脂質結合（GO:0008289）、氧化酶活性（GO:0016491）、激素結合（GO:0042562）、類固醇激素受體活性（GO:0003707）、磷酸鹽結合（GO:0019902）、受體調節（GO:0030545）等相關（圖5A）；生物過程可能與類固醇代謝（GO:0008202）、炎癥反應（GO:0006954）、活性氧化物代謝（GO:0072593）、細胞脂質應答（GO:0071396）、激素調節（GO:0010817）、代謝物前體和能量生成（GO:0006091）等相關（圖5B）；細胞組成可能與受體復合物（GO:0043235）、囊腔（GO:0031983）、核膜膜間隙（GO:0005641）、細胞膜（GO:0098552）、細胞外基質（GO:0031012）、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物（GO:0090575）等相關（圖5C）。

圖5 松花粉治療高脂血癥靶點的GO富集分析

KEGG 富集分析顯示，松花粉治療高脂血癥的作用機制可能涉及缺氧誘導因子HIF-1 信號通路（hsa04066）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信號通路（hsa03320）、卵巢類固醇生成（ko04913）、脂肪細胞脂解調節（hsa04923）、膽汁分泌（ko04976）、胰高血糖素信號通路（ko04922）、類固醇生物合成（hsa00100）、脂肪消化和吸收（ko04975）等，見表3。

表3 松花粉治療高脂血癥靶點KEGG富集分析潛在的相關通路

將子網絡進行KEGG富集分析，顯示子網絡1和2 與胰島素抵抗（hsa04931）、HIF-1 信號通路（hsa04066）、類固醇合成（hsa00100）可能有關，子網絡3未見到相關基因≥2的潛在通路，見表4。

表4 松花粉治療高脂血癥靶點子網絡KEGG富集分析潛在的相關通路

3 討論與總結

松花粉是中藥中少有的花粉類中藥材。近年來，關于松花粉及破壁松花粉等加工產物的藥用和保健價值的研究較多，其含有豐富的營養成分和生物活性物質，具有抗衰老、緩解疲勞、降血糖、美容等多種保健和藥用功效[25]。松花粉因其“止血除風”之性，多用以外敷，而內服用藥時其調脂作用尤為受到關注[26]。含有松花粉的扶正化瘀方有助于抑制體外細胞和小鼠脂肪性肝纖維化進展[27-29]。馬尾松花粉水提物能夠促進高脂飲食小鼠脂質代謝過程，使小鼠體質量相對減輕、血脂水平有所改善[30]。樊柏林等[31]發現破壁松花粉能夠有效預防大鼠脂肪堆積。多項實驗及臨床研究均提示松花粉具有較好的調脂作用[7-8,32]。

網絡藥理學對生物網絡進行整合分析，可以提示藥物與作用靶點間的相互關系，為已知中藥的臨床療效和靶點開發提供理論依據[9]。本研究通過對現有文獻的總結，整理了松花粉的潛在成分，作為TCMSP 中化合物的補充。其中柚皮素被證實可抑制脂肪生成并降低脂肪細胞中胰島素敏感性[33]；龍腦可以顯著降低高糖高脂大鼠低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和動脈粥樣硬化指數[34]。

成分-靶點網絡體現了松花粉內成分存在復雜的高脂血癥治療交互作用。其潛在關鍵成分中，山柰酚是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用[35]。山柰酚可以通過刺激巨噬細胞中2 種高密度脂蛋白受體的蛋白表達，增加巨噬細胞膽固醇外排[36]。山柰酚還可以促進巨噬細胞、肝細胞和腸細胞中肝X受體（LXRs）及其靶基因的mRNA水平，誘導肝細胞PPAR 活性，抑制蛋白激酶B（Akt）并誘導肝細胞自噬，從而降低血漿和肝臟三酰甘油水平[37]。香橙素也是一種黃酮類化合物，具有很好的抗炎、抗氧化、抗增殖活性，可以改善葡萄糖攝取和胰島素抵抗，并抑制心臟纖維化及相關的纖維生成基因，對心功能有改善作用，這些都與高脂血癥的治療和預后相關[38]。花旗松素同樣具有抗炎、保護心血管等作用，可以降低大鼠血清和肝臟的脂濃度、肝臟總膽固醇水平[39]，抑制人低密度脂蛋白氧化[40]。β-谷甾醇對高膽固醇類高脂血癥作用效果良好，可以防止或逆轉肝臟和主動脈中脂質和膽固醇濃度的增加[41-42]。

PPI 網絡顯示，在“highest confidence”為最小相互作用閾值下，共存在68 個節點和113 條連接，其中中介中心性排序前10 的關鍵節點中與調脂可能相關的有類視黃醇X 受體α（RXRA）、β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、Akt1、磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基α（PIK3R1）、甲狀腺素運載蛋白（TTR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）等。RXRA與脂質代謝和脂肪細胞分化的調節相關[43]，參與膽汁酸和膽汁鹽的運輸、膽固醇代謝等血脂調節途徑；APP 可能參與胰島素受體結合和膽固醇代謝；Akt1是許多通路的關節靶點，功能涉及細胞生存、新陳代謝等[44]，和PIK3R1 一同參與胰島素對血糖、血脂的調節[45-47]；TTR則通過參與甲狀腺素調節對脂質代謝產生影響；PRARA 是脂質傳感器和脂質代謝調節器，其激活可以減少肝細胞內脂質積累[48]，已被證明可治療血脂異常[49]。另外，與凝血和炎癥相關的潛在關鍵靶點，如血管內皮生長因子（VEGFA）和腫瘤壞死因子（TNF）等，對高脂血癥造成的心血管病變有調節作用，可能是松花粉治療高脂血癥的非降脂相關的作用靶點。

GO富集展示了松花粉干預高脂血癥的蛋白在細胞內的存在位點和潛在分子、生物學過程。KEGG信號通路富集分析表示，松花粉調脂的作用機制可能涉及HIF-1 信號通路、PPAR 信號通路、卵巢類固醇生成、脂肪細胞脂解調節、膽汁分泌、胰高血糖素信號通路、類固醇生物合成、脂肪消化和吸收等。其中HIF-1 是響應缺氧和激活基因的關鍵轉錄調節器，有研究顯示，HIF-1信號通路參與氧化低密度脂蛋白的抑制和高脂血癥的調控[50]，并且可通過抑制長鏈酰基輔酶A 脫氫酶與中鏈酰基輔酶A 脫氫酶抑制脂肪酸的分解代謝[51]。PPAR 在棕色脂肪的形成和體溫控制中起著核心的作用，可通過調節合成代謝和氧化過程之間的平衡來調節脂肪組織的動態平衡，存在增加脂肪酸氧化、脂質分解代謝的能力[52]。胰高血糖素則可以降低三酰甘油的吸收和分泌、增加膽汁中膽固醇排泄，該通路可以通過調節肝脂代謝，從而調治血脂異常[53]。

研究結果初步說明了松花粉治療高脂血癥可能的作用機制，體現了松花粉多靶點、多通路、聯合調控、調節平衡的特點。但因為在分析中混入較多與高脂血癥關聯性不明顯的功能機制和通路，且針對基因相關作用特點缺乏明確的實驗確認，需要進一步實驗研究以明確松花粉治療高脂血癥的作用機制、松花粉對比其他降脂藥物作用的異同，從而為高脂血癥的治療提供更多思路和選擇。