酶處理方式對模擬酒中藍莓細胞壁吸附單寧的影響

劉乾坤，高 宇，郭 小，徐曉云，3，李二虎，3

（1.華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.上海交通大學 農業與生物學院植物科學系葡萄與葡萄酒研究中心，上海 200240；3.華中農業大學 果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430070）

藍莓富含酚類物質，如花色苷、單寧、酚酸等，具有顯著的營養價值和抗氧化能力[1-2]。藍莓單寧（tannins，TA）主要存在于果皮和籽中[3]，在釀造過程中釋放到藍莓酒中，賦予其復雜的口感和抗氧化功效。然而，從皮或籽中釋放出的單寧會被酒醪或酒體中的細胞壁多糖吸附形成沉淀，導致藍莓酒中單寧的含量降低[4-6]。單寧作為藍莓酒的“骨架”，對于酒體的口感、顏色和抗氧化性具有積極的作用，尤其是被細胞壁率先吸附的高聚合度單寧貢獻著酒體的收斂性和色澤[7-8]，影響著其品質。一些研究表明，在發酵前通過提高浸漬溫度和延長浸漬時間能夠增加葡萄醪中單寧的含量[9-10]，但會帶來生產成本增加和時間變長的問題。

葡萄酒釀造過程中，單寧的含量會下降，主要原因是這些成分與懸浮的葡萄細胞壁之間發生了相互作用[11]。OSETE-ALCARAZ A等[12]研究發現，釀造初期清除懸浮的細胞壁，釀造結束后葡萄酒中的單寧含量可提高43%。有研究結果表明，添加果膠酶和纖維素酶能夠改變細胞壁多糖的網絡結構，從而減少細胞壁對單寧的吸附量[13-14]。

藍莓細胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素等多糖構成[15]，在釀酒過程中可被水解酶解構，降低其對單寧的吸附能力。BAUTISTA-ORTIN A B等[16]研究表明，單寧的分子質量越大，與細胞壁多糖的親和力越強。WANG Y F等[17]研究發現，藍莓中的單寧多為B型縮合單寧和高分子質量單寧，易與細胞壁多糖結合形成復合物而降低其在藍莓酒中的含量。

因此，水解酶的添加有可能減少藍莓酒釀造過程中細胞壁對單寧的吸附，進而提高藍莓酒中單寧的含量，目前這方面的研究還有待深入。本研究的主要目的是探究果膠酶和纖維素酶的添加方式（單獨、順序及同時）對藍莓細胞壁結構及其吸附單寧能力的影響，旨在為藍莓酒釀造過程中酶或酶組合的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔眼藍莓（品種：燦爛）：由云南省玉溪市安瓊藍莓種植基地提供。

三氟乙酸（分析純）：上海麥克林生物科技有限公司；（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素、（-）-表沒食子兒茶素、（-）-表兒茶素沒食子酸酯、D-（+）-半乳糖醛酸標準品：上海源葉生物科技公司；果膠酶（pectinase，PEC）EC 3.2.1.15（30 000 U/g）、纖維素酶（cellulase，CEL）EC 3.2.1.4（25 000 U/g）、藍莓單寧標準品（純度＞98%）、甲基纖維素（黏度1 500 CP）、抗壞血酸、3,5-二硝基水楊酸、間苯三酚（均為分析純）、乙腈、甲酸（均為色譜級）：上海阿拉丁生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

e2695高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國Waters公司；3-18K高速冷凍離心機：德國Sigma公司；UV-1700紫外-可見光分光光度計：日本島津公司；LC-10N-50A真空冷凍干燥機：上海力辰儀器科技有限公司；NicoLET IS50 FT-IR光譜儀：美國Thermo Nicolet公司；TM3030 Plus掃描電鏡：日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓細胞壁的純化

以新鮮藍莓果皮為原料，參考APOLINAR-VALIENTE R等[18]的方法制備純化細胞壁（cell walls，CW）。首先，清洗藍莓以除去灰塵，然后用刀片將皮與果肉剝離。隨后將果皮放置液氮中速凍并研磨成粉末，將果皮粉末懸浮在沸水中5 min以滅活內源酶，待懸浮果皮粉末的沸水冷卻至室溫后，使用均質機（10 000 r/min）均質2 min。將均質后的混合物離心（10 000×g，15 min），丟棄上清液。將固體殘留物用體積分數70%乙醇（30 ℃）洗滌數次以去除醇溶性固體和酚類物質，用乙醇（體積分數96%）和丙酮分別洗滌3次。最后，將不溶性殘留物凍干后研磨成粉末，即為CW，在室溫下儲存于干燥皿中備用。

1.3.2 酶處理方式對藍莓細胞壁吸附單寧的影響

反應體系的設置參考BAUTISTA-ORTíN A B等[19]的方法，配制模擬溶液（含12%的乙醇并用三氟乙酸將pH調至3.6，使用三氟乙酸調pH有助于穩定單寧的結構和提高高效液相色譜檢測的靈敏度、準確度[20]），然后稱取520 mg的CW到40 mL模擬溶液中，混合均勻后添加不同的細胞壁水解酶和80 mg單寧進行反應。反應體系中，單寧和CW的最終質量濃度分別為2 mg/mL和13 mg/mL。酶的添加方式參考NOGALES-BUENO J等[21]的方法，如表1所示。然后用磁力攪拌器將反應溶液攪拌90 min（200 r/min，25 ℃），反應期間避光，并用氮氣吹掃。反應結束后，將樣品離心（10 000×g，10 min），分別收集上清液和沉淀，并在4 ℃下儲存備用。每個處理設置6次重復。其中3個重復的上清液經過濃縮（-0.1 MPa，50 ℃）后溶解在甲醇中（上清液∶甲醇=10∶1，V/V）用于分析單寧的含量，另外3個重復的上清液直接用于分析多糖的組成。收集的沉淀（即反應后的CW）用于分析細胞壁結構的變化。

表1 模擬溶液中酶的添加方式Table 1 Enzyme addition ways in the model solution

1.3.3 單寧含量的測定及吸附率計算

單寧含量的測定參考SARNECKI S C J等[22]的方法，使用4 g/100 mL的甲基纖維素溶液沉淀“1.3.2”上清液中的單寧。在波長280 nm處，分別測定上清液中未添加甲基纖維素溶液的吸光度值和添加甲基纖維素溶液的吸光度值，兩者吸光度值相減，得到溶液中所含單寧的吸光度值，然后根據（+）-兒茶素標準曲線計算溶液中單寧的含量，結果表示為每毫升模擬溶液的（+）-兒茶素當量（mg/mL）。以吸光度值（y）為縱坐標，（+）-兒茶素質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.365 9x+0.053 2。通過標準曲線計算單寧含量。

單寧吸附率的計算公式如下：

式中：C為實驗組中單寧的含量，mg/mL；C0為空白組（TA）反應后單寧的含量，mg/mL。

1.3.4 單寧組成的分析

參照KENNEDY J A等[23]的方法并略微修改，分析“1.3.2”上清液中單寧的組成。首先配制含100 g/L間苯三酚和20 g/L抗壞血酸的0.2 mol/L HCl的甲醇溶液（稱為間苯三酚分解試劑）。然后將間苯三酚分解試劑與“1.3.2”中上清液的甲醇提取物（1∶1）在65 ℃的水浴中反應30 min，并用2倍體積的0.2 mol/L醋酸鈉溶液終止反應。

分析條件：檢測器為光電二極管陣列檢測器（photodiode array detector，PAD），波長為280 nm。洗脫條件參考BUSSE-VALVERDE N等[24]的方法。流動相A：體積分數為2%的甲酸溶液；流動相B：乙腈-水-甲酸體積比為80∶18∶2；TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速為0.8 mL/min，進樣體積10 μL，溫度30 ℃。梯度洗脫程序為：0～5 min，0%B；5～35 min，0%～10%B；35～65 min，10%～20%B。單寧裂解產物的組成根據它們在波長280 nm處的響應值進行鑒定，以（+）-兒茶素為標準品進行定量。單寧的構成單元參照文獻[23]進行定性。平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）的計算方法為所有亞基（即黃烷-3-醇單體和間苯三酚加合物，以摩爾為單位）的總和除以所有黃烷-3-醇單體的總和（以摩爾為單位）。

單寧沒食子?；俜直龋╬ercentage of galloylation，Gal）的計算：

1.3.5 半乳糖醛酸和總糖含量的測定

溶液中半乳糖醛酸含量的測定參考文獻[25]中的方法。在波長540 nm處測量吸光度值，以D-（+）-半乳糖醛酸為定量標準計算樣品中半乳糖糖醛酸的含量。重復分析3次，結果取平均值。

總糖含量的測定參考楊寧等[26]的方法并略作修改。取2 mL待測液并添加7 mL稀鹽酸，80 ℃水浴20 min。反應結束后，用2.5 mol/L NaOH將溶液的pH調至7.0。取3 mL 3,5-二硝基水楊酸添加到溶液中，沸水浴9 min，冷卻至室溫并在波長540 nm處測量吸光度值。總糖的含量以D-（+）-葡萄糖為標準品進行定量。重復分析3次，結果取平均值。

1.3.6 純化細胞壁多糖化學結構的分析

參考BUREAU S等[27]的方法，將CW和“1.3.2”中反應后的純化細胞壁樣品凍干，并儲存在P2O5環境中以去除殘留的水分。紅外光譜在波數4 000～500 cm-1范圍內測定，并用空氣背景光譜進行校正，信號累計掃描次數32次，每個樣本重復掃描3次。

1.3.7 純化細胞壁微觀結構的分析

將CW和“1.3.2”中反應后的純化細胞壁樣品用雙面膠帶固定在樣品臺上，并用濺射鍍膜機濺射金粉。在高真空條件下觀察圖像，加速電壓為10 kV，圖像放大倍數為1 000。

1.3.8 數據統計與分析

每個數據平行測量3次。數據表示為“平均值±標準偏差”，采用SPSS 22.0軟件對結果進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），然后用Duncan檢驗進行組間多重比較來分析數據之間的顯著性差異（P＜0.05），使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酶處理方式對模擬溶液中單寧含量的影響

由圖1可知，與空白組（TA）相比，添加純化后的藍莓細胞壁（CW+TA）顯著降低模擬體系上清液中單寧的含量（P＜0.05），單寧的吸附率達51.9%。與對照組（CW+TA）相比，添加水解酶提高了模擬體系中單寧的含量，除單獨使用果膠酶組（CW+TA+PEC）外，其他各組差異均顯著（P＜0.05）。在添加酶試驗組中，同時使用果膠酶和纖維素酶組（CW+TA+PEC+CEL）單寧含量最高，為1.26 mg/mL，顯著高于其他各組（P＜0.05）。在順序添加酶試驗組中，優先使用果膠酶組（CW+TA+PEC1+CEL2）的單寧含量顯著高于優先使用纖維素酶組（CW+TA+CEL1+PEC2）（P＜0.05）。

圖1 酶處理方式下模擬溶液中單寧的含量和吸附率Fig.1 Content and adsorption rate of tannins in model solution with enzyme treatment

酶處理組單寧的含量均高于對照組（CW+TA），這是由于在酶的作用下藍莓細胞壁多糖網絡被分解，細胞壁吸附單寧的能力減弱。CW+TA+PEC+CEL組單寧的吸附率最低為30.4%，這可能是由于同時添加果膠酶和纖維素酶能夠有效分解藍莓細胞壁中的果膠和纖維素，減少細胞壁對單寧的吸附。OSETE-ALCARAZ A等[28]的研究表明在模擬葡萄酒溶液中同時添加果膠裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶使細胞壁多糖分解的最顯著，并釋放低分子質量的可溶性多糖到溶液中，降低了單寧與細胞壁多糖之間的相互作用。CW+TA+PEC1+CEL2組和CW+TA+CEL1+PEC2組單寧的吸附率分別為34.3%和36.5%，表明優先加入果膠酶能夠更大程度地保留溶液中單寧的含量，這可能是由于細胞壁中果膠的解構有利于纖維素酶分解纖維素，進而減少細胞壁對單寧的吸附量[29]。CW+TA+PEC1+CEL2組單寧的吸附率（34.3%）高于CW+TA+PEC+CEL組（30.4%），這可能是由于細胞壁孔隙率的增加會促進高分子質量單寧在細胞壁網絡框架中的包裹[14]，因此增加了細胞壁對單寧的吸附率。

單寧含量的提高可能會增加藍莓酒的澀感，然而酒體澀感的強度不僅取決于單寧的含量，還取決于單寧的組成和平均聚合度[30]。此外，酒體的pH、酒精度、多糖含量等成分，都會對酒體的澀感產生一定程度的影響[31]。因此，酒體中單寧的含量并不完全是判定澀感強弱的唯一指標。適度的澀感使得酒體口感醇厚、后味綿長。在釀造過程中，釀酒師有時會添加單寧以增強酒體的口感和提高成品酒的營養價值。

2.2 酶處理方式對模擬溶液中細胞壁與單寧相互作用的影響

模擬體系上清液中單寧組成的分析參照文獻[23]的方法。間苯三酚與單寧反應的機理如圖2所示，在酸性條件下單寧發生解聚，釋放出末端單元黃烷-3-醇單體（兒茶素、表兒茶素等）和延伸端單元黃烷-3-醇中間體（碳正離子形式），黃烷-3-醇中間體可以與間苯三酚結合生成可分析的加合物，僅末端的單元以黃烷-3-醇單體的形式穩定存在。

圖2 間苯三酚與單寧反應的機理Fig.2 Reaction mechanism of phloroglucinol and tannins

模擬溶液中單寧的亞基組成見圖3。由圖3可知，共檢測出7種單寧亞基單體，其中包括3種末端單元和4種延伸端單元，參照文獻[23-24]對間苯三酚加合物進行定性。

圖3 間苯三酚存在下酸催化藍莓單寧裂解產物的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of blueberry tannin cleavage product catalyzed by acid catalysis in the presence of phloroglucinol

如表2所示，在單寧的構成單元中，（+）-兒茶素和（-）-表兒茶素是主要的亞基，這與藍莓中多為B型縮合單寧的組成特征一致。與空白組（TA）相比，藍莓細胞壁的存在（CW+TA）顯著降低模擬體系上清液中單寧的平均聚合度（mDP）（P＜0.05），為3.94。與對照組（CW+TA）相比，添加水解酶增加了模擬體系上清液中單寧的mDP，尤其同時添加果膠酶和纖維素酶最為顯著，這表明酶的添加能夠增加高聚合度單寧分子在溶液中的含量。研究表明，細胞壁吸附單寧的能力隨單寧分子質量的增加而增強，高聚合度的單寧可能因具有更多結合細胞壁多糖的位點而優先被細胞壁吸附，而低聚合度的單寧因自締合作用減少了其與細胞壁的結合[16，19，32]。本研究模擬溶液中高聚合度單寧分子含量的增加表明酶的添加降低了細胞壁結合單寧的能力，其中同時添加果膠酶和纖維素酶效果最為顯著。CW+TA+PEC組溶液中剩余單寧的mDP（3.95）與CW+TA組（3.94）差異不顯著（P＞0.05），表明僅在果膠酶的作用下，細胞壁仍然保持著較強的吸附單寧的能力，這與“2.1”在所有添加酶試驗組中，單獨添加果膠酶處理組溶液中單寧的含量最低一致。

表2 酶處理方式下模擬溶液中單寧的組成Table 2 Composition of tannins in model solution with enzyme treatment

與空白組（TA）相比，添加純化后的藍莓細胞壁使模擬體系上清液中單寧的沒食子酰化百分比均顯著降低（P＜0.05）。這可能是因為單寧分子中沒食子酸的取代增加了細胞壁多糖與單寧形成氫鍵的位點數量，所以沒食子?；俜直龋℅al%）較高的單寧優先被細胞壁吸附[16]。結果表明，酶的添加能夠提高模擬溶液中剩余單寧的Gal%，這表明酶處理后的細胞壁對單寧的吸附量減少，尤其是在同時添加果膠酶和纖維素酶時細胞壁對單寧的吸附能力最弱。

2.3 酶處理方式對模擬溶液中半乳糖醛酸和總糖含量的影響

為分析酶處理方式對分解果膠和細胞壁多糖能力的差異，模擬體系中半乳糖醛酸和總糖的含量見表3。

表3 模擬溶液中半乳糖醛酸和總糖含量Table 3 Contents of galacturonic acid and total sugar in the model solution

由表3可知，在順序添加酶試驗組中，優先使用果膠酶組（CW+TA+PEC1+CEL2）的半乳糖醛酸含量顯著高于優先使用纖維素酶組（CW+TA+CEL1+PEC2）（P＜0.05）。在單獨添加酶試驗組中，單獨添加纖維素酶組（CW+TA+CEL）的總糖含量顯著高于單獨添加果膠酶試驗組（CW+TA+PEC）（P＜0.05）。

CW+TA組溶液中含有少量的半乳糖醛酸和總糖，這表明模擬溶液能夠促進CW中多糖的釋放，這與BEAVER J W等[33]的研究結果一致。CW+TA+PEC1+CEL2組的半乳糖醛酸含量高于CW+TA+CEL1+PEC2組，可能是由于先添加果膠酶水解果膠，有利于纖維素酶破壞藍莓細胞壁多糖的網絡結構，這提高了果膠酶分解果膠的效率，增加溶液中半乳糖醛酸的含量。CW+TA+CEL組溶液中總糖含量顯著高于CW+TA+PEC組（P＜0.05），這可能是由于纖維素的分解使藍莓細胞壁的多糖網絡結構變疏松，有利于細胞壁內多糖的釋放。有研究發現纖維素酶分解纖維素打開了細胞壁的結構，促進細胞壁內果膠多糖的釋放，增加了溶液中總糖的含量[19，34]，這在本實驗單獨添加纖維素酶處理方式下得到進一步的驗證。酶處理后，溶液中半乳糖醛酸和總糖含量增加，表明藍莓細胞壁多糖分解和釋放，這可能解釋細胞壁對單寧吸附能力降低的原因。

2.4 酶處理方式對細胞壁多糖結構的影響

紅外光譜分析藍莓細胞壁多糖化學結構的變化見圖4。

圖4 酶處理方式下細胞壁多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 FT-IR of cell wall polysaccharides with enzyme treatment

由圖4可知，細胞壁多糖在波數3 400 cm-1和2 920 cm-1處出現兩個特征峰，分別與糖類的O-H和C-H的伸縮振動有關[35]。波數1 740 cm-1和1 600 cm-1處的兩個吸收峰分別與果膠中的酯化羧基（-COOR）和非酯化羧基的伸縮振動有關。波數1 065 cm-1處的吸收峰歸因于糖苷鍵（C-O-C）的伸縮振動，這可能與半纖維素有關[36]。波數988 cm-1處的吸收峰是由于C-O、C-C的伸縮振動引起，這可能與纖維素有關[37]。LIU X W等[37]研究發現，在1 800～800 cm-1波數范圍內，1 065 cm-1和988 cm-1處的吸收峰分別與半纖維素和纖維素的存在有關。由圖4可知，在波數988 cm-1附近，CW組、CW+TA組、CW+TA+PEC組的特征吸收峰強度高于添加纖維素酶的處理組，這是由于未添加纖維素酶的細胞壁中含有較多的纖維素。ABIDI N等[38]運用紅外光譜研究棉纖維中細胞壁和纖維素含量的變化，結果表明可以用吸收峰振動的綜合強度間接估測纖維素的含量。在添加酶的試驗組中，CW+TA+PEC+CEL組在波數1 740 cm-1和988 cm-1附近吸收強度最弱，這可能是由于同時添加果膠酶和纖維素酶使細胞壁中的果膠和纖維素大量分解。本研究表明，酶的不同添加方式對藍莓細胞壁多糖的分解效果不同，這可能解釋了不同處理組中細胞壁對單寧吸附能力不同的原因，但實際結果要根據對細胞壁微觀結構的觀察進一步驗證。

2.5 酶處理方式對細胞壁微觀結構的影響

如圖5所示，純化的細胞壁（CW）表面相對平滑、結構致密，CW+TA組（圖5A）的細胞壁比CW破碎程度高。CW+TA+PEC組（圖5B）比CW+TA+CEL組（圖5C）的細胞壁結構分解程度較小，這與總糖含量分析結果一致。CW+TA+CEL1+PEC2組的細胞壁結構呈塊狀（圖5E），而CW+TA+PEC1+CEL2組的細胞壁結構相對較為破碎，并具有一些微小的孔洞（圖5D），表明優先添加果膠酶更有利于細胞壁結構的分解。CW+TA+PEC+CEL組細胞壁形態分布不均勻且呈碎片狀（圖5F），說明同時添加果膠酶和纖維素酶能夠有效分解藍莓細胞壁的結構，這驗證了在此酶處理方式下單寧吸附率最低的結果。研究發現，細胞壁孔洞的增加將促進高聚合度單寧分子滲透到更疏松的細胞壁網絡，增加細胞壁對高分子質量單寧的吸附量[14]。先添加果膠酶再添加纖維素酶處理方式下，細胞壁微小孔洞的形成可能是細胞壁對單寧吸附率高于同時添加果膠酶和纖維素酶的原因。

圖5 不同酶處理方式下細胞壁的掃描電鏡Fig.5 Scanning electron microphotographs of cell walls with different enzyme treatment methods

3 結論

水解酶的不同添加方式均顯著降低藍莓細胞壁對高聚合度單寧的吸附量（P＜0.05），提高模擬酒中單寧的含量。藍莓單寧的組成單元主要是（+）-兒茶素和（-）-表兒茶素，水解酶的添加因分解藍莓細胞壁的多糖結構而減少對高聚合度單寧的吸附量。在所有添加方式中，同時添加果膠酶和纖維素酶及先添加果膠酶再添加纖維素酶分別使細胞壁對單寧的吸附率降低21.5%和17.6%，先添加果膠酶再添加纖維素酶處理方式下，細胞壁微小孔洞的形成使得藍莓細胞壁對單寧吸附率高于同時添加果膠酶和纖維素酶處理方式。本實試探究水解酶的不同添加方式對模擬酒中單寧含量的影響，為提升藍莓酒的營養品質提供一定的理論參考依據。在后續研究中，可探究從細胞壁中釋放出的多糖與單寧之間的相互作用機制，或探究限制藍莓酒中的多糖對單寧吸附的方法。