山西陳醋釀造微生物群落結構及其互作網絡分析

寇 蓉，董弘毅，何永吉，邢俊德，范曉軍

（1.太原理工大學 生物醫學工程學院，山西 晉中 030600；2.山西轉型綜合改革示范區管理委員會，山西 太原 030032；3.山西農業大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；4.太原理工大學環境科學與工程學院，山西 晉中 030600）

食醋是富有營養的酸性調味品，能增進食欲，且具有食物防腐、除腥及預防疾病等功能[1]。在我國，傳統食醋釀造是由眾多微生物參與并驅動谷物原料發酵，這些微生物因釀造原料[2]、氣候特點[3]、制作工藝等不同而具有多樣性和復雜性[4-6]。WANG Z M等[7]利用宏基因組方法分析鎮江香醋醋酸發酵階段微生物時共鑒定出151個細菌屬和202個真菌屬，其中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是優勢細菌屬，鏈格孢屬（Alternaria）和曲霉屬（Aspergillus）是優勢真菌屬。YUN J M等[8]利用高通量測序技術研究發現涼州熏醋釀造過程中出現25個細菌屬和18個真菌屬，并且優勢真菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）。微生物群落不僅受到外界環境因素的影響[9]，群落間的相互作用也塑造了微生物群落結構[10]，共現模式可為研究復雜微生物環境的群落結構和功能提供新的視角。共現網絡可反映復雜環境下占互作主導地位的優勢物種、互作緊密的物種群，這些優勢物種以及物種群往往對維持復雜環境的微生物群落結構和功能穩定發揮著獨特以及重要的作用[11-14]。目前，在人類腸道[15-16]、土壤[17-19]、植物根際[20]和食品發酵[21-22]等復雜系統中的微生物共現模式研究已得到了學者的廣泛關注。

本研究以山西陳醋釀造過程中不同發酵階段醋醅為研究對象，采用高通量測序技術研究食醋微生物群落的結構和多樣性，并應用互作網絡數據可視化的軟件Cytoscape 3.7.2構建了食醋微生物群落的互作網絡，揭示山西陳醋釀造過程中的微生物群落相互作用關系，可為深入認識食醋發酵微生物和食醋發酵過程控制提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醋醅樣品：山西清徐縣某醋廠食醋淀粉糖化（starch saccharification，Sac）發酵第2天樣品（編號Sac2）、酒精發酵（alcohol fermentation，AF）第12天樣品（編號AF12）、醋酸發酵（acetic acid fermentation，AAF）第1天、第3天、第7天和第10天樣品（編號分別為AAF1、AAF3、AAF7、AAF10）。糖化和酒精發酵階段樣品取自發酵池的頂部、中部和底部，混合后得到測試樣；醋酸發酵階段樣品在距離發酵池表面30 cm的深度進行東西南北中五點采集，混合均勻后作為醋酸發酵階段的測試樣。樣品用無菌密封袋封裝，-20 ℃保存備用。

1.1.2 試劑

酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、50×TAE緩沖液（Tris acetate 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），TAE）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）裂解液、溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶、緩沖液：美國NEB公司；GeneJET膠回收試劑盒：美國Thermo Fisher Scientific公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京市水光明醫療儀器有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoVue plus超微量紫外分光光度計：英國Cytiva公司；T100梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司；Novaseq6000高通量測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取與檢測

采用CTAB法[23]對醋醅樣本的基因組DNA進行提取，操作如下：①吸取1 000 μL CTAB 裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65 ℃水浴（時間為2～3 h），期間顛倒混勻數次，以使樣品充分裂解。②離心取950 μL上清，加入與上清等體積的酚（pH 8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。③取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。④吸取上清至1.5 mL離心管里，加入上清液3/4體積的異丙醇，上下搖晃，-20 ℃沉淀。⑤12 000 r/min離心10 min，倒出液體。用1 mL體積分數為75%乙醇洗滌2次，剩余的少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出。⑥超凈工作臺吹干或者室溫晾干。⑦加入51 μL雙蒸水（ddH2O）溶解DNA樣品。⑧加RNase A 1μL消化核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），37 ℃放置15 min。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性并用超微量分光光度計測定DNA的濃度與純度。

1.3.2 PCR擴增與高通量測序

用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和引物ITS3-2024F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）、ITS4-2409R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）分別擴增細菌16S rRNA基因V4區和真菌ITS2區。PCR擴增體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物各1.5 μL，基因組DNA（genomic DNA，gDNA）10 μL，ddH2O 2 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行回收和純化。高通量測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3.3 高通量測序數據分析

測序原始序列通過序列拼接、過濾、質量控制、去除嵌合體，得到最終有效序列[24-25]。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性將所有樣本的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[26]。用Mothur軟件與SILVA（v138.1）數據庫對細菌OTUs序列進行物種注釋分析，用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Unite（v8.2）數據庫對真菌OTUs序列進行物種注釋分析，并分別在門、綱、目、科、屬水平上統計各樣本的群落組成。最后對各樣本數據進行均一化處理用于后續Alpha多樣性分析。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-OTUs、Shannon、Simpson、Chao1、ACE及Coverage指數。利用Origin 8.5軟件繪制稀釋曲線和門水平、屬水平物種相對豐度柱狀圖。通過對所有樣本進行斯皮爾曼相關系數（Spearman's correlation coefficient，SCC）計算，得到物種相關系數矩陣后，設置過濾條件如下：①顯著性閾值設置為0.05；②去除相關系數絕對值＜0.6的連接；③過濾掉節點自連接；④最大物種數目設置為50。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪圖，以門水平為著色單位可視化山西陳醋釀造過程中細菌和真菌的共現網絡，其中顯示標簽的節點為平均相對豐度＞1%的菌屬。

2 結果與分析

2.1 醋醅樣品測序數據分析

基于高通量測序技術對醋醅樣品中細菌和真菌的有效序列和OTUs進行研究，結果見表1。

表1 醋醅樣品中細菌和真菌的序列信息Table 1 Sequence information of bacteria and fungi in Cupei samples

6個醋醅樣品共產生384 486條細菌有效序列，352 791條真菌有效序列。將有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，共得到1 197個細菌OTUs和432個真菌OTUs，并且在各個發酵階段細菌OTUs均大于真菌OTUs，說明醋醅中細菌群落多樣性遠高于真菌群落。用Mothur軟件與SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，將所有的細菌序列鑒定為36個門、67個綱、153個目、238個科、429個屬。用BLAST與Unite（v8.2）數據庫進行物種注釋分析，將所有的真菌序列鑒定為8個門、27個綱、54個目、108個科、168個屬。

2.2 醋醅樣品Alpha多樣性分析

稀釋曲線直接反映測序數據量的合理性，山西陳醋釀造過程中醋醅樣品的微生物測序稀釋曲線見圖1。山西陳醋釀造過程中醋醅樣品中微生物的Alpha多樣性指數結果見表2。

圖1 醋醅樣品中細菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b) in Cupei samples

表2 醋醅樣品中細菌和真菌群落Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal community in Cupei samples

由圖1可知，所有醋醅樣品的稀釋曲線漸近平坦并且Coverage指數均＞0.99，表明測序可以反映醋醅樣本中絕大多數微生物群落特征和多樣性信息。

多樣性指數包括Shannon指數和Simpson指數，用于表征微生物群落內物種分布的多樣性和均勻度。微生物群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數和Simpson指數越大。豐富度指數包括Chao1指數和ACE指數，用于估計微生物群落中包含的物種總數。微生物群落豐富度越高，Chao1指數和ACE指數越大。由表2可知，細菌群落的多樣性和豐富度變化趨勢一致，在酒精發酵第12天（AF12）有最高的豐富度和多樣性，隨著醋酸發酵的進行，多樣性和豐富度逐漸下降。真菌群落的多樣性和豐富度整體呈現逐漸增加的趨勢。除醋酸發酵第7天和第10天外（AAF7、AAF10），細菌群落的Shannon指數和Simpson指數高于真菌群落，而在整個發酵過程中細菌群落的Chao1指數和ACE指數均高于真菌群落，表明食醋釀造過程中細菌群落比真菌群落更具復雜性。

2.3 醋醅微生物群落結構分析

基于門水平醋醅中的細菌和真菌群落結構分析，結果見圖2。

圖2 基于門水平醋醅樣品中細菌（a）和真菌（b）群落結構分析Fig.2 Community structure analysis of bacterial (a) and fungal (b) in Cupei samples based on phylum level

由圖2a可知，山西陳醋釀造過程中硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacte ria）是主要的細菌門（平均相對豐度＞1%），平均相對豐度分別為60.68%、33.78%和3.18%。由圖2b可知，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是主要的真菌門，平均相對豐度分別為97.46%和1.58%。

基于屬水平醋醅中的細菌和真菌群落結構分析，結果見圖3。由圖3可知，山西陳醋釀造過程中有6個細菌屬和8個真菌屬的平均相對豐度＞1%，其中8個真菌屬均來自子囊菌門（Ascomycota）。與自然發酵的谷物醋類似[5，27-29]，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是優勢細菌屬，其平均相對豐度分別為36.06%和23.98%。其中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隨著發酵的進行相對豐度逐漸降低，在醋酸發酵第10天（AAF10）降低至5.33%。相反，醋酸桿菌屬（Acetobacter）的相對豐度隨著發酵的進行不斷增加，在醋酸發酵第10天（AAF10）增加至64.56%。此外，魏斯氏菌屬（Weissella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast也是食醋釀造過程的主要菌屬。unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast僅在醋酸發酵第1天（AAF1）具有較高的相對豐度，分別為23.62%和17.41%，表明其是在酒精發酵結束后，酒醅與輔料、老醅混合后引入的，并且不適應醋酸發酵環境導致相對豐度很快降低。

圖3 基于屬水平醋醅樣品中細菌（a）和真菌（b）群落結構分析Fig.3 Community structure analysis of bacterial (a) and fungal (b) in Cupei samples based on genus level

復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是醋醅中的優勢真菌屬，其平均相對豐度為49.75%。已有研究發現，鎮江香醋和山西老陳醋釀造過程中的優勢真菌屬是酵母菌屬（Saccharomyces）[27，29-30]，涼州熏醋釀造過程中的優勢真菌屬是鏈格孢屬（Alternaria）[8]，這些差異可能是由地理氣候、釀造原料和工藝等因素造成。此外，布氏白粉菌屬（Blumeria）、枝孢屬（Cladosporium）、明梭孢屬（Monographella）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、鏈格孢屬（Alternaria）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）也是食醋釀造過程中的主要真菌屬，平均相對豐度分別為8.74%、4.98%、4.84%、3.48%、1.98%和1.55%。

2.4 醋醅中微生物群落互作網絡分析

醋醅樣品中細菌、真菌群落的相關性網絡分析分別見圖4和圖5。

圖4 醋醅樣品中細菌群落的相關性網絡分析Fig.4 Correlation network analysis of bacterial community in Cupei samples

圖5 醋醅樣品中真菌群落的相關性網絡分析Fig.5 Correlation network analysis of fungal community in Cupei samples

由圖4可知，細菌互作網絡包括50個節點，182條邊，網絡密度為0.074，聚集系數為0.304，平均相鄰節點數為7.280，正相關關系占87.36%。細菌互作網絡中，48%的節點來自硬壁菌門（Firmicutes），36%的節點來自變形菌門（Proteobacteria），43.48%的拮抗作用來自醋酸桿菌屬（Acetobacter）。隸屬于變形菌門（Proteobacteria）的醋酸桿菌屬（Acetobacter）與硬壁菌門（Firmicutes）的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）具有顯著的拮抗性，這可能是由于醋酸桿菌屬（Acetobacter）代謝的乙酸逐漸積累抑制其他菌屬的生長。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）存在協同作用，unidentified_Mitochondria和unidentified_Chloroplast呈正相關。微生物之間的協同作用表明這些微生物在食醋釀造環境中有共同的營養和環境偏好，或通過代謝物交換形成相互依賴的模式。

由圖5可知，真菌互作網絡包括50個節點，246條邊，網絡密度為0.1，聚集系數為0.304，平均相鄰節點數9.84，以正相關關系占主導，占比達88.62%。根據以上結果推論，在食醋釀造過程中，微生物群落的互作以協同作用為主；真菌互作網絡具有更復雜的連接。真菌互作網絡中68%的節點來自子囊菌門（Ascomycota），30%的節點來自擔子菌門（Basidiomycota），57.14%的拮抗作用來自復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）與鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著負相關關系，枝孢屬（Cladosporium）與布氏白粉菌屬（Blumeria）、鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著正相關關系，酵母菌屬（Saccharomyces）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）存在協同作用。

3 結論

本研究基于高通量測序技術研究了山西陳醋釀造過程中醋醅微生物群落的結構以及互作網絡。結果表明，醋醅中細菌群落多樣性遠高于真菌群落。醋醅中優勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter），并且乳酸桿菌屬（Lactobacillus）隨著發酵的進行豐度逐漸降低，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）則相反。細菌互作網絡分析表明，醋酸桿菌屬（Acetobacter）貢獻了43.48%的拮抗作用，其中醋酸桿菌屬（Acetobacter）與乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）具有顯著的拮抗性；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）存在協同作用。醋醅中的優勢真菌屬為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。真菌互作網絡分析表明，57.14%的拮抗作用來自復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），并且復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）與鏈格孢屬（Alternaria）存在顯著負相關關系。本研究從共現網絡視角探究了山西陳醋釀造過程中的復雜微生物群落結構演替特征，并提出了可能的互作模式，既豐富了釀造微生物信息數據，也可為食醋釀造過程控制和開發復配醋曲提供重要的參考數據。