鼠李糖乳桿菌LP216高密度發酵培養基優化

李盼盼，張慶芳，劉春瑩，遲乃玉，

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）多存在于人和動物的腸道內[1]，具有增強腸道屏障以及調節腸道菌群組成[2]、降糖[3]、降膽固醇[4]、保護肝臟[5]、輔助降血脂[6]、抑制關節疼痛[7]、提高機體免疫應答等功能[8]。以固體或液體形式應用于人和動物，在功能性食品和飲料（乳制品、非乳制品飲料、嬰兒配方奶粉、谷物、肉類、面包）、膳食補充劑、飼料等領域應用廣泛[9]。

新型冠狀病毒導致人們的消費模式升級，并最終影響到消費者對飲食的需求。大多數消費者開始選擇含有營養增強劑的產品以提高免疫力，從而增加了對益生菌的需求。在美國，益生菌類產品2020年的銷量突然上升了33%。因此對益生菌進行高密度培養具有很高的科研和商業價值[10]。目前高密度培養菌株常用且最有效的方法依然是培養基發酵優化，常用的試驗方法有單因素試驗結合響應面法（response surface method，RSM）[11]。響應面法是通過建立連續變量曲面模型，對影響試驗指標的各因子水平及其交互作用進行優化和評價，可快速有效的確定多因子系統的最佳條件[12]。鄭柳青等[13]采用響應面優化法優化鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01培養條件，在最優條件下，菌體濃度達9.08×109CFU/mL。

本實驗室前期從西藏康馬鎮薩馬達鄉娟珊養殖區的健康耗牛乳和糞便中篩選得到一株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LP216。本研究對菌株LP216進行高密度培養，對MRS培養基成分的添加量進行單因素及響應面優化試驗，得到發酵培養基最佳添加量，旨在滿足鼠李糖LP216菌劑工業化生產需求，解決其產量不足等問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LP216：篩選自西藏康馬鎮薩馬達鄉娟珊養殖區的健康耗牛乳和糞便，保藏于遼寧省海洋微生物工程技術研究中心。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏（均為生化試劑）、乙酸鈉、硫酸鎂、葡萄糖、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸錳（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、乙酸鈉（CH3COONa）1.0 g/L、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2 g/L、吐溫80 1.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.0 g/L、硫酸錳（MnSO4）0.05 g/L、初始pH 6.5。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養基：MRS液體培養基中添加瓊脂粉25 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LTI-700恒溫培養箱：上海愛朗儀器有限公司；Multiskan GO酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；YXQ-LS-100S立式壓力蒸汽滅菌鍋：弗爾德（上海）儀器設備有限公司；SX-610 pH檢測筆：上海三信儀表廠；1510紫外可見分光光度計：北京昊諾斯科技有限公司；ZWY-21020恒溫振蕩搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株LP216種子液的制備

挑選一環活化好的固體培養基保藏的單菌落接種在液體MRS中，35 ℃、160 r/min振蕩培養24 h至光密度（optical density，OD600nm）值0.5～0.6，得到菌株LP216的種子液。

1.3.2 菌株LP216菌體密度和菌落總數檢測

按照比濁法測定菌體密度，以OD600nm值表示；稀釋瓊脂平板計數法測定菌落總數[11]。

1.3.3 菌株LP216高密度發酵培養基優化[14-16]

（1）培養基優化單因素試驗

蛋白胨添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；牛肉膏添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；酵母提取物添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；葡萄糖添加量分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L；CH3COONa添加量分別為3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L；吐溫80添加量分別為0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L；MgSO4·7H2O添加量分別為0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L；檸檬酸二銨添加量分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L；K2HPO4添加量分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L；MnSO4添加量分別為0、0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20g/L、0.25 g/L；接種量3%、溫度35 ℃條件靜置培養48 h，檢測菌體生長量（OD600nm值）。每組試驗重復3次。

（2）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗優化培養基的基礎上，設置N=20的10因素2水平Plackett-Burman（PB）試驗，PB試驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗結果選擇影響菌株LP216生長密度的3個主要因素，進行最陡爬坡試驗，每組試驗重復3次。

（4）Box-Behnken試驗設計

根據PB試驗和最陡爬坡試驗結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計，試驗設計見表2，每組試驗3個平行。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 菌株LP216生長曲線測定

菌株LP216生長曲線繪制：將待測鼠李糖乳桿菌LP216種子液轉接到裝液量為100 mL/250 mL MRS液體培養基中。搖勻后每支試管準確移入15 mL菌液，置于恒溫振蕩培養箱中按照優化后的發酵條件培養，每隔6 h取出一組試管測定其OD600nm值，稀釋平板法測定活菌數，進行3組平行試驗，繪制菌株LP216生長曲線。

1.3.5 數據處理

使用Graphpad prism軟件7.0進行單因素數據分析，Minitab 15軟件進行PB試驗設計和結果分析；Design-Expert 8.0.6軟件進行RSM試驗設計和結果分析。響應面數據分析通常采用二次多項式回歸模型。并且當滿足以下標準時模型是擬合和可靠的：①模型顯著（模型P值＜0.05），②失擬項不顯著（失擬項P值＞0.05），③決定系數R2＞0.9。

2 結果與分析

2.1 菌株LP216高密度發酵培養基優化單因素試驗

以MRS培養基為對照，對培養基10種成分的添加量進行優化，結果見圖1。

圖1 發酵培養基中各組分添加量對菌株LP216生長的影響Fig.1 Effect of each component addition in fermentation medium on the growth of strain LP216

氮源為細胞生長提供氨基酸合成所需的營養物質，其添加量會影響鼠李糖乳桿菌LP216的生長[17]。由圖1a可知，菌株LP216的生長量隨著蛋白胨添加量在0～15 g/L范圍內增加而增大；當蛋白胨添加量在15 g/L時，菌株LP216的生長量最大，OD600nm值為2.09；當蛋白胨添加量＞15 g/L之后，菌株LP216的生長量隨之下降。因此，蛋白胨最適添加量為15 g/L。

由圖1b可知，菌株LP216的生長量隨著牛肉膏添加量在0～5 g/L范圍內增加而增大；當牛肉膏添加量為5 g/L時，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為1.94；當牛肉膏添加量＞5 g/L之后，菌株LP216的生長量隨之下降。牛肉膏通過影響蛋白質的合成影響菌株的生長[9]，因此，牛肉膏最適添加量為5 g/L。

由圖1c可知，酵母提取物添加量在0～15 g/L時，菌株LP216的生長量隨之增加；酵母提取物添加量在15 g/L時，菌株LP216的生長量最大，OD600nm值為2.13；當酵母提取物添加量＞15 g/L之后，菌株LP216的生長量受到抑制。因為乳酸菌細胞酶系簡單[18]，酵母提取液過低時，營養物質不夠菌株生長利用，MRS培養基是一個復合氮源培養基，酵母提取液過高時，可能會影響菌株對其他氮源的利用。因此，酵母提取物最適添加量為15 g/L。

由圖1d可知，隨著葡萄糖添加量在10～25 g/L范圍內的增加，菌株LP216的生長量隨之增加；當葡萄糖添加量為25 g/L時，菌株LP216的生長量最大，OD600nm值為2.20；當葡萄糖添加量＞25 g/L之后，菌株LP216的生長量隨之下降。因為改變葡萄糖的添加量，會改變培養基的碳氮比[19]。培養基中碳氮比過低，菌株生長過快，會發生提前自溶的現象；碳氮比過高會使培養基過快酸化，從而導致菌體過早死亡，同樣不利于菌體LP216生長繁殖。因此，葡萄糖最適添加量為25 g/L。

由圖1e可知，菌株LP216生長量隨著CH3COONa添加量在3～4 g/L范圍內的增加而增大；當CH3COONa添加量為4 g/L時，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為1.95；當CH3COONa＞4 g/L之后，菌株LP216的生長量隨之下降。因此，CH3COONa的最適添加量為4 g/L。

由圖1f可知，菌株LP216的生長量隨著吐溫80添加量在0～1.5 g/L范圍內的增加而增大；當吐溫80添加量為1.5 g/L時，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為2.05；當吐溫80添加量＞1.5 g/L之后，菌株LP216生長量隨之下降。因為吐溫80作為親水的表面活性劑，其添加量改變會影響菌株對自身生長所需的營養物質的吸收。因此，吐溫80的最適添加量為1.5 g/L。

由圖1g可知，當MgSO4·7H2O添加量在0.10～0.25 g/L時，菌株LP216生長量隨之增長；當MgSO4·7H2O為0.25 g/L時，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為2.06；MgSO4·7H2O＞0.25 g/L之后，菌株LP216生長量隨之減小。因為適量Mg2+在發酵過程會被菌體利用促進細胞轉錄水平，過量時會抑制細胞轉錄水平從而抑制菌株的生長。因此，MgSO4·7H2O的最適添加量為0.25 g/L。

由圖1h可知，檸檬酸二胺添加量在1.0～2.0 g/L時，菌株LP216生長量隨之增加；當檸檬酸二胺添加量為2.0 g/L時，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為1.95；當檸檬酸二胺添加量＞2.0 g/L之后，菌株LP216生長量隨之下降。因為檸檬酸氫二胺為緩沖鹽，緩沖鹽與菌株LP216生長過程中產生的乳酸結合，生成乳酸鹽從而降低或消除乳酸對菌體生長繁殖的抑制作用[20]。因此，檸檬酸氫二胺的最適添加量為2.0 g/L。

由圖1i可知，當K2HPO4添加量為1～2 g/L時，菌株LP216生長量隨之增加；當K2HPO4添加量為2 g/L，菌株LP216生長量最大，OD600nm值為1.95；當K2HPO4添加量＞2 g/L之后，菌株LP216生長量隨之下降。乳酸菌發酵過程中產生某些有機酸（乳酸、乙酸等），發酵過程中pH值會逐漸降低。K2HPO4作為緩沖劑，可以在菌株發酵過程中調節培養基的pH，在發酵過程中維持適宜的pH對菌株的生長十分有利。因此，K2HPO4的最適添加量為2 g/L。

由圖1j可知，菌株LP216生長量隨著MnSO4的添加量在0～0.2 g/L范圍內增加而增大；當MnSO4添加量為0.2 g/L，菌體生長量最大，OD600nm值為2.2；當K2HPO4添加量＞0.2 g/L之后，菌株LP216生長量隨之下降。金屬離子會通過影響酶活性，進而影響細胞生長。因此，MnSO4的最適添加量為0.2 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗設計

根據表1影響細菌發酵的各因素和水平，采用Minitab 15軟件設置N=20的Plackett-Burman試驗，發酵48 h后測其OD600nm值，每組試驗3個平行，結果見表3，Plackett-Burman試驗回歸分析見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗回歸分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman experiments

續表

由表4可知，酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、MnSO4、吐溫80添加量對菌株LP216生長量的影響達到顯著水平（P＜0.05），其中酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖這3個因素的影響效果最為顯著，因此選這3個因素進行最陡爬坡試驗。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗可以快速確定最佳中心點，結果見表5。由表5可知，3個顯著影響因素的最佳組合因子在第3 組試驗附近，因此，以第3組的數據作為響應面試驗的中心點，即酵母提取物添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）、葡萄糖添加量（X3）分別為16 g/L、13 g/L、30 g/L。

2.4 響應面試驗優化設計

根據最陡爬坡試驗結果，運用Design-Expert.V8.0.5b軟件以酵母提取物添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）、葡萄糖添加量（X3）為自變量，以菌株LP216生長量（Y）為響應值，設計N=17的3因素3水平的響應面優化試驗，每組試驗重復3次，Box-Behnken試驗結果見表6，方差分析見表7。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表6試驗結果進行分析，得到二次多項回歸方程：

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

由表7可知，該回歸方程模型P＜0.01，表示對結果影響極顯著；失擬項P=0.135 3＞0.1證明該模型擬合較好，對本試驗的優化分析有意義[21-22]；回歸方程決定系數R2=0.969 5＞0.9，校正決定系數R2Adj=0.930 4＞0.9，信噪比＞4，說明試驗誤差較小，模型相關性較好[23-25]。該模型一次項X2、X3，交互項X2X3，二次項X22、X32對結果影響極顯著（P＜0.01）；交互項X1X2、X1X3對結果影響顯著（P＜0.05）。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

通過回歸方程分析，得到最佳酵母提取物添加量X1、蛋白胨添加量X2、葡萄糖添加量X3分別為16.25 g/L、13.42 g/L、30.28 g/L時，菌株LP216生長量理論OD600nm值為4.83。根據實際試驗操作情況，將最優培養基組分調整為酵母粉添加量16 g/L、蛋白胨添加量13 g/L、葡萄糖添加量30 g/L。在此最優培養基組分條件下，進行3組平行驗證試驗，菌株LP216生長量實際OD600nm值為4.85，與響應面優化試驗的理論值相近，證明該響應面優化模型可行。

2.5 菌株LP216生長曲線的測定

由圖2可知，優化培養基及發酵條件后菌株LP216，發酵時間0～18 h為延滯期，相比對照組優化前活菌數延滯期縮短了6 h；發酵時間18～32 h為指數增長期；發酵時間32～42 h為平穩期。在優化后培養基組分中培養42 h后，菌株LP216的最大菌體數達到8.9×109CFU/mL，是優化前活菌數的2.71倍，證明本試驗提高了發酵效率。

圖2 菌株LP216的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain LP216

3 結論

本研究通過對菌株LP21培養基組分進行單因素及響應面試驗優化培養基為酵母粉16 g/L、蛋白胨13 g/L、葡萄糖30 g/L、牛肉膏5 g/L、CH3COONa 4 g/L、吐溫80 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、檸檬酸二胺2.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、MnSO40.2 g/L在此優化條件下，菌株LP21活菌數達8.9×109CFU/mL，是未優化MRS培養基的2.71倍。本研究進行高密度菌株LP216發酵優化，提高了發酵效率，為后續的鼠李糖乳酸菌產品的工業化發展提供參考。