B族維生素對枯草芽孢桿菌發酵生產腺苷的影響

孫鵬杰，余子辰，徐慶陽

（天津科技大學 生物工程學院，天津 300450）

腺苷屬于嘌呤型核苷，又稱腺嘌呤核苷，其分子質量為267.23，分子式為C10H13N5O[1]；可以間接參與能量的轉移、信號轉導，此外還能合成藥物中間體，也能直接作為藥物作用于機體。腺苷的生產方法主要有化學合成法、核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）水解法和發酵法[2-3]；發酵法生產腺苷成本較低，原料易得，產腺苷效率較高，因此在腺苷生產中占據絕對優勢[4]。日本早在20世紀70年代就開始了腺苷發酵生產工藝技術的研究，并不斷取得技術上的突破，迄今已進入大規模工業生產階。腺苷作為藥物，也首先由日本于1989年投入美國市場，隨后又在法國、比利時、英國等多個國家獲得批準[5]。我國腺苷發酵生產起步較晚，目前主要利用化學法和酶法進行生產，但污染較大、成本較高，只有幾家公司可以利用直接發酵法進行腺苷的發酵生產。與國外相比，目前我國腺苷的發酵生產水平低，腺苷產量和轉化率都處在一個較低的水平[6]。

在利用發酵法生產腺苷中，培養基作為菌體生長及產物生成的全部能量來源，對發酵成功與否起著決定性的作用。蘇躍穩[7]通過對部分B族維生素添加量的優化，進而提高了L-蘇氨酸的產量；陳華強[8]通過優化檸檬酸鈉與次黃嘌呤的添加量進而使腺苷產量提高了39.46%。因此對現有培養基成分的分析以及其中關鍵物質的作用機理進行探索是提高發酵效率的又一關鍵途徑?，F有的腺苷發酵培養基存在產量較低、糖苷轉化率較低等問題，B族維生素作為菌體生長過程中關鍵的生長因子，是生物體內多種酶的輔酶，并且還是氫載體的合成前體[9-10]，適量的外源添加能極大地增強酶的活力，加快菌體生長，提高菌活力，還能一定程度的改善代謝流的流向，進而促進產量的增長。因此本實驗選用B族維生素作為優化目標，以達到改善現有培養基問題的目標。

本研究以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL為供試菌株，在原有培養基的基礎上，以常用的VB1、VB3、VB5、VB7、VB12為變量進行單因素試驗，并對VB1、VB3、VB5、VB7、VB12在腺苷生產中的功能及作用機理進行了探究，之后通過正交試驗對B族維生素的添加量進行優化，以腺苷產量、菌體量和糖苷轉化率為指標，最終確定了B族維生素的最佳添加配比。在此復合添加量的情況下，菌體量、腺苷產量和糖苷轉化率都得到了較高的提升，對其他核苷類生產菌株的B族維生素添加量提供了一定的參考，對培養基的改良提供了一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XGL（此菌株是經紫外誘變篩選得到的，是組氨酸和黃嘌呤缺陷型菌株）：天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國Thermo Fisher Oxoid公司；MnSO4·H2O（分析純）：天津市化學試劑六廠；MgSO4·7H2O（分析純）：天津市耀華化工廠；FeSO4·7H2O、葡萄糖（均為分析純）：天津化學試劑三廠；KH2PO4·3H2O（分析純）：天津塘沽化學試劑廠；黃嘌呤、組氨酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；VB1、VB3、VB5、VB7、VB12（≥98%）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基：參考文獻[3]。

種子培養基：葡萄糖25 g/L、豆濃20 mL/L、蛋白胨8 g/L、酵母粉5 g/L、玉米干粉25 g/L（121 ℃、30 min單獨滅菌）、KH2PO41.5g/L、MgSO4·7 H2O 0.4 g/L、VB11 mg/L、VH 1 mg/L、黃嘌呤0.1 g/L、組氨酸0.05 g/L。

初始發酵培養基：葡萄糖100 g/L、味精12 g/L、酵母粉1 g/L、蛋白胨0.3 g/L、K2HPO4·3H2O 0.6 g/L、CaCl20.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 10 mg/L、（NH4）2SO41 g/L、微量元素混合溶液[11]2%（V/V）。滅菌條件均為121℃，20min。

1.2 儀器與設備

SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；752紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；5 L自動控制發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent C18高效液相色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）：美國Agilent Technologies；CT88A全自動立式蒸汽滅菌器：馳通儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養方法

搖瓶培養：將菌種從甘油管中取兩環接種至斜面培養基中活化培養12 h，接兩環活化好的菌種至種子培養基中，培養12～14 h，之后接入2 mL至發酵培養基中；發酵條件[3]：pH維持在6.7，溫度維持在34 ℃，200 r/min培養46 h（期間用苯酚紅顯色劑顯示瓶內pH變化，用手動補加氨水的方法維持瓶內pH）。

5L發酵罐培養：按20%的接種量將種子液接種至發酵培養基中進行發酵培養，發酵初期pH維持在6.7～7.0，發酵中后期pH維持在6.4～6.7，溫度維持在34 ℃左右，溶氧維持在30%～50%之間。培養過程中通過流加80%葡萄糖溶液維持發酵46 h（發酵過程中每2 h取一次樣，發酵過程中通過利用蠕動泵流加氨水的方法來維持pH）。

1.3.2 試驗方法

（1）VB1、VB3、VB5、VB7、VB12添加量優化單因素試驗

在培養基其他成分不變的情況下（VB1、VB3、VB5、VB12的原始添加量為5mg/L，VB7的原始添加量為2mg/L），分別控制VB1、VB3、VB5、VB12的添加量為0、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L進行培養基組成優化單因素發酵試驗；VB7的添加量分別控制為0、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L進行培養基組成優化的單因素試驗，以探究不同B族維生素對腺苷產量、轉化率、OD600nm值的影響。

（2）VB1、VB3、VB5、VB7、VB12添加量優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設置L16（45）的正交試驗設計，以探究VB1、VB3、VB5、VB7、VB12的最佳添加量及試驗組合，正交試驗因素與水平見表1。

表1 B族維生素添加量優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for vitamin B addition optimization

1.3.3 指標檢測方法

發酵過程中pH、溶氧、溫度檢測方法：發酵過程中的pH、溶氧、溫度通過發酵罐的智能檢測系統實時檢測，并通過pH試紙進行pH的輔助檢測，進而進行手動調控，已實現更為精準的發酵過程控制；搖瓶通過苯酚紅顯色劑進行pH監測，并通過手動補充氨水進行調節。

菌體量測定方法：發酵過程中每2 h取一次樣，取樣稀釋一定倍數之后，在波長600 nm處測定吸光度值。

發酵過程中殘糖含量測定[11]：取發酵液1mL，13000r/min離心2 min，將上清稀釋一定倍數后，利用SBA生物傳感儀測定發酵液中糖含量。

腺苷產量測定：用100 mL容量瓶加入適當去離子水，然后加入1 mL發酵液，最后加入NaOH（1 mol/L）2 mL，之后定容、13 000 r/min離心過膜。高效液相色譜測定條件[12-13]：柱溫30 ℃，檢測波長259 nm，流動相總流量0.8 mL/min，流動相為10%的乙腈，色譜柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）[3]。

1.3.4 糖苷轉化率的計算

糖苷轉化率的計算公式如下：

式中：m為腺苷質量濃度，g/L；V為發酵液體積，L；M為添加糖的總量，g。

1.3.5 數據處理

文中圖表均使用Origin9.5軟件繪制，正交試驗與數據均使用Minitab 19.0 statistical software軟件設計、處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 VB1添加量優化

由圖1可知，腺苷產量和糖苷轉化率受VB1的影響較大，在不外源添加VB1的情況下腺苷產量僅有17.48 g/L，但隨著VB1添加量的增多，腺苷產量和糖苷轉化率有明顯的增長，并且添加量為6 mg/L時腺苷產量和糖苷轉化率分別達到了21.86 g/L、22.31%，較不外源添加VB1分別提高了25.05%和8.46%，較原始培養基分別提高了13.73%和20.7%，但隨著VB1添加量增長至8 mg/L時，腺苷產量和轉化率都出現了下降的情況；VB1也會對菌體生物量造成一定的影響，在不添加VB1時OD600nm值僅有30.9，但當添加量為2 mg/L時，OD600nm值增長至36.2，較不添加增長了17.15%，之后隨著添加量的增多，菌體生物量變化較小。VB1又稱硫胺素，是氨基酸和碳水化合物代謝途徑中必不可少的輔助因子[14-15]，是很多關鍵酶的輔酶，若添加量過多會造成這些酶的活性被極大地加強，從而造成更多的代謝流流入三羧酸循環，造成磷酸戊糖途徑代謝流的減弱，造成腺苷產量和轉化率的下降[16]，因此當VB1添加量＞6 mg/L時，腺苷產量和轉化率出現了下降的現象。故選擇VB1的最佳添加量為6 mg/L。

圖1 不同VB1添加量對腺苷產量、糖苷轉化率和菌體生物量的影響Fig.1 Effect of different VB1 addition on adenosine yield,glycoside conversion rate and bacterial biomass

2.1.2 VB3添加量優化

由圖2可知，隨著VB3添加量的增長，腺苷產量和轉化率均有一定的增長，并在6 mg/L處產量和轉化率分別達到了22.1 g/L、22.79%，較不添加分別提高了20.23%和4.16%，較原始培養基分別增長了14.9%和23.3%，但隨著添加量的再一次增加，腺苷產量和轉化率均出現了明顯的下降趨勢；VB3對菌體的生長具有一定的促進作用，在外源添加0～2 mg/L時，菌體生物量增長明顯，之后隨著添加量的增長，菌體生物量趨于穩定；VB3作為輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的重要組成部分，在細胞生命活動中參與細胞內的氧化過程、起著氫傳遞的作用，同時他還具有維持細胞的滲透壓、促進細胞氧化呼吸的作用[17-18]，對菌體的生長具有一定的促進作用，當添加2 mg/L的VB3時菌體生物量出現了較強的增長，但腺苷產量和轉化率出現了下降，可能是此時菌體的代謝更多的用在了菌體生長，因此造成產量和轉化率出現了一定的下滑；VB3還參與蛋白質氨基酸和嘌呤的代謝，對腺苷的產量具有極大促進作用，同時煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）是線粒體三羧酸循環中三種限速酶的共同因子，并且NADH是電子傳遞鏈的主要電子供體[19-20]，VB3的添加量過多會也導致菌體的代謝流流向三羧酸循環，從而造成產量的轉化率的下降。故選擇VB3的最佳添加量為6 mg/L。

圖2 不同VB3添加量對腺苷產量、糖苷轉化率和菌體生物量的影響Fig.2 Effect of different VB3 addition on adenosine production,glycoside conversion rate and bacterial biomass

2.1.3 VB5添加量優化

由圖3可知，VB5的添加量對腺苷的產量有著較為明顯的影響，在一定的范圍內，隨著VB5添加量的增加，腺苷產量增長明顯，并且在添加量為6 mg/L時產量和轉化率達到了最高，分別為20.82 g/L、22.39%，較不添加VB5分別提高了20.21%、22.82%，且較原始培養基的產量和轉化率分別增長了8.3%、21.1%，當VB5添加量增長至8 mg/L時，產量和轉化率都出現了下降的情況；同樣，在不添加VB5時OD600nm值僅有32.2，當外源添加2 mg/L的VB5時，OD600nm值增長到了34.3，如果再增加添加量，菌體生物量會穩定增長，不再有較強的波動。分析可知，VB5是NAD、NADH2和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、NADPH2的生物合成原料，是生物氧化過稱中的最重要的氫載體，還可作為氫受體和氫供體，起著傳遞氫的作用，此外，還能參與糖代謝以及部分氨基酸的代謝[21]，對菌體生長具有一定的促進作用；由于VB3和VB5的功能主要與NAD、NADH等的生成有關，在對腺苷產量的影響上基本類似。故選擇VB5的最佳添加量為6 mg/L。

圖3 不同VB5添加量對腺苷產量、糖苷轉化率和菌體生物量的影響Fig.3 Effect of different VB5 addition on adenosine yield,glycoside conversion rate and bacterial biomass

2.1.4 VB7添加量優化

由圖4可知，在不添加VB7的情況下，腺苷產量和轉化率僅有14.32 g/L、15.56%，但是在添加一定量的VB7時，腺苷的產量和轉化率會有顯著的提高，在外源添加2 mg/L的VB7時，腺苷產量和轉化率分別達到了19.23 g/L、20.01%，產量和轉化率較不添加VB7分別提高了34.29%、28.60%，當添加量再次提高時，產量和轉化率都會出現下降的趨勢；OD600nm值會隨著VB7添加量的增長有一定的增長，在添加4 mg/L的VB7時，OD600nm值達到了38.9，為本批實驗的最高，較不外源添加VB7增長了11.46%。

圖4 不同VB7添加量對腺苷產量、糖苷轉化率和菌體生物量的影響Fig.4 Effect of different VB7 addition on adenosine yield,glycoside conversion rate and bacterial biomass

分析可知，由于VB7是細菌細胞內關鍵的輔助因子，是菌體內多種酶的輔酶[22]，尤其是乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶等關鍵酶的輔酶，并且它還參與菌體細胞膜的生成、CO2的固定等，當其添加量增加時，乙酰輔酶A的活性得到增強，三羧酸循環也因此得到了加強，進而促進菌體的生長；但添加量過多會造成三羧酸循環被極大地加強，進而導致腺苷的產量和轉化率出現下降的情況，所以當VB7添加量達到＞2 mg/L時，菌體生物量依舊增長，但腺苷產量和糖苷轉化率卻下降了。故選擇VB7的最佳添加量為2 mg/L。

2.1.5 VB12添加量優化

由圖5可知，VB12對腺苷的產量有著極大的促進作用，在不外源添加VB12的情況下僅有17.33 g/L的產量，但隨著VB12添加量的增長，腺苷產量有著一定程度的增長，在6mg/L的添加量下腺苷產量達到了21.92 g/L，較不添加VB12增長了26.49%，如果再增加添加量，則會出現產量下降的情況；同時，轉化率會隨著VB12添加量的增長持續增長，在0～6 mg/L的VB12梯度添加條件下，轉化率從18.44%持續增長到了21.63%；VB12對菌體生物量影響較大，在不外源添加VB12時菌體生物量僅有34.2，隨著添加量的增多，OD600nm值會出現穩步提升，在6 mg/L時達到了40.6，為本批實驗的最高，較不外源添加增長了18.71%。

圖5 不同VB12添加量對腺苷產量、糖苷轉化率和菌體生物量的影響Fig.5 Effect of different VB12 addition on adenosine yield,glycoside conversion rate and bacterial biomass

分析可知，VB12是代謝酶不可或缺的輔助因子[23]，VB12在細菌細胞內主要以輔酶的形式參與一碳單位的轉移，并且能參與細胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的合成、碳水化合物的代謝以及細胞生物質的合成，在添加一定量的VB12后菌體量得到了明顯的提升，腺苷的產量也隨之上升，此外VB12分子中還含有Co2+，在VB12添加量過高時，甲基丙二酰CoA異構酶活性被極大地提高，三羧酸循環被加強，相應的，磷酸戊糖途徑被減弱，從而造成腺苷產量下降[24-25]。故選取VB12最佳添加量為6 mg/L。

2.2 B族維生素添加量優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以腺苷產量、菌體生物量和糖苷轉化率作為考察指標，根據表1的試驗方案設置L16（45）的正交試驗，試驗結果及分析見表2，方差分析結果見表3。

表2 B族維生素添加量優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for vitamin B addition optimization

由表2可知，影響發酵過程中腺苷產量大小的5個因素依次為D＞B＞A＞E＞C，最佳添加量組合為A3B2C3D4E3，即VB16 mg/L、VB35.6 mg/L、VB56 mg/L、VB72.4 mg/L、VB126 mg/L；影響糖苷轉化率大小的5個因素依次為D＞B＞C＞E＞A，最佳添加量組合為A2B4C1D4E3，即VB15.6 mg/L，VB36.4 mg/L，VB55.2 mg/L，VB72.4 mg/L，VB126 mg/L；影響菌體生物量（OD600nm值）大小的5個因素依次為E＞A＞D＞B=C，最佳添加量組合為A3B2C3D3E4，即VB16 mg/L，VB35.6 mg/L，VB56 mg/L，VB72 mg/L，VB126.4 mg/L。

由表3可知，VB7對腺苷產量和糖苷轉化率影響最顯著（P＜0.05），VB12對發酵過程中的菌體生物量影響最顯著（P＜0.05）。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiments results

綜上所述，同時腺苷產量和糖苷轉化率達到本組試驗的較高水平，而且需要滿足一定菌體量的情況下，因此選擇最佳添加組合A3B1C3D4E2，即VB16 mg/L，VB35.2 mg/L，VB56.0 mg/L，VB72.4 mg/L，VB125.6 mg/L。此時腺苷產量為23.11 g/L，糖苷轉化率為32.55%，菌體生物量為40.2。

2.3 5 L發酵罐驗證試驗

在正交試驗中選出對腺苷產量和轉化率影響最顯著的試驗組，在培養基其他成分不變和發酵條件不變的情況下，改變其VB1、VB3、VB5、VB7、VB12的添加量分別為6 mg/L、5.2 mg/L、6 mg/L、2.4 mg/L、5.6 mg/L，進行5 L發酵罐發酵放大試驗，進一步探究其發酵特性（腺苷產量從10 h起開始測量），結果見圖6和圖7。

圖6 優化培養基與原始培養基在5 L發酵罐中的發酵結果對比Fig.6 Comparison of fermentation results between optimized culture medium and original culture medium in 5 L fermenter

圖7 枯草芽孢桿菌在優化培養基5 L發酵罐中的腺苷產量、糖苷轉化率以及菌體生物量Fig.7 The adenosine production,glycoside conversion rate and bacterial biomass of Bacillus subtilis in 5 L fermenter under the optimized medium

由圖6、圖7可知，改變其培養基中的維生素B族生長因子的添加量，對腺苷的產量、糖苷轉化率以及OD600nm值都有不同程度的提升。在整體發酵過程中，優化后的培養基菌體生長速率較原始培養基菌體生長速率增加較大，在前10 h更為明顯，并且在46 h時OD600nm值達到了74.84，較原始培養基提高了8%；并且對腺苷產量由一定的提升，在35 h之前，腺苷產量增加趨勢較為明顯，并且在發酵46 h時產量達到了53.66 g/L，較原始培養基增長了19.35%；同時轉化率也得到了一定提升，達到30.10%，較原培養基提高了12.59%。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗得出最有益于菌體產苷的VB1、VB3、VB5、VB7、VB12的添加量，即VB16 mg/L、VB35.2 mg/L、VB56 mg/L、VB76.4 mg/L、VB125.6 mg/L。最后通過5 L發酵罐與原培養基作對比實驗，對比發現優化后的培養基菌體生物量、腺苷產量、糖苷轉化率分別為74.84、53.66 g/L，30.10%，比優化前分別提高了8%、19.35%、12.59%。本研究所得的腺苷發酵培養基與原培養基相比產量、轉化率和菌體生物量有了不同程度的提升，另外培養基是否可以通過外源添加某種氨基酸或微量元素來進一步提高菌體活力、提高發酵效率，有待于更多的研究探索。