不同儲藏期濃香型白酒大曲的微生物多樣性分析

劉延波，王琳琳，金尚萍，韓素娜，王 賢，孫西玉，張立新，潘春梅

（1.河南大學 生命科學學院，河南 開封 475004；2.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院（酒業學院），河南 鄭州 450046；3.河南仰韶酒業有限公司博士后創新實踐基地，河南 三門峽 472400；4.河南牧業經濟學院河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；5.河南牧業經濟學院 鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；6.賒店老酒股份有限公司，河南 南陽 473300；7.河南張弓老酒酒業有限公司，河南 商丘 476733）

大曲是以小麥（或配有大麥、豌豆）為主要原料，自然接種網羅環境微生物，在人工控制的溫度和濕度下培育而成[1]。大曲作為富含多酶多菌的微生物發酵制劑，在白酒的釀造過程中起著糖化、生香、發酵、提供菌源的作用，故釀酒行業素有“曲為酒之骨”之說[2-3]。

大曲中含有大量的微生物，主要包括細菌、霉菌和酵母菌，是白酒發酵生產過程中的關鍵基礎微生物[4]。霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，能夠分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質，經過一系列復雜的生化反應產生種類眾多的芳香類物質[5]，為后續酒體風味的形成奠定基礎[6]；酵母菌主要包括產酒酵母和產酯酵母，產酒酵母多屬于釀酒酵母屬，主要影響產酒率，為白酒發酵提供動力[7]，產酯酵母具有產酯能力，能夠增加酒體的酯含量，賦予酒舒適的香氣[8-9]。細菌種類繁多，補充并豐富了霉菌的酶系，是產生有機酸、酯類、酮類等風味物質和酚、黃酮等功能活性物質的主要貢獻者[5]。不同的微生物各司其職，對白酒的釀造也起著不同的作用。

近年來，關于微生物群落多樣性的研究很多，大多采用傳統可培養方法、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）克隆文庫，其中利用傳統方法分離到的微生物在種類和數量上有限[10]；PCR-DGGE、DNA克隆文庫等方法存在測序量有限、工作量大、靈敏度不高，且僅對群落中主要成分比較敏感等缺陷[11]，而高通量測序技術具有測序時間短、測序通量高的優勢，為準確揭示微生物菌群的多樣性提供了強有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[12]，因此，已被廣泛用于分析釀酒微生物的群落組成[13-14]。

培養成熟的新鮮大曲需經一段時間的儲存才能投入使用[15]，儲存期間發生多種生化反應，使得微生物區系結構、酶系結構、物系結構都會發生重大變化，是重要的后熟過程[16]。適當的儲存對于大曲的質量提升有著極其重要的作用[17]；但儲存期過長，容易導致曲蟲危害，增加損耗和庫存成本[18-19]。在實際生產中，大曲儲存時間都是憑借經驗進行操作的，具有一定風險。目前，對于大曲不同儲藏期的微生物多樣性研究較少，因此，本研究利用Illumina Miseq高通量測序技術對不同儲藏期賒店老酒大曲的微生物群落多樣性進行分析，解析儲藏過程中不同微生物的群落組成及差異，完善濃香型白酒大曲微生物數據庫，為改善大曲儲藏時間以提高后續白酒釀造工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：河南賒店老酒股份有限公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil：美國MP Biomedicals公司；產物回收試劑盒：天根生化科技有限公司；Trans DNA 15Kmarker、DNA聚合酶AP221-02：北京全式金生物技術公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合液、真菌擴增引物SSU0817F和1196R、細菌擴增引物338F和806R：美吉生物醫藥科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

Julabo TW12恒溫水浴鍋：優萊博技術（北京）有限公司；Nano Drop 2000紫外可見分光光度計、ST16R高速冷凍離心機、PICO17小型臺式離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GeneAmp 9700型PCR儀：美國ABI公司；Quanti Fluor-ST DNA定量儀：美國Promega公司；Illumina Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

3月齡（A）、6月齡（B）、9月齡（C）三個儲藏時期的大曲分別按堆垛層的上中下取3個平行樣本進行五點取樣，粉碎混勻后，做好標記，用無菌袋密封-20 ℃保存備用。

1.3.2 大曲微生物總DNA提取及PCR擴增

根據Fast DNA SPIN Kit for Soil說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

以提取的總DNA為模板，采用SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）、1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）為引物對真菌的18S rDNA基因序列進行PCR擴增，采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）為引物對細菌的V3～V4可變區基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系均為：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，正向引物（5μmol/L）0.8μL，反向引物（5μmol/L）0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，補加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，檢測合格后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR擴增產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。

1.3.3 高通量測序與數據分析

文庫的建立和高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用Flash軟件進行拼接；使用的Uparse軟件，根據序列相似度＞97%進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[20]聚類；使用Uchime軟件剔除嵌合體。利用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%。基于OTU聚類分析，通過Mothur（v1.30.2）軟件計算每個樣品的α多樣性指數，包括Shannon指數、Simpson指數、Chao 1指數等反映酒曲樣品中的微生物菌群的豐富度和多樣性[20]。

2 結果與分析

2.1 不同儲藏期濃香型白酒大曲高通量測序及α多樣性分析結果

Illumina Miseq高通量測序結果通過質控和過濾后得到優質序列，根據序列相似度＞97%聚類得到OTU數，并對測序結果進行α多樣性分析，結果見表1。

表1 濃香型白酒大曲高通量測序及α多樣性分析結果Table 1 Results of high-throughput sequencing and α diversity analysis of strong-flavor Baijiu Daqu

由表1可知，從3個大曲樣品共獲得細菌優質序列172385條，平均堿基長度為443 bp；共獲得真菌優質序列110 385條，平均堿基長度為401 bp。將所有序列按照97%的相似性進行OTU聚類分析，在聚類過程中去除嵌合體，共得到了605個細菌OTU和26個真菌OTU。儲藏期不同，OTU數目也有所不同。α多樣性分析是用來表征某個特殊區域或者生態環境中的物種多樣性，常包括香農（Shannon）指數、辛普森（Simpson）指數和超1（Chao 1）指數等[20]。其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高，Chao 1指數常用來估計物種總數，其值越大，物種豐富度越高，而Simpson指數值越大，其物種多樣性越低[21]。由表1亦可知，6月齡大曲樣品的Shannon指數、Chao 1指數均達到最大值，而Simpson指數處于最小值，說明6月齡大曲樣品的群落多樣性和物種豐富度最高。為考察本次試驗取樣及測序深度合理，繪制濃香型白酒大曲樣品細菌及真菌微生物的Shannon指數曲線，結果見圖1。

圖1 濃香型白酒大曲樣品的Shannon指數曲線Fig.1 Shannon index curve of strong-flavor Baijiu Daqu samples

由圖1可知，各個樣品隨著測序數量的增加，其Shannon指數稀釋曲線趨于平坦，且表1中的Coverage指數均＞0.99，由此可知本次試驗取樣及測序深度合理，結果能夠代表所有樣本微生物的真實菌群情況。

2.2 OTU分布的Venn圖

Venn圖可以用來統計多個樣本中所共有和獨有的物種數目，可以比較直觀的表現樣本在OTU水平上的組成相似性及重疊性，不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品OTU的Venn圖見圖2。

圖2 不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品OTU的Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU of strong-flavor Baijiu Daqu samples in different storage periods

由圖2可知，從3個大曲樣品中共獲得605個細菌，其中共有的OTU數目為58個，占OTU總數的9.5%，3月齡與6月齡獨有的OTU數目均接近其總OTU半數，而9月齡獨有的OTU數目較少；共獲得26個真菌OTU，其中共有的OTU數目為14個，占OTU總數的54%，即所代表的真菌物種長期存在于不同儲藏期的大曲中。通過Venn圖可以看出，不同儲藏期的大曲所含有的微生物種類存在差異性。

2.3 不同儲藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結構分析

2.3.1 基于門水平不同儲藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結構分析

基于門水平不同儲藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結構分析結果見圖3。

圖3 基于門水平不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品細菌及真菌菌群結構分析結果Fig.3 Analysis result of bacteria and fungi community structure in strong-flavor Baijiu Daqu samples at different storage periods based on phylum level

由圖3可知，在門水平上細菌門主要有厚壁菌門（Fimicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），其中3月齡大曲樣品的優勢細菌門（相對豐度＞1%）有厚壁菌門（62.66%）、變形菌門（27.15%）；6月齡大曲樣品的優勢細菌門有厚壁菌門（63.53%）、變形菌門（15.26%）、擬桿菌門（14.87%）；9月齡大曲樣品的優勢細菌門有變形菌門（80.86%）和厚壁菌門（17.39%）；變形菌門在大曲儲存過程中相對豐度先下降后上升，在后期達到絕對優勢。在門水平上，3月齡、6月齡、9月齡大曲樣品的優勢真菌門（相對豐度＞1%）均為子囊菌門（Ascomycota），且3個樣品中子囊菌門比例均達到99%。

2.3.2 基于屬水平不同儲藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結構分析

基于屬水平不同儲藏期濃香型白酒大曲微生物菌群結構分析結果見圖4。

由圖4可知，在屬水平上3月齡大曲樣品所含優勢細菌屬（相對豐度＞1%）有10個，分別為乳球菌屬（Lactococcus）（27.90%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（23.14%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（14.81%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（7.12%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（2.32%）、片球菌屬（Pediococcus）（1.97%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（1.61%）、norank_c_Cyanobacteria（1.48%）、腸球菌屬（Enterococcus）（1.48%）、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group（1.00%）。6月齡大曲樣品所含優勢細菌屬有8個，分別為unclassified_f_Peptostreptococcaceae（24.64%）、Escherichia-Shigella（11.80%）、土孢桿菌屬（Terrisporobacter）（6.47%）、Clostridium_sensu_stricto_1（5.68%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（4.61%）、norank_f_Bac teroidales_S24-7_group（3.65%）、Ruminococcaceae_UCG-005（2.88%）、Rikenellaceae_RC9_gut_group（2.63%）。9月齡大曲樣品所含優勢細菌屬有4個，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）（79.80%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（6.32%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（4.59%）、片球菌屬（Pediococcus）（1.59%）。土孢桿菌屬、Clostridiumsensu stricto 1、Ruminococcaceae UCG-005只在6月齡大曲中為優勢細菌屬，在3月齡和9月齡大曲中為非優勢細菌屬。

圖4 基于屬水平不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品細菌及真菌菌群結構分析結果Fig.4 Analysis results of bacteria and fungi community structure in strong-flavor Baijiu Daqu samples at different storage periods based on genus level

從不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品的細菌群落結構分析，3月齡和9月齡大曲樣品在屬水平上絕大多數為產乳酸的菌屬，如乳酸桿菌、乳酸球菌、魏斯氏菌屬和腸桿菌屬，此類菌屬在發酵過程中產生的乳酸與乙醇被酯化形成乳酸乙酯，但乳酸乙酯含量過多會造成酒體香味不協調[15-16]，6月齡大曲獨有的菌屬Terrisporobacter、Clostridium_sensu_stricto_1、Ruminococcaceae_UCG-005為己酸菌，己酸菌的代謝產物己酸乙酯是構成濃香型白酒的主體香味物質。3月齡大曲中的乳酸桿菌、乳酸球菌、魏斯氏菌屬均屬于乳酸菌[17]。在白酒釀造過程中，乳酸菌可發酵碳水化合物產生大量乳酸，過量乳酸會造成白酒口感酸澀，影響酒質，且在酸性環境易形成生物胺[18]，人體攝入過量的生物胺會對機體造成不良反應[19]。6月齡大曲樣品中的Clostridium_sensu_stricto_1屬于梭菌綱，梭菌綱微生物是濃香型白酒釀造中主要的己酸菌[20]；Terrisporobacter、Ruminococcaceae_UCG-005也是能產己酸的己酸菌[15]。9月齡大曲樣品中的腸桿菌屬可發酵糖類產生乳酸[21]，且也是大曲中可產生物胺的細菌[22]。

由圖4亦可知，在屬水平上3個大曲樣品中共檢測出6個優勢真菌屬（平均相對豐度＞1%），分別為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、耐堿酵母屬（Galactomyces）、Arachniotus。3月齡大曲樣品含有5個優勢真菌屬，分別為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（51.18%）、畢赤酵母屬（Pichia）（22.14%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（17.79%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（5.33%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（2.54%）；6月齡大曲樣品所含優勢菌屬類型與3月齡大曲樣品相同，但占比不同，即復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（34.27%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（30.27%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（17.80%）、畢赤酵母屬（Pichia）（15.70%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（1.06%）；9月齡大曲樣品含有6個優勢真菌屬，分別為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（67.94%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoas cus）（15.69%）、畢赤酵母屬（Pichia）（7.30%）、曲霉菌屬（As pergillus）（4.91%）、Arachniotus（1.67%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（1.16%）。

從不同儲藏期濃香型白酒大曲樣品的真菌群落結構分析，3、6、9月齡大曲樣品的真菌群落組成相差不大，但組成比例差異明顯，6月齡大曲的嗜熱子囊菌屬和曲霉菌屬占比均高于其他月齡的大曲。曲霉菌屬能夠產生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶、果膠酶、纖維素酶和單寧酶，在白酒的釀造過程中主要作用于發酵的前期，是白酒發酵原料中淀粉等大分子物質的主要動力之一，為發酵持續進行和風味物質形成發揮著重要作用[23]。嗜熱子囊菌屬具有良好的酶分泌特性，產纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶類，并具有良好的熱穩定性，能夠在白酒發酵過程中溫度較高的條件下保持穩定的催化效率[24]，在后續的堆積糖化發酵以及對風味的形成起著重要的作用[5]，有利于大曲產酒生香。畢赤酵母屬具有較強產酯功能，能夠利用發酵環境中的糖類、氨基酸、蛋白質等物質[25]，生成大量酯類風味物質，是白酒釀造中一類重要的功能微生物[26]。復膜孢酵母屬能夠分泌淀粉酶在內的多種水解酶[27]，是成品曲中酶類的重要產生菌，同時具有較好的產酒和產酯能力[28]。

隨著大曲儲藏時間的延長，不僅會影響多種微生物的相對豐度及產酶特性，還會增加庫存成本，故從微生物的富集、平衡角度及菌屬特性分析，建議儲存期為6個月的濃香型大曲更適合投入后續白酒釀造生產。梁麗文等[18]選取白云邊酒不同儲存期的高溫大曲為研究對象，從微生物數量、細菌種類、發酵力和糖化力等方面的變化規律進行分析，結果表明大曲儲存6月為宜；梁晨等[29]利用高通量測序剖析0～6月份大曲成熟過程中原核微生物群落結構及風味成分的變化規律，得到大曲貯存4～6個月更有利于白酒的釀造；劉雪等[17]通過研究濃香型中高溫大曲的理化指標和微生物種類及數量隨儲存期延長的變化規律，得出大曲要儲存3～5個月方能投入生產。本研究結果與以上研究基本一致。

此外，本研究首次從濃香型白酒大曲中檢測出的菌屬有耐堿酵母屬、Arachniotus、norank_c_Cyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢桿菌屬、norank_f_Bacteroidales_S24-7_group、Ruminococcaceae_UCG-005、Rikenellaceae_RC9_gut_group。HU Z等[30]采用高通量測序技術分析青貯玉米秸稈，在屬水平上檢測出norank_c_Cyanobacteria；戴奕杰等[31]在醬香型白酒大曲檢測到Escherichia-Shigella等為優勢菌屬；栗連會等[32]在瀘型酒酒醅中發現土孢桿菌屬；LI T等[33]利用高通量測序技術在小鼠腸道中檢測到norank_f_Bacteroidales_S24-7_group；BAY V等[34]利用高通量測序技術在奶牛爪角中檢測到Ruminococcaceae_UCG-005和Rikenellaceae_RC9_gut_group這兩種微生物。部分菌屬已證實存在于釀酒過程中，但其生長機制與代謝機制的研究仍然滯后，在濃香型白酒釀造中，上述菌屬的功能仍有待進一步研究。

3 結論

本研究采用高通量測序技術對不同儲藏期賒店老酒濃香型白酒大曲的微生物群落結構進行分析，結果表明，從3個儲藏時期大曲樣品中共發現26個細菌屬和13個真菌屬，其中共有的優勢細菌屬為乳球菌屬（Lactococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）；共有的優勢真菌屬為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、耐堿酵母屬（Galactomyces）；不同儲存期大曲樣品群落組成相似，但其優勢菌群的相對豐度差異明顯。從微生物的菌屬特性、平衡角度分析，儲存期為6月的大曲更適合投入白酒生產。

此外，首次從濃香型白酒大曲中發現耐堿酵母屬、Arachniotus、norankcCyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢桿菌屬、norank f Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcaceae UCG-005和Rikenellaceae RC9 gut group。進一步揭示了大曲儲存過程中微生物的多樣性及群落結構變化，在此基礎上建議了大曲的最佳儲存時間，對后續大曲出庫投入白酒釀造的合理儲存時間具有一定的科學指導意義，有利于大曲質量的提高。