黑曲霉全豆腐乳的制備及其營養特性研究

孫 睿，呂 博，朱世杰，付洪玲，李佳芯，秦續緣，季 雷，孟祥澤，楊曉晴，于寒松

（1.吉林農業大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.國家大豆產業技術體系加工研究室，吉林 長春 130118；3.東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；4.長春朱老六食品股份有限公司，吉林 長春 130507）

腐乳又名豆腐乳，霉腐乳等，是一種利用微生物法改變植物蛋白風味的傳統大豆發酵制品，至今已有一千多年歷史，因其口感鮮美，營養豐富，物美價廉，受到廣大群眾喜愛，是一種常見的調味品[1]。目前，腐乳生產主要集中在中國、日本、韓國及東南亞一帶。在制作腐乳方法上主要以傳統腐乳制作工藝為主，制作過程中棄去豆渣，這種方法導致產品出品率低，不僅降低企業利潤，還增加了企業處理豆渣的成本，且豆渣含水量高，如不及時處理極易變質，導致環境污染。然而豆渣不僅并非工業廢物，還具有較高的營養價值和食用價值，其蛋白質含量為22.56%，脂肪含量為19.70%，碳水化合物含量為37.99%，纖維素含量為14.62%[2]，有關研究稱豆渣可作為人體抗氧化的潛在資源，其水解物在體外表現出更強的抗氧化性，在體內測試時，增強了免疫調節活性。但豆渣直接利用其營養價值并不高且口感粗糙，因此對豆渣改性是提高豆渣價值的重要步驟。

目前，豆渣改性主要是機械法、生物發酵法和水解法等，其中生物發酵法成本最低，產率最高，并能有效提高豆渣中營養成分，降解的豆渣降低了不適口的渣感，提高了消化率。李艷芳等[3]用黑曲霉和米曲霉復合發酵豆渣，改善了豆渣粗糙的口感。莫重文等[4]用米曲霉、黑曲霉和釀酒酵母混合菌進行豆渣發酵，利用霉菌降解豆渣中的纖維素等物質變成低分子質量的糖類，再利用酵母菌在生長繁殖過程中將糖類物質與無機氮合成菌體蛋白，使豆渣蛋白含量比原始蛋白含量增加43.1%。

與傳統腐乳相比，全豆腐乳不需要棄渣，盡可能多的保留營養成分。目前，全豆腐乳的制備難點體現在兩方面，一方面體現在磨漿工藝上，傳統腐乳制備白坯過程中磨漿濾出的漿渣顆粒比較大，用直接過濾出的豆渣制作腐乳，其口感過于粗糙，消費者難以接受，除此之外如果磨漿細化程度不夠，制作出的全豆腐乳還會出現質地粗糙的問題；另一方面體現在點鹵工藝上，豆渣中含有大量的不溶性膳食纖維和多糖，不溶性膳食纖維會在凝固過程阻礙蛋白形成有序網絡結構，而多糖則會參與凝膠網絡結構的形成，這就導致生產出的白坯硬度不好，結構松散[5]。鑒于此，本研究選用黑曲霉發酵豆渣，對豆渣進行纖維細化，再以發酵后豆渣作為腐乳制作原料之一，在白坯制作過程中進行回填，通過發酵改善豆渣不適口的渣感，提高了豆渣的營養價值，使其更易被消化吸收。通過此工藝制作出的腐乳，不僅提高了腐乳中的營養成分，而且提高了出品率。實現了高效利用資源，減少浪費，降低環境污染，為豆渣的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

大豆（黑河43號）：國家大豆產業體系崗位科學家鹿文成研究員提供；新鮮豆渣：取適量大豆加入5倍體積的水在陰涼處浸泡16 h，磨漿完成后使用80目紗布過濾豆渣并擠壓至無法繼續擠出豆漿，此時分離出的豆漿即為生漿，出渣率為141%，濾出物為豆渣，生漿與豆渣保存待用。

1.1.2 菌株

五通橋毛霉（Mucor wutung kiao）PR9.00151：朱老六食品股份有限公司；黑曲霉孢子粉（Aspergillus niger）hi3.042：山東和眾康源生物技術有限公司。

1.1.3 化學試劑

98%濃硫酸、硼酸、體積分數95%乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）、無水乙醇（分析純）：北京化工廠；溴甲酚綠：中國公私合營新中化學廠；丙酮、石油醚（沸程30～60 ℃）：北京鼎國生物技術有限責任公司、甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

ZEISS-EVO18型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）：德國卡爾蔡司公司；TA.new plus型質構分析儀：上海瑞玢國際貿易有限公司；KL 04-A型離心機：美國Agilent公司；GZX-9140 MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱：博訊實業有限公司醫療設備廠；BK-FD 10S冷凍干燥機：濟南歐萊博技術有限公司；6890N-5975B氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、1260液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技公司；100 μL PDMS 萃取纖維頭固相微萃取針、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國SUPELCO公司；BR4I離心機：賽默飛世爾（中國）有限公司；LA 8080氨基酸自動分析儀：日本株式會社日立高新技術集團；大豆脫皮機：山東譽亞大豆機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

（1）傳統腐乳制備工藝

大豆→去皮→浸泡→磨漿→漿渣分離→煮漿→點腦→蹲腦→壓制→劃坯→白坯→接菌→前發酵→裝瓶→灌湯封口→裝箱→后發酵→傳統腐乳成品

大豆經脫皮機進行脫皮處理，經過清洗、浸泡（5倍體積的水在陰涼處浸泡16 h）、濾干、磨漿、漿渣分離；煮漿后進行點腦及蹲腦，將蹲腦后的豆腐進行壓制成型，然后進行劃坯處理，形成白坯；將白坯進行接菌和前發酵處理；發酵和腌制后裝瓶、灌湯封口、裝箱、送入發酵庫房進行后發酵，發酵溫度25 ℃，濕度32%，經60 d發酵后得到傳統腐乳成品。

（2）黑曲霉全豆腐乳制備工藝

大豆→去皮→浸泡→磨漿→漿渣分離→黑曲霉發酵豆渣→發酵后豆渣→漿渣混合→膠體磨研磨→煮漿→點腦→蹲腦→壓制→劃坯→白坯→接菌→前發酵→裝瓶→灌湯封口→裝箱→后發酵→黑曲霉全豆腐乳成品

與傳統腐乳工藝不同的是，預實驗中黑曲霉接種量為底物的0.8%、發酵溫度35 ℃、發酵時間72 h，在此條件下可溶性固形物含量最高，以此作為發酵條件，將豆渣進行黑曲霉發酵，并將發酵好的豆渣與豆漿混合，制備黑曲霉全豆腐乳。

1.3.2 品質指標的測定

水按照商業標準SB/T 10170—2007《腐乳》[6]中的方法進行感官評定并測定水分含量、氨基酸態氮、水溶性蛋白質、總酸、和食鹽含量；總膳食纖維按照國標GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》[7]中的方法進行測定；氨基酸組成按照國標GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[8]中的方法進行測定；大豆皂苷按照國標GB/T 22464—2008《大豆皂苷》[9]中的方法進行測定；大豆異黃酮按照國標GB/T 26625—2011《糧油檢驗大豆異黃酮含量測定高效液相色譜法》[10]中的方法進行測定；蛋白體外消化率按照國標GB/T 17811—2008《動物性蛋白質飼料胃蛋白酶消化率的測定過濾法》[11]中的方法進行測定。

1.3.3 微觀結構

使用掃描電鏡對三種腐乳進行微觀結構觀察。將腐乳切成1 cm3大小的正方體進行冷凍干燥，冷凍干燥結束后用導電雙面膠固定在樣品臺上用離子濺射儀進行樣品表面噴金，噴金后放置于掃描電子顯微鏡下觀察。在20 kV條件下觀測結果[12]。

1.3.4 質構特性

選取塊型整齊均勻的黑曲霉全豆腐乳、全豆腐乳和傳統腐乳，除去湯汁和腐乳外表皮，置于質構儀操作臺中央，采用質地剖面分析（texrue profile analysis，TPA）模式測定腐乳質構特性。儀器使用參數：探頭型號：TA/36R柱狀探頭；探頭直徑：36 mm；測試前速度：1 mm/s；測試速度：1 mm/s；測試后速度：1 mm/s；觸發力：5 g。測定參數：彈性、硬度、黏著性、咀嚼性、內聚性。同一品種腐乳3個平行，取平均值[13]。

1.3.5 出品率的測定

稱量腐乳成品質量m1和使用大豆質量m2[20]。按公式（1）計算得出腐乳的出品率。

1.3.6 持水性的測定

稱取均勻的樣品記為m1，將其置于離心管中，在20 ℃10 000×g條件下離心10 min，吸取洗出的水分后，稱質量記為m2，隨后將樣品置于105 ℃烘箱中干燥6 h，對干燥后的樣品進行稱質量，記為m3[21]。持水性計算公式（2）如下。

1.3.7 揮發性風味物質GC-MS分析

固相萃取樣品制備：稱取適量樣品置于頂空瓶中，密封，置于80 ℃水浴中平衡30 min，保持溫度用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結束后，將萃取針頭拔出，插入GC-MS進樣器中解吸5 min[15]。

同時蒸餾萃取法：取10 g樣品置于裝置一端的1 L圓底燒瓶中，加適量水，電熱套加熱。裝置另一端盛有30 mL二氯甲烷的萃取瓶，60 ℃水浴加熱，同時蒸餾萃取3 h。冷卻，加入少許無水硫酸鈉去除水分，4 ℃靜置過夜，旋蒸儀濃縮至1 mL，密封，4 ℃保存供GC-MS定性分析。

氣相色譜和質譜分析條件：色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度：50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min。進樣口溫度：250 ℃；載氣氦氣（He），載氣流速：1.2 mL/min；分流比：不分流。載氣流量：恒壓12 psi；不分流；恒流1.2 mL/min；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；掃描方式：全掃描[16]。

揮發性風味物質的確定：采集到的質譜圖利用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發性成分，并利用面積歸一法分析各成分的相對含量[17]。

1.3.8 統計分析

所有試驗均至少重復三次組間平行試驗，結果以“平均值±標準差”表示。使用Microsoft Office 2016進行數據整理，IBM SPSS Statistics 20進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 腐乳的指標

測定黑曲霉全豆腐乳和傳統腐乳的感官指標、理化指標以及微生物指標并進行比較，結果分別見表1～表3。

表1 兩種腐乳感官指標的測定結果Table 1 Determination results of sensory indexes of two kinds of fermented bean curd

表2 兩種腐乳理化指標的測定結果Table 2 Determination results of physiochemical indexes of two kinds of fermented bean curd

表3 兩種腐乳微生物指標的測定結果Table 3 Determination results of microbial indexes of two kinds of fermented bean curd

由表1～表3可知，黑曲霉全豆腐乳斷面呈黑褐色，有光澤；味道鮮美適口，咸味適中；具有腐乳特有氣味，無不良氣味；塊型整齊，質地細膩，與傳統腐乳相比，黑曲霉全豆腐乳色澤更深，呈黑褐色。黑曲霉全豆腐乳中的水分、氨基酸態氮、水溶性蛋白質、總酸、食鹽的含量分別為66.77%、0.44 g/100 mL、5.13 g/100 mL、0.55 g/100 g、10.07 g/100 g；兩種腐乳中大腸菌群＜10 MPN/100 mL，致病菌沙門氏菌均未檢出，金黃色葡萄球菌＜10 CFU/mL。結果表明，兩種腐乳都滿足SB/T 10170—2007《腐乳》要求。

2.2 微觀結構

為了更好地探究黑曲霉全豆腐乳與傳統腐乳之間在微觀結構方面的差異，將兩種腐乳的微觀結構進行對比，SEM結果見圖1。由圖1可知，黑曲霉全豆腐乳的結構較平整，并且無可見的纖維組織結構；傳統腐乳的三維結構多孔且不緊密。

圖1 兩種腐乳的掃描電鏡結果Fig.1 Scanning electron microsope of two kinds of fermented bean curd

2.3 質構特性

三兩種腐乳的質構特性結果見表4。由表4可知，兩種腐乳的部分質構特性存在顯著差異（P＜0.05）；黑曲霉全豆腐乳的彈性和內聚性略高于傳統腐乳，而硬度、黏著性和咀嚼性顯著高于傳統腐乳（P＜0.05），黑曲霉全豆腐乳細軟程度可能較低，口感上可能不及傳統腐乳。黑曲霉全豆腐乳的質構特性表現優良，主要是因為豆渣經黑曲霉發酵后產生的多糖類物質與腐乳中蛋白質產生共價鍵與非共價鍵[18]，共價鍵導致了蛋白質-多糖化合物具有更高的熱穩定性，非共價鍵產生的凝聚層改變了腐乳的質地。由此可見，多糖導致了黑曲霉全豆腐乳在結構上發生了改變，而且結合SEM圖得出，黑曲霉全豆腐乳在質構特性上不僅與傳統腐乳接近，甚至在彈性、硬度、黏著性、咀嚼性、內聚性等方面優于傳統腐乳。

表4 兩種腐乳的質構特性Table 4 Texture properties of two kinds of fermented bean curd

2.4 出品率、持水性及蛋白體外消化率

出品率是腐乳生產中重要的指標。由表5可知，黑曲霉全豆腐乳出品率為171.67%，傳統腐乳出品率為158.33%，相較于傳統腐乳，黑曲霉全豆腐乳顯著提高了8.43%。較高的出品率，對食品未來加工來講，既提高了豆渣的使用效率，也減少了環境污染。黑曲霉全豆腐乳持水性低于傳統腐乳，黑曲霉全豆腐乳持水性為75.17%，傳統腐乳持水性為77.67%。

表5 兩種腐乳的出品率、持水性與蛋白體外消化率Table 5 Production yield,water holding capacity and protein digestibility of two kinds of fermented bean curd

蛋白質的消化率是指食物蛋白被消化酶解的程度，是一種評價食物營養價值的重要指標，食物蛋白質的消化率越高，蛋白質被消化吸收的越徹底，食物的營養價值就越高。由表5可知，黑曲霉全豆腐乳的蛋白消化率要高于傳統腐乳（P＞0.05），由于添加黑曲霉發酵后豆渣制作的腐乳，其產生的糖類等物質及被細微化的纖維素增加了消化酶與大豆蛋白的結合位點，從而促進了酶解反應的進行，提高了黑曲霉全豆腐乳的蛋白消化率。

2.5 活性成分含量

測定兩種腐乳的活性成分含量，結果見表6。由表6可知，黑曲霉全豆腐乳與傳統腐乳的總膳食纖維含量存在顯著性差異（P＜0.05）。相同發酵條件下，黑曲霉全豆腐乳的膳食纖維含量高于傳統腐乳。而黑曲霉全豆腐乳大豆皂苷含量顯著低于傳統腐乳（P＜0.05）。其主要原因是在白坯制作過程中，經過高溫煮漿、點鹵、制坯等工序，大豆皂苷隨著黃漿水一同流失一部分，經黑曲霉發酵過的豆渣對豆渣的水解更徹底，產生的大豆皂苷也更多，結合大豆皂苷易溶于熱水的特性，在煮漿過程中，大豆皂苷流失更多，故黑曲霉全豆腐乳含量更低。

表6 兩種腐乳的活性成分含量Table 6 Active ingredient content of two kinds of fermented bean curd

傳統腐乳的異黃酮含量顯著高于黑曲霉全豆腐乳（P＜0.05），這與豆渣的加入和發酵過程密切相關；黑曲霉發酵豆渣過程中，黑曲霉產生的蛋白酶和纖維素酶產生了大量的氨基酸、單糖、醛及酮類物質，通過一系列反應合成異黃酮，使豆渣中異黃酮含量增加[19]；在煮漿過程中溫度達到95 ℃以上，根據馬玉榮等[20-21]的研究可知，95 ℃以上短時處理豆漿異黃酮含量會減少。

2.6 揮發性風味物質含量

腐乳的香氣作為重要的感官指標，決定著腐乳品質的好壞，而香氣取決于揮發性風味物質的成分，它們通常受原材料、微生物、生產工藝、加工環境等因素影響，2種腐乳的揮發性成分及其組分含量測定結果見表7。

表7 兩種腐乳的揮發性成分及其組分含量Table 7 Volatile components and contents of two kinds of fermented bean curd

續表

由表7可知，2種腐乳通過同時蒸餾萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE），結合氣質聯用（gas chromatogrophymass spectrometry，GC-MS）法測定出揮發性物質77種，黑曲霉全豆腐乳檢出物質39種，其中酯類占風味物質種類總數25.64%，烴類占12.82%，醇類占10.26%，酸類占7.69%；傳統腐乳檢出物質40種，其中酯類占風味物質種類總數的30%，烴類27.5%，醛類17.5%，醇類7.5%。

在發酵過程中，腐乳中的風味物質含量及種類不斷增加，酯類物質尤為突出，由表8可知，兩種腐乳酯類物質含量均較高，共同檢出的酯類主要有辛酸乙酯、十六烷酸乙酯、（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯等，他們構成了腐乳的主體風味。

在腐乳中，烴類物質主要來源于脂肪的分解和調料的添加，烴的香氣不明顯，故對腐乳風味增益不大。酯類物質在腐乳發酵過程中的酯化反應產生的，能賦予腐乳花香、果香[22-23]。黑曲霉全豆腐乳由于添加改性豆渣，形成了一些傳統腐乳沒有的風味物質，如1-辛烯-3-醇、2,3-三甲基-環戊基乙醇、3-苯基-1,2,4-三氧雜環戊烷、7-十六烷、乙酸乙酯、丁二酸單乙酯、十一酸乙酯、一氯乙酸十三烷基酯、亞麻酸乙酯、辛酸、棕櫚油酸等物質，這些物質使黑曲霉全豆腐乳的風味更獨特。

從兩種腐乳中共檢出11種醛類物質，分別為異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、正戊醛、正己醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、乙醛、（Z）-13-十八碳烯醛。2-甲基丁醛具有堅果香，正戊醛具有強烈辛辣味，正己醛具有青草味，苯甲醛具有苦杏仁味，苯乙醛具有風信子香；腐乳中的醛類化合物主要通過Strecker反應或由醇、酚等物質氧化而成[24]。

由表7可知，黑曲霉全豆腐乳的醇類和酚類物質含量遠高于傳統腐乳，故黑曲霉全豆腐乳形成的醛類物質含量最高，種類最多，這些醛類物質為黑曲霉全豆腐乳增添了獨特風味。而黑曲霉全豆腐乳最大的不同在于含有含硫類物質及吲哚類物質，根據孫娜等[25]對菌屬與風味物質相關性分析表明，明珠串菌（Leuconostoc）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）與含硫化合物、吲哚形成密切相關，且風味形成發生在發酵后期。說明本研究中黑曲霉全豆腐乳在后發酵過程中，形成了利于明珠串菌（Leuconostoc）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）等菌群的生存環境，從而產生了含硫類物質和吲哚類物質，其豐富了黑曲霉全豆腐乳的特征香氣。

2.7 氨基酸組成與分析

由表8可知，兩種腐乳共測出17種氨基酸，傳統腐乳總氨基酸含量為31.73 g/100 g，其中必需氨基酸含量為11.47 g/100 g，非必需氨基酸含量為20.26 g/100 g；黑曲霉全豆腐乳總氨基酸含量為26.58 g/100 g，其中必需氨基酸含量為9.57 g/100 g，非必需氨基酸含量為17.01 g/100 g。氨基酸的組成與含量除了與原料有關外，與發酵過程中的微生物群落與結構也緊密相關。傳統腐乳在各項氨基酸組成上高于黑曲霉全豆腐乳，其原因是由于豆渣的加入，勢必會導致全豆腐乳和黑曲霉全豆腐乳在蛋白含量上稍遜于傳統腐乳，在后發酵過程中，各種酶系作用下氨基酸的含量也勢必受到影響。

表8 兩種腐乳氨基酸組成及含量測定結果Table 8 Amino acid composition and contents of two kinds of fermented bean curd

3 結論

添加黑曲霉發酵豆渣的黑曲霉全豆腐乳呈黑褐色，有光澤；味道鮮美適口，咸味適中；具有腐乳特有氣味，無不良氣味；塊型整齊，質地細膩，其水分、氨基酸態氮、水溶性蛋白質、總酸、食鹽的含量分別為66.77%、0.44 g/100 mL、5.13 g/100 mL、0.55 g/100 g、10.07 g/100 g，達到相關國標要求。通過微觀結構表征可知，其三維結構顯示纖維組織在各種酶系的水解作用下已完全被破壞，并且無可見的纖維組織結構，說明黑曲霉對豆渣粗纖維的分解效果十分優良；在質構特性中硬度、黏著性和咀嚼性表現優良；出品率達到171.67%；持水性達到75.17%；總膳食纖維達到22.6 g/100 g；大豆皂苷達到0.33 g/100 g；大豆異黃酮為466.2 mg/kg；蛋白體外消化率達到94.63%；揮發性風味物質共檢出39種；氨基酸共檢出17種；本研究結果說明：黑曲霉全豆腐乳可作為替代傳統腐乳的新產品，解決了豆制品企業存在的新鮮豆渣大量堆積腐敗變質和低值化利用問題并提高了腐乳出品率，具有進一步發展或者擴大生產的價值，為豆渣高值化加工提供了途徑。