外源添加物對醬油發酵的影響

張玉潔，張彥民，王 菲，趙國忠

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院 省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.山東巧媳婦食品集團有限公司，山東 淄博 255400）

醬油是一種傳統的調味品，由于其獨特的香氣、味道和營養價值，在世界各地獲得了認可[1]。由于原料、工藝和人文的差異性，使得不同地區的醬油有著不同的滋味和風味[2]。但醬油的制作過程通常都是由兩步發酵過程制成的：制曲和醬醪發酵。米曲霉（Aspergillus oryzae）是制曲階段的常用菌株，可以產生蛋白酶和淀粉酶等多種酶系，將原料中的大分子物質降解成小分子以利于醬醪階段微生物的發酵[3]。接下來將成熟的曲與含有18%～22%NaCl的鹽水溶液混合進行醬醪發酵。而醬醪發酵過程，是在一個復雜的微生物體系中，這對于合成關鍵的揮發性化合物、氨基酸、多肽和糖是非常必要的[4]。

乳酸菌和酵母菌對醬油的品質發揮著重要作用[5]，是醬醪發酵階段的重要菌種。乳酸菌是醬油發酵前期重要的菌種，它能夠產生乳酸、乙酸等有機酸。這些有機酸既可以作為風味物質的前體，又可以抑制致病菌的生長，保證產品質量。現已有報道表明，植物乳桿菌可以改善發酵豆漿中豆腥味和青草味[6]。目前，在醬油添加嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）的應用較多，而對植物乳桿菌的研究還較少。因此，植物乳桿菌在醬油中的應用存在著巨大的前景。具有耐鹽性的魯氏接合酵母能夠促進蛋白降解[7]，從而利用各種氨基酸底物水解成各種醇，如異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇[8]，這些都是醬油特有的風味。同時還能進一步發生酯類發酵和酸類發酵。通過魯氏接合酵母的添加，改變了發酵群落結構也進一步影響了醬油的質量。而醬油品質的提升不止需要微生物的參與來產生營養物質和香氣成分，添加外源的調味基料也可以改善醬油的品質。其中酵母抽提物（yeast extract，YE）是以酵母為原料經過發酵、提取、轉化和濃縮等工藝制成的食品配料產品[9]，它由肽類、氨基酸類、維生素類、微量元素類、核酸類等物質組成[10]。不僅能提供酸、甜、苦、咸、鮮的基本味道，所富含的有效成分還能參與食品風味的形成，已經廣泛應用于調味品、方便食品和冷凍食品等行業[11]。近年來酵母抽提物在食品領域已成為熱門研究，但在醬油中的應用及對微生物菌群的影響等探討還較少。

因此，本研究將以酵母抽提物、植物乳酸菌和魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）作為外源添加物加入到醬醪的發酵過程中，考察不同添加物對發酵結束的醬醪的理化指標、微生物的菌落結構、揮發性風味物質和感官評價的影響，揭示醬油釀造過程中菌種的發酵功能及酵母抽提物的應用價值，為提高醬油生產工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酵母抽提物（蛋白質：47.0 g/100 g；碳水化合物：16.9 g/100 g）和魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）S1：安琪酵母股份有限公司提供；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CS3：為本實驗室保藏菌株。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；MRS肉湯培養基：英國Oxoid公司。

1.1.2 試劑

C7～C40正構烷烴（色譜純）：美國AccuStandard公司；2-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京索來寶科技有限公司soil試劑盒：美國Omega Bio-tek公司。

1.2 儀器與設備

DY04-13-00立式高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；AllegraTa25R型高速離心機：美國BeckMan公司；QP2010 Ultra型氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀：日本島津公司；頂空-固相微萃取（headspace solid state microextraction，HS-SPME）裝置，配75 μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）固相微萃取頭、頂空瓶：上海安譜實驗科技股份有限公司；ABI9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina MiSeq平臺：美國Illumina Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

植物乳桿菌CS3的培養：從甘油管中取適量植物乳桿菌CS3的菌液，接種至MRS液體培養基中，37 ℃活化24 h，活化3次，備用。

魯氏接合酵母S1的培養：從甘油管中取適量魯氏接合酵母S1的菌液，接種至酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養基中，30 ℃活化24 h，活化3次，備用。

1.3.2 醬油樣品的制備

將脫脂豆粕和麥麩按質量比6∶4混合，并在121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，將0.3%的米曲霉接種到發酵培養基中。在30 ℃條件下堆積培養，待曲表面變為白色進行第一次翻曲。然后繼續培養，直到表面變黃進行第二次翻曲。待顏色變為綠色時停止培養。隨后加入18%鹽水進行醬醪發酵。在醬醪發酵初期溫度從15 ℃升高到30 ℃（每天升溫1 ℃），之后在30℃條件發酵75 d。

1.3.3 外源物添加方式

將無添加的醬醪記為樣品S0；YE（S1）的添加：在醬醪發酵開始即加入1%YE；魯氏接合酵母S1（S2）的添加：在醬醪發酵15 d時加入107CFU/g的魯氏接合酵母S1；植物乳桿菌CS3（S3）的添加：在醬醪發酵15 d時加入107CFU/g的植物乳桿菌CS3。

1.3.4 理化指標的測定

氨基酸態氮、總酸和可溶性無鹽固形物參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》的檢測方法測定[12]，還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法測定[13]。

1.3.5 細菌總DNA提取及PCR擴增

1.3.6 高通量測序

上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina MiSeq平臺進行構建PE 2×300的文庫和測序。原始測序序列使用FLASH軟件進行拼接，使用的UPARSE軟件根據97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，將比對閾值設置為70%。與Silva數據庫（SSU123）進行對比。

1.3.7 揮發性風味成分檢測

將3 mL的醬油樣品置于15 mL的頂空瓶中，并加入210 μL 20 mg/L的2-辛醇。將密封的頂空瓶在磁力攪拌器中于60 ℃平衡15 min。平衡結束后，將萃取頭在60 ℃下頂空萃取30 min，于250 ℃下解吸15 min進行GC-MS進樣。GC條件：初始溫度40 ℃下保持3 min，以4 ℃/min升溫至150 ℃保持1 min，再以8 ℃/min升溫至250 ℃保持6 min。以氦氣（He）為載氣，250 ℃的進樣溫度，1 min的進樣時間。MS條件：離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，掃描速率為3.00 scans/s。根據保留時間定性，采用內標法定量。

1.3.8 感官評價

從天津科技大學的學生和員工中招募了10名受訓的專家（5名女性和5名男性），年齡在21歲～30歲之間，既往有感官評價經驗。將樣品置于不透明的一次性紙杯中，每杯含有20 mL醬油，每個樣本都用一個三位隨機數編碼。在隔離的隔間中小組成員進行室溫評估，使用1～9的等級對樣品的強度進行評分，評分標準見表1。

表1 醬油的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of soy sauce

2 結果與分析

2.1 不同外源添加物對醬醪理化指標的影響

對發酵結束的醬醪進行了基本理化指標的測定，結果見表2。

表2 不同外源添加物對醬油關鍵理化指標的影響Table 2 Effect of different exogenous additives on key physical and chemical indexes of soy sauce

由表2可知，樣品S1的氨基酸態氮含量比空白組有顯著提升（P＜0.05），相比S0提高了21%。而外源添加物為乳酸菌和酵母菌的處理組對氨基酸態氮含量并無顯著影響（P＞0.05）。這是因為酵母抽提物中富含的氨基氮和全氮等全水溶性營養物質在生產過程中被釋放出來。氨基酸態氮不僅有助于醬油的營養成分的生成，而且對其感官特征也有顯著影響[15]。總酸含量在樣品組也呈現升高的趨勢，所有的處理組都與樣品S0有顯著差異（P＜0.05）。其中，樣品S3總酸含量最高，這是因為樣品S3中的乳酸菌在發酵過程中產生了多種有機酸使得總酸含量升高。在較高的酸度下可抑制腐敗菌的生長，從而減少不良代謝物，保證醬油的產品質量安全。發酵結束時S2和S3樣品與樣品S0在還原糖的含量上有顯著差異（P＜0.05），這是因為乳酸菌和酵母菌在生長過程中以還原糖為基質進行了代謝作用。樣品S1、S2和S3樣品的可溶性無鹽固形物含量均已超過國標（可溶性無鹽固形物含量≥15.00 g/100 mL）中規定的高鹽稀態特級醬油的標準。通過3種不同外源添加物在醬油發酵過程中的加入發現：YE可以顯著提高醬油的氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物含量（P＜0.05）；乳酸菌對醬油的總酸含量影響更大；酵母菌與無鹽固形物含量也有著緊密關系。因此，不管是微生物還是成品調味基料在醬醪期間的加入都可以提高醬油的品質。

2.2 不同外源添加物對醬醪微生物群落的影響

將發酵90 d的四組樣品進行了細菌群落豐度的檢測，在屬水平上的多樣性差異結果見圖1。

圖1 基于屬水平醬油樣品微生物群落結構Fig.1 Microbial community structure of soy sauce samples based on genus level

由圖1可知，四聯球菌屬和乳桿菌屬是所有樣品中的優勢屬，樣品S0中的四聯球菌屬（Tetragencoccus）是菌落組成中最大的屬，由于其耐鹽性，是發酵食品中的常見菌株[16-17]，在此醬油中相對豐度達到了70%。樣品S1中乳酸菌的總比例與對照組沒有明顯差異，但不同乳酸菌的相對豐度發生了明顯的變化。這是因為乳酸菌對各種氨基酸具有營養缺乏性[10]，而YE中所富含的氨基酸由于不同的比例，使得不同乳酸菌屬需求的差異從而使豐度區分開來。高比例的四聯球菌屬的降低，使得其他菌屬含量的相對提高，可能會使醬油中的代謝物質更加飽滿，風味更加多元化。但另外兩個處理組在發酵結束相比空白組四聯球菌屬的占比都明顯下降，特別是S3樣品中，隨著植物乳桿菌（Lactobacillus）CS3的加入，乳桿菌屬為占比最大的屬，其相對豐度增加到45%。乳桿菌屬是存在于人類口腔和胃腸道中的重要益生菌，能夠增強免疫系統并改善身體炎癥[18-19]。而在加入魯式接合酵母之后，乳酸菌的豐度已經超過了90%。推斷酵母菌的加入，所產生的CO2、丙酮酸、維生素以及琥珀酸等代謝物刺激了乳酸菌的生長[20-21]。同時，S2和S3處理組中乳桿菌屬比例提高，它所產生的有機酸、環二肽和細菌素等物質被認為可抑制腐敗微生物，從而提高產品質量。正如腸球菌屬（Enterococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）的含量有所降低，它們雖然是人體的條件致病菌，但有必要盡量減少食品中致病菌的含量和造成危險的可能性[22-23]。而在風味形成和生物活性中被認為起著重要作用的魏斯氏菌屬比例增加[24]。因此，在醬醪發酵過程中外源添加物的加入改變了微生物的菌落組成。

2.3 不同外源添加物對醬醪揮發性風味成分的影響

2.3.1 對風味物質種類及含量的影響

風味是評價醬油品質的重要指標，將不同添加物的醬油的揮發性風味物質種類及含量測定，結果見圖2。

圖2 4種醬油樣品風味物質種類（a）及含量（b）比較Fig.2 Comparison of flavor substances (a) and contents (b) of 4 kinds of soy sauce samples

由圖2a可知，從樣品中檢測出89種揮發性物質，樣品S0、S1、S2、S3中分別檢出50種、66種、56種和66種。說明外源添加物有助于提高醬油揮發物質的種類，更利于各種風味物質的形成，使醬油風味更加多樣和醇厚。其中酯類、醇類和酮類在各樣品中都較為豐富。酯類是構成醬油香氣成分的主體，不僅能增強醬油的香味，還能緩和醬油的咸味。在外源添加物的處理組中明顯增加，而醛類物質的減少可能是在發酵過程中被催化成了相應的醇或酸。

由圖2b可知，酯類和醇類的含量與其他風味物質是斷層式呈現的。與空白組相比，S3樣品中酸類物質也提高了84%。這可能是由于額外添加的乳酸菌在發酵過程中有機酸的生成。豆制品的“豆腥味”被認為與醛類物質有著緊密的聯系[6]，處理組的醛類濃度相比較于樣品S0含量降低可能是外源添加物在發酵進程中產生的代謝物對醛類物質發生了轉化。

2.3.2 揮發性成分聚類分析

醬油中主要揮發性風味成分與樣品之間的聚類分析結果見圖3。

圖3 發酵結束的醬油樣品中主要風味成分聚類分析Fig.3 Cluster analysis of main flavor components in soy sauce samples after fermentation

結果表明，處理組與樣品S0揮發性風味不相似。酯類作為醬油的重要組成部分，主要包括2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊酸乙酯。其中具有香蕉風味特征的乙酸異戊酯賦予醬油濃郁而柔和的特征，它是由曲霉或酵母的脂肪酶將大豆中的脂肪分解成脂肪酸，隨后轉化為酯。因此樣品S2中具有較高含量。4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚是醬油的特征香氣的物質，提供了煙熏香氣。原料中的木質素被曲霉酶降解為阿魏酸等酚酸類化合物，進一步被球擬酵母通過脫羧還原轉化為4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚[25]。其中樣品S1表現特別突出，這可能是來自YE中自身的營養物質，如有機酸、氨基酸、小分子肽，為發酵過程的酵母菌的生長提供了更充足的底物。樣品S2醇類物質含量高，主要是由于酵母菌的加入，將醛類物質、糖和氨基酸等物質利用和轉化而來的[26]。其中乙醇含量是樣品S0的2.23倍，乙醇含量越高相對應高級醇和酯的含量也會升高，從而使醬油的整體風味增強。與S0組相比，樣品S3中具有酸敗和豆腥味的己醛和壬醛含量顯著下降，根據之前的研究發現，這可能是植物乳桿菌具有醛脫氫酶所致[27]。將樣品S3樣品中的醛類轉化為酸類和醇類，進而通過酯化反應轉化為富含水果香氣的酯類，如乙酸己酯、正己酸乙酯、乙酸異戊酯等開始生成并增加，使醬油中令人不悅的揮發性風味減少。

2.4 不同外源添加物對醬醪感官品質的影響

對4個不同處理的樣品進行感官評價，繪制雷達圖，見圖4。由圖4可知，添加外源物的醬油整體評分提高。樣品S1的醬香是S0的1.2倍；樣品S2的醇香是S0的1.24倍；樣品S3的果香是S0的1.6倍。綜上分析，添加YE使醬油的醬香味最為突出，且輔以醬油醇香、麥芽香和果香的香氣，使醬油整體風味較為均衡，具有醬油的典型特征。S3樣品組在醬香味高于空白的基礎上，賦予了醬油較高的果香味。而S2樣品只在醬油附屬香氣的醇香和酯香上較為突出，但醬油主體的風味與空白差異不大。

圖4 4種醬油發酵結束后的感官評價結果Fig.4 Sensory evaluation results of 4 kinds of soy sauce after fermentation

3 結論

本研究將酵母抽提物、魯氏接合酵母和植物乳桿菌三種不同外源添加物加入醬油發酵過程中，探討其對醬油品質的影響。外源物的添加顯著提高了醬油的理化品質，微生物群落在添加物的影響下也發生了改變，從四聯菌屬主導變為乳桿菌屬的比例占比最大，其中添加植物乳桿菌的樣品是對照組的2.64倍。而微生物豐度的變化間接使得風味成分也有所不同，處理組的醬油樣品比空白組的風味物質種類明顯增多，醇類和酸類的含量升高。作為主體風味的酯類物質增加，醬油特有風味的4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚變得突出且令人不悅的揮發性風味減少。外源物添加使得醬油的風味變得更加飽滿和多元化，尤其是酵母抽提物的加入。因此，向發酵過程中額外加入外源添加物可使得醬油的營養成分和香氣物質都能顯著改變，未來不同外源物的添加對醬油的創新發酵有著良好的前景。