黑枸杞乳酸菌飲料發酵工藝優化及功能性成分研究

白桂英，葉淑紅，王琛郴，張 彧

（大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）屬于茄科枸杞屬多年生植物[1]，它主要分布于我國的西北地區，地貌相對復雜且干燥[2]，在國外主要分布于歐洲南部以及地中海沿岸等地區[3]。類胡蘿卜素，維生素C、維生素B1、維生素B2等在黑枸杞的果實中含量較高，并且黑枸杞中還含有豐富的微量元素，如Fe、Sn、Zn等[4]。黑枸杞中富含花青素和黃酮類化合物等功能成分，具有提高免疫力、降血脂、抗疲勞等功能[5]。花青素作為黑枸杞重要功能成分之一，有著預防心腦血管疾病、抗癌、提高視力、降血脂、消炎、抗輻射以及延緩衰老等一系列作用[6-9]。

雖然黑枸杞在我國歷史悠久，種植面積廣，但目前在食品行業中發展較緩慢，深加工產品很少。食用黑枸杞的主要方式是加水浸泡后飲用，食用方式單一，但黑枸杞在醫藥以及食品方面都有很大的潛在應用價值。國內對于黑枸杞的研究大多是對于黑枸杞多糖、酚類等營養物質的測定和提取，近幾年興起了對于黑枸杞飲料的開發。劉艷懷等[10]對黑枸杞藍莓復合飲料的配方進行了研究，研制的黑枸杞藍莓復合飲料不僅口感細膩、醇厚濃郁，且營養價值極高，具有較好的市場發展前景。陳海魁等[11]研究黑枸杞果醋和果酒的發酵工藝，確定最優發酵條件下制得的黑枸杞果醋風味純正，具有水果香味，是一種價值較高的營養保健型果醋。國外對黑枸杞研究多集中在花色苷組分含量以及抗氧化降血脂等活性變化，而對黑枸杞乳酸菌飲料開發卻鮮有報道。

本實驗選擇黑枸杞為主要原料，經植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵，制備黑枸杞乳酸菌發酵飲料。采用單因素試驗和響應面設計試驗對發酵工藝進行優化。黑枸杞乳酸菌飲料的研制，既可以滿足消費者口味的多元化同時也滿足人們對營養豐富產品的追求，充分研究和利用其功能成分，從而提高產品的附加值和黑枸杞的利用率，為黑枸杞功能發酵飲料開發和工業化發展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本實驗室保藏；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰乙酸、亞硫酸氫鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、氯化鉀、醋酸鈉、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-5500PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；JJ-2組織搗碎勻漿機：江蘇杰瑞爾電器有限公司；HZQ-F100振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理機：九陽股份有限公司；GL-21M冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；QN-30壓蓋機：湖南省科特包裝檢測技術有限公司；LRH-150生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；T10分散機：廣州儀科實驗室技術有限公司；WYA-2W雙目數字阿貝折射儀：上海精科儀電物光儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞乳酸菌飲料加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料挑選、清洗：選擇大小適中、干凈無霉的優質黑枸杞，取適量的水洗滌干凈，備用。

黑枸杞漿液的制備：按所需用量稱取處理好的黑枸杞，并按照1∶25（g∶L）固液比加水，打漿。此時原料打漿后還原糖含量為7.32 mg/mL，可以為菌種后續發酵提供足夠的碳源[12]，打漿后的原漿用四層紗布過濾，得到黑枸杞漿液。

菌種活化：將植物乳桿菌的保藏菌種培養物取出解凍，取100 μL于MRS平板上進行活化復壯后，接種到100 mL的菌液中，并放入37 ℃恒溫培養箱培養24 h。

一次滅菌、接種發酵：將過濾后的黑枸杞漿液進行巴氏殺菌（65 ℃下滅菌30 min），冷卻后的漿液在無菌條件下接種經過活化后的植物乳桿菌，并在37 ℃恒溫條件下按照試驗設計時間發酵。

離心、調配、均質：將發酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液加入6%白砂糖并在8 000 r/min條件下均質5 min。

灌裝：均質后的發酵液裝入合適容器內并封口。

二次滅菌、冷卻：將灌裝后的發酵液進行二次滅菌（65 ℃、30 min），取出冷卻至常溫即可得到黑枸杞乳酸菌飲料成品。

1.3.2 黑枸杞乳酸菌飲料發酵工藝優化

（1）單因素試驗

在不同接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、固液比（1∶40、1∶35、1∶30、1∶25、1∶20（g∶mL））、發酵時間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、裝液量（20%、30%、40%、50%、60%）條件下，分別考察上述各因素對黑枸杞乳酸菌飲料花青素含量和感官評分的影響。

（2）響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇接種量（A）、發酵時間（B）、固液比（C）、裝液量（D）為影響因素，以感官評分（Y）為響應值，采用Box-Behnken試驗設計4因素3水平試驗，確定最佳工藝參數。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測

可溶性固形物測定：采用折光計法[13]；總酸含量測定：參照國標GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》；總糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[14]；花青素含量測定：采用pH示差法[15]；總黃酮含量測定：參考程詩韔等[16]的方法；多酚含量測定：福林酚比色法[17]，結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示。

微生物指標測定：按照國標GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB29921—2021《預包裝食品中致病菌限量》分別檢測成品的菌落總數、大腸菌群及致病菌[18-20]。

1.3.4 感官評價

以10人組成品嘗小組，對黑枸杞乳酸菌發酵飲料的色澤、風味、口感、組織狀態進行評定，滿分10分。感官評分標準見表2。

表2 黑枸杞乳酸菌飲料感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards of black wolfberry Lactobacillus beverage

1.3.5 數據處理

采用Origin9.5和Design ExpertV8.0.6等軟件對試驗數據進行繪圖以及處理分析，每組試驗3次平行，P＜0.01代表差異極顯著，P＜0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黑枸杞乳酸菌發酵飲料工藝優化單因素試驗

2.1.1 接種量的確定

由圖1可知，當接種量為1.0%～2.0%時，感官評分和花青素含量隨著接種量的增加逐漸上升；當接種量為2.0%時，感官評分和花青素含量均達到最高，分別為49.60 mg/L和8.2分；當接種量＞2.0%之后，感官評分和花青素含量逐漸下降。因為過多的接種量會使飲料過度發酵導致其口感過酸影響評分。接種量低時發酵初期菌種繁殖慢，發酵不充分可能會導致花青素類物質溶出率低。如果接種量太高，那么乳酸的濃度就會很高，在發酵初期乳酸快速增加時就會導致乳酸在短暫的一段時間內大量消耗糖分，從而使其增加了發酵液中的水活性，產生過多的代謝物也可能會直接加速其對花青素的分解，從而降低其含量[21]。同時過高或者是過低的初始接種量均不太合適用于釀制發酵的飲料。因此，確定最佳接種量為2%。

圖1 不同接種量對乳酸菌飲料感官評分和花青素含量的影響Fig.1 Effect of different inoculum on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.2 固液比的確定

由圖2可知，當固液比在1∶40～1∶25（g∶mL）范圍內的增大，花青素含量和感官評分均隨之有所增高；當固液比為1∶25（g∶mL）時；花青素含量和感官評分均達到最大值，分別為48.04 mg/L和8.5分；隨著固液比的增加，可溶物固形物含量和其他的營養物質也隨之增加，利于乳酸菌生長；但當固液比過高時，發酵液的濃度過高，水分活度的降低和溶解氧的減少影響了乳酸菌的生長[21]。隨著固液比的增加，飲料的顏色會變得越來越深，當深度超過一定值時，色澤評分會極低，所以感官評分在達到最高點之后會下降。因此，確定最佳固液比為1∶25（g∶mL）。

圖2 不同固液比對乳酸菌飲料感官評分和花青素含量的影響Fig.2 Effect of different solid and liquid ratio on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.3 發酵時間的確定

由圖3可知，當發酵時間為4～6 h時，花青素含量和感官評分均隨之增高；當發酵時間為6 h時，花青素含量和感官評分均達到最大值，分別為50.77 mg/L和8.8分；當發酵時間＞6 h之后，花青素含量和感官評分均有所下降。這些菌種不斷利用發酵底物中的糖產生酸，積累乳酸并繼續產生酸，從而提高產品的酸度。乳酸菌的發酵不僅可以增加產品的酸度，而且對產品的風味和花青素的溶出也有很好的促進作用，因此感官評分和花青素含量也有所提高。發酵6 h后產酸過多口感變差感官評分開始逐漸下降，同時產生過多的代謝產物可能會導致其花青素分解含量降低。因此，確定最佳發酵時間為6 h。

圖3 不同發酵時間對乳酸菌飲料感官評分和花青素含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.4 裝液量的確定

由圖4可知，當裝液量為20%～40%時，花青素含量和感官評分均隨之增高；當裝液量為40%時，花青素含量和感官評分均達到最大值，分別為48.43 mg/L和8.9分；當裝液量＞40%之后，花青素含量以及感官評分均開始下降。這是因為裝液量過高會導致飲料口感過于寡淡，同時菌種的發酵與環境有著密切的關系。植物乳桿菌是一種異養厭氧型微生物，當瓶子里的氧氣耗盡時，它開始進行厭氧呼吸，水分活度和溶解氧的多少會影響乳酸菌的生長進而影響感官評分及花青素的含量[22]。因此，確定最佳裝液量為40%。

圖4 不同裝液量對乳酸菌飲料感官評分和花青素含量的影響Fig.4 Effect of different liquid loading volume on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.2 黑枸杞乳酸菌飲料發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 響應面設計及方差分析

根據單因素試驗結果，以接種量（A）、發酵時間（B）、固液比（C）和裝液量（D）為自變量，感官評分（Y）為因變量進行響應面試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

續表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對表3數據進行二次回歸方程擬合，二次多項回歸方程：

由表4可知，回歸方程模型的P值＜0.000 1，極顯著；失擬項P值為0.561 3＞0.05，不顯著，說明建立的回歸方程擬合良好。決定系數R2=0.994 3，表明99.43%的變化可以由這個模型來解釋。由F值可以看出，對感官評分的影響順序為發酵時間＞裝液量＞固液比＞接種量。由P值可知，一次項B、C、D，交互項AC、AD、BD，二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 各因素交互作用響應面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對影響黑枸杞乳酸菌飲料發酵工藝的4個因素進行交互分析，各因素交互作用對結果影響的響應面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對乳酸菌飲料感官評分影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of lactic acid bacteria beverage

該模型可用于擬合兩個因素之間相互作用的響應面圖，并且能夠進一步研究各因素之間的相互作用強度。由圖5可知，AC、AD和BD因素之間的相互作用是顯著的，這表現為橢圓的等高線形狀。AB、BC和CD因素之間的相互作用不顯著，等高線形狀為圓形。接種量與固液比、接種量與裝液量以及發酵時間與裝液量的響應面曲線比較陡峭，因此，對感官的影響最顯著，而接種量和發酵時間、發酵時間與固液比以及固液比與裝液量的響應面曲線比較平緩，響應值的變化隨其數值的變化較小，所以對感官評價的影響也較小。

2.2.3 驗證試驗

采用Design ExpertV8.0.6軟件對回歸模型進行分析，得到最佳發酵工藝條件為：接種量1.98%，發酵時間5.7 h，固液比1∶25.26（g∶mL），裝液量40.16%。在此條件下，感官評分的理論值為9.28分。為了便于實際操作，將最佳發酵工藝條件修正為：接種量2%，固液比1∶25（g∶mL），發酵時間6 h，裝液量40%。在上述條件下進行3次重復驗證試驗，黑枸杞發酵飲料的感官評分實際值為9.3分，與理論預測值相近，說明該模型與實際情況有較好的對應關系，可以用于優化黑枸杞發酵飲料的發酵工藝參數。

2.3 產品質量評價

感官指標：該產品無沉淀、呈均勻的紫色、酸甜細膩的口感、乳酸菌發酵的濃郁香氣；理化指標：成品中總糖含量為0.17 mg/mL，總酸含量為1.69 g/L，可溶性固形物含量為7%；微生物指標：細菌總數＜100 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

2.4 功能性成分分析

由圖6可知，黑枸杞汁經過植物乳桿菌發酵后的總酚含量高達0.988 mg/mL，較未經發酵的黑枸杞汁中總酚含量提升了11.34%，可能是因為酚類物質有兩種狀態形式分別為游離和結合狀態，結合狀態又分為不溶性共價結合酚和可溶性共價結合酚[23]，可溶性共價結合酚可與長鏈脂肪酸、長鏈醇等物質相連[24]，在乳酸菌發酵過程中，各種酶作用于底物，可使黑枸杞汁中的可溶性結合酚釋放，從而使總酚含量增加。接種乳酸菌發酵的產品中花青素含量要高于未接種的黑枸杞汁，這與高辰哲等[25]的結果一致，可能是因為乳酸菌發酵促進了花青素的溶出同時產生酸性環境使花青素更加穩定，具體機理還需進一步深入研究。未接菌的黑枸杞汁中總黃酮含量為0.066 mg/mL。經過發酵后，黑枸杞汁的總黃酮含量有所增加，但與未發酵相比含量增加不顯著（P＞0.05）。賴婷等[26]研究發現，植物乳桿菌的發酵可以將結合的類黃酮釋放為游離的類黃酮，從而增加總的類黃酮含量，這可能是導致本研究總黃酮含量增加的原因之一，具體變化的原因可能與酶的復雜作用和黃酮類本身的不穩定性有關。

圖6 黑枸杞汁發酵前后總酚、總黃酮及花青素含量測定結果Fig.6 Determination results of total phenols,total flavonoids and anthocyanin contents of black wolfberry juice before and after fermentation

3 結論

本研究選用黑枸杞作為試驗主要原料，通過植物乳桿菌發酵，采用單因素試驗以及響應面法優化得到黑枸杞乳酸菌飲料的最優發酵工藝條件為：固液比為1∶25（g∶mL），植物乳桿菌接種量2.0%，溫度37 ℃下發酵6 h，裝液量40%。在此優化條件下，黑枸杞乳酸菌飲料感官評分為9.3分，色澤均勻，酸甜可口，口感細膩柔和。功能性成分含量分析結果顯示，黑枸杞汁經接種發酵后得到的飲料中總酚、總黃酮和花青素含量均比未接種的黑枸杞汁有所上升，由此可知，通過工藝優化后不僅可以增加黑枸杞發酵飲料中的功能性成分含量并且使其擁有了較高的感官品質和乳酸菌的益生作用，提高了黑枸杞利用率的同時也滿足了人們對營養豐富、具有保健功效產品的追求，說明此優化后的產品可以為進一步開發黑枸杞發酵飲料提供參考依據。