牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝優化及品質變化跟蹤

王乃馨，李 超，苗敬芝，曹澤虹，李 文，邵 穎

（徐州工程學院 食品與生物工程學院 江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設試驗室，江蘇 徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappaL.）又名為大力子、東洋參等，自20世紀90年代開始就在我國作為經濟作物進行推廣種植。江蘇省徐州市豐縣、沛縣兩地是我國重要種植基地之一。作為一種藥食同源的植物種類，牛蒡營養豐富，其根狀莖中蛋白質、菊糖、精氨酸、天冬氨酸、鎂、鐵、鋅等礦物質元素及維生素C（vitamin C，VC）、維生素B6（vitamin B6，VB6）等含量較高[1]，還含有醛類、牛蒡酸類、硫炔類、多酚類等多種活性成分以及膳食纖維，被證實具有較好的抑菌功效和促進腸胃蠕動效果[2-4]。新鮮牛蒡脆嫩多汁，具有明顯的甜味，若挖掘采收后保存不當，嫩莖極易老化，發韌發硬，影響了作為蔬菜的口感。通過切片烘干等工藝制成的飲片不僅強化了原本略帶土腥味的缺陷，而且使口味偏苦，喪失原有的清甜風味。

酵素是一種新型微生物發酵品，可在一定程度上改良原料風味、避免口感變差的問題。因原料種類、發酵菌種、發酵環境等條件差異，酵素在生產過程中發生理化變化，使原料中大分子被分解或轉化成小分子代謝產物或者新的功能性物質[5-6]。酵素產品具有抗氧化[7-8]、提高免疫力[9-10]、降血脂、控體質量[11-12]、改善腸道功能及菌群[13-14]等功效。美國天然保健品市場2013年草藥類膳食補充劑銷售額就已經達9.94億美元，其中鳳梨酵素為875.59萬美元[15]。亞洲地區有成熟的酵素生產企業，如臺灣大漢酵素生物科技股份有限公司[16]、日本萬田和大高公司和佰納吉公司[17]。目前國內已有大量高校和企業在酵素發酵方面投入大量時間和資源進行研究。但由于前期工作仍在積累中，僅有中華人民共和國工業和信息化部在2018年發布的《植物酵素》[18]和《酵素產品分類導則》[19]這兩個企業標準和少量團體標準，尚無國家標準。我國酵素品質體系、檢測方法、制作方法有待進一步完善。目前，已有關于牛蒡酵素的研究報道。王乃馨等[20]以牛蒡為主要原料，混合多種蔬菜與水果制備酵素，通過響應面試驗設計優化了酵素配方，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力最高可達43.80 U/mL。張艷明等[21]以氣調糖化后的牛蒡、紫皮葡萄為原料，制備葡萄牛蒡酵素并確定了最佳發酵工藝參數。

本研究以牛蒡為主要原料，復合橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜等果蔬，以米曲霉（Aspergillus oryzae）為發酵菌種，制備牛蒡復合果蔬酵素。以超氧化物歧化酶（SOD）活性為評價指標，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗設計優化其發酵條件。并考察發酵過程中功效酶（SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶）活性以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-diazo-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除率的動態變化，以期為牛蒡復合果蔬酵素的生產工藝優化和綜合性開發提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛蒡：徐州綠姿農產品專業合作社；枸杞：寧夏活性農副產品購銷有限公司；橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜、枸杞、包菜、芹菜、白砂糖：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）：濟寧玉園生物科技有限公司；福林酚、DPPH、ABTS、酪蛋白、鄰二氮菲、抗壞血酸（均為生化試劑或分析純）：合肥博美生物科技有限責任公司；硼酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、雙氧水、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、甲醇、甲醛和碳酸鈉（均為分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SHA-C水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇恒農儀器廠；101A-2型數顯電熱鼓風干燥箱：上海浦東躍欣科學儀器廠；UV-2100紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZJP-A1430電熱恒溫培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；PHS-3E pH計：上海精密科學儀器有限公司；LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；3K30冷凍高速離心機：德國Sigma公司；SW-CJ-2FD垂直潔凈凈化超凈工作臺：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡復合果蔬酵素加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：橘子、蘋果、山楂、梨、火龍果、木瓜用純水清洗后去皮、去蟲眼、去核，包菜、芹菜去老葉、黃葉，均切成1 cm3左右的方塊，枸杞清洗瀝干后直接使用。新鮮牛蒡徹底清洗除去泥沙、細根須等雜物，浸泡在純水中快速去皮、切去老根，以避免切口快速褐變。迅速將牛蒡切成1 cm3左右小塊投入發酵罐。果蔬原料比例為牛蒡20%，山楂18%、枸杞11%、蘋果4%、其他水果蔬菜47%。調整料液比為1∶1.5（g∶mL）。

添加菌種、調整糖度：米曲霉孢子按一定比例加入發酵罐中，按原料質量15%的比例添加白糖，混合均勻。

控溫發酵：發酵罐體內應留有一定空間，密閉后進行控溫發酵。期間根據發酵情況需適時開罐放氣以防爆罐。至49 d完成發酵，跟蹤檢測發酵過程中酵素品質變化，實驗結束后，用400目濾布濾去發酵液中果蔬渣，再用0.2 μm孔徑濾膜過濾除菌后灌裝，于陰涼避光處儲存。

1.3.2 牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝優化單因素試驗

采用單因素輪換法，分別考察發酵溫度（29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃、33 ℃）、發酵時間（3 d、7 d、14 d、21 d、28 d）、菌種接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對牛蒡復合果蔬酵素SOD活性的影響。

1.3.3 牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以酵素的SOD活性（Y）為響應值，以發酵溫度（A）、發酵時間（B）和米曲霉孢子接種量（C）為主要考察因素，采用Design-Expert V10.0.3軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計，試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

（1）產品理化指標檢測

總酸的測定：參照國標GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》[22]；酒精的測定：采用酒精計；可溶性固形物測定：采用阿貝折光儀；pH值測定：采用pH計。

（2）酶活性

SOD活性的測定：參照國標GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》[23]；淀粉酶活性的測定：參照靳利娥等[24]的試驗方法；蛋白酶活性測定：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[25]；脂肪酶活性的測定：參照國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》的指示劑滴定法[26]。

（3）抗氧化性能

DPPH自由基清除率的測定：參考LUO W等[27]的試驗方法；羥自由基清除率的測定：參考ZHANG Z F等[28]的試驗方法；ABTS自由基清除率的測定：參考RE R等[29]的試驗方法。

1.3.5 數據處理與分析

每組試驗重復3次，試驗數據采用Excel2007、SPSS22.0分析軟件進行分析處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度對酵素品質影響

發酵溫度對牛蒡復合果蔬酵素SOD活性影響的結果如圖1所示，隨著發酵溫度在29～32 ℃范圍內的不斷升高，酵素中的SOD活性不斷提升，其原因可能是，發酵溫度越來越接近米曲霉生長的最佳溫度，利于酶促反應和微生物代謝發育[30]；發酵溫度為32 ℃時，SOD活性達到最高值，為（30.83±0.48）U/mL；繼續升高發酵溫度，SOD活性有所下降。只有將發酵溫度控制在合適的范圍才能促進微生物生長，利于酵素次級代謝產物的積累。因此，最終選取發酵溫度31 ℃、32 ℃、33 ℃進行響應面試驗。

圖1 發酵溫度對牛蒡復合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.2 發酵時間對酵素品質影響

發酵時間對牛蒡復合果蔬酵素SOD活性影響的結果如圖2所示，隨著發酵時間在3～21 d內的增加，SOD活性快速增加；發酵時間為21 d時，酵素中SOD活性達（46.08±2.84）U/mL；當繼續增加發酵時間，SOD活性增長變緩。因此，最終選取發酵時間14 d、21 d、28 d進行響應面試驗。

圖2 發酵時間對牛蒡復合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation time on superoxide dismutase activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu

2.1.3 接種量對酵素品質影響

接種量對牛蒡復合果蔬酵素SOD活性影響的結果如圖3所示，隨著接種量在1%～3%范圍內的不斷增加，SOD活性隨之提升，至接種量為3%時，SOD活性達到最高值，為（38.46±0.62）U/mL，再增加接種量，SOD活性略有下降。其原因可能是在發酵過程中，接種量較低時，發酵能力較低，接種量過高時，因初始發酵液中營養有限，不能滿足全部微生物生長所需的營養物質限制了其生長。因此，最終選取接種量1%、2%、3%進行響應面試驗。

圖3 接種量對牛蒡復合果蔬酵素超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculum on superoxide dismutase activity of burdockcompound fruit and vegetable Jiaosu

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面模型的建立與分析

結合單因素試驗結果，選取發酵溫度（A）、發酵時間（B）、接種量（C）3個因素為自變量，以SOD活性（Y）為響應值，設計Box-Behnken響應面試驗，經Design-Expert 10.0.3數據分析軟件對響應值數據進行多元回歸擬合分析，方差分析見表2。

各因素水平對牛蒡復合果蔬酵素SOD活性影響的二次回歸擬合方程如下：

由表2可知，牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝優化回歸模型的P值＜0.000 1，差異極顯著，失擬項的P=0.079 5＞0.05，差異不顯著，模型決定系數R2=0.999 0，調整決定系數R2adj=0.997 7，變異系數（coefficient of variation，CV）=0.43%。說明發酵條件優化試驗模型和實際情況擬合度良好，可以穩定重現，能夠對牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝條件進行預測。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

2.2.2 驗證試驗

經建模優化分析，得到牛蒡復合果蔬酵素SOD活性的最佳發酵工藝條件為：發酵溫度32.054 ℃、發酵時間25.789 d、接種量2.440%，該條件下SOD活性預測值為（48.233±0.480）U/mL。根據試驗所需條件及實際的可操作性，將牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝條件修正為：發酵溫度32 ℃、發酵時間26 d、接種量2.5%，在此條件下進行3次重復驗證試驗，對試驗結果取平均值，得牛蒡復合果蔬酵素的SOD活性實際值為（50.083±1.950）U/mL，與預測值差異不大，說明響應面法對牛蒡復合果蔬酵素發酵工藝優化具有實際可行性，可為后續實際生產應用提供理論基礎。

2.3 牛蒡復合果蔬酵素品質在發酵過程中的變化

2.3.1 發酵過程中酶活性變化

不同功效酶活性變化如圖4所示。發酵時間在0～13 d范圍內，淀粉酶活性逐漸增強，淀粉酶活性由（25.06±1.34）U/mL升至最高值（68.55±1.20）U/mL，隨著發酵時間的延長，淀粉酶活性基本穩定在44 U/mL左右；發酵時間在0～26 d范圍內，SOD活性由（24.17±0.80）U/mL升至最高值（52.09±1.02）U/mL，隨著發酵時間的延長，SOD活性基本穩定在48 U/mL左右；在整個發酵過程中，蛋白酶活性偏低，當發酵時間在0～5 d范圍內，蛋白酶活性由最初的（12.16±1.24）U/mL升至最高值（18.55±0.81）U/mL，隨著發酵時間的繼續延長，蛋白酶活性維持在緩慢下降狀態；發酵時間在0～19 d范圍內，脂肪酶活性由最初的（2.67±0.67）U/mL升至（6.78±0.81）U/mL，隨著發酵時間的延長，脂肪酶活性約穩定在7 U/mL。各種酶活性在發酵過程中存在差異，但均呈現先增加后減少然后基本穩定這一變化規律，與相關研究結果一致[31-32]。通過發酵處理可以明顯提升部分功能酶活力，酶活性較好的發酵時間為13～26 d。部分研究也證明了當植物酵素發酵到后期時，除了部分微生物代謝產物、次生代謝產物、小分子物質緩慢積累，其他活性或成分一般不斷減少[7，20]。

圖4 發酵過程中牛蒡復合果蔬酵素的不同酶活性變化Fig.4 Changes of different enzyme activities of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.2 發酵過程中抗氧化活性變化

抗氧化活性變化如圖5所示，在發酵過程中，不同自由基清除率總體呈現先上升后趨于穩定或略微降低的規律。當發酵時間在0～26 d的范圍內，ABTS自由基清除率由最初（51.27±0.65）升至（68.71±0.41）%，隨著發酵時間的延長，ABTS自由基清除率有所下降；當發酵時間在0～21 d的范圍內，DPPH自由基清除率由最初（47.61±0.45）%上升至（60.57±0.25）%，隨著發酵時間的延長，DPPH自由基清除率下降；當發酵時間在0～26 d的范圍內，羥自由基清除率由最初（45.08±0.25）%上升至（56.36±1.06）%，隨著發酵時間的延長，羥自由基清除率下降。通過發酵，均可以在不同程度提升這三種自由基的清除率。但各種自由基清除率的變化并不完全與SOD活性的變化一致，可能是其他成分影響了抗氧化效果。因此，自由基清除率較好的發酵時間為20～26 d。

圖5 發酵過程中牛蒡復合果蔬酵素的抗氧化性變化Fig.5 Changes of antioxidant activity of burdock compound fruit and vegetable Jiaosu during fermentation

2.3.3 牛蒡復合果蔬酵素的理化指標及感官評價

牛蒡復合果蔬酵素發酵49 d后，發酵液中總酸含量為（4.78±0.59）mg/mL，pH值為（3.32±0.42），可溶性固形物含量為（5.27±0.71）%，酒精度為（1.50±0.73）%vol。發酵產品顏色呈淡黃褐色，基本透明，口感清爽微酸，具有略帶青椒氣味的果蔬風味。

3 結論

以超氧化物歧化酶（SOD）活性為評價指標，分別進行單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗設計優化其發酵工藝。結果表明，最佳發酵工藝條件為：發酵溫度32 ℃，發酵時間26 d，接種量2.5%，在該條件下，SOD活性達（52.09±1.02）U/mL。延長發酵時間至49 d，其功能酶（SOD、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）活性和DPPH、ABTS、羥自由基清除率變化均呈先上升后下降的趨勢。當發酵完成后，總酸、可溶性固形物、酒精度分別為（4.78±0.59）mg/mL、（5.27±0.71）%、（1.50±0.73）%vol，呈淡黃褐色，口感清爽微酸。相比自然發酵酵素動輒以月、年為單位的長周期，以天為單位的控制發酵是具有一定可行性的，能極大降低工業化發酵生產中時間成本和貯存壓力。