大氣細顆粒物對HepG2細胞氧化應激的影響

林司杭，謝菁菁，林蕾蕾，邱文可，周林，曹雯娟，李明*

（1.廣東藥科大學臨床醫學院；2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006）

隨著近年來空氣污染日益嚴重，大氣顆粒物已成為威脅人類健康的重要因素，特別是空氣動力學直徑小于2.5 μm 的細顆粒物（fine particulate matter,PM2.5）的危害性尤其嚴重[1]。PM2.5 不僅可以在肺泡沉積干擾呼吸系統的功能，甚至可通過肺部毛細血管等途徑進入循環系統，引起肺外器官疾病[2]。最近流行病學和來自臨床橫斷面的研究表明PM2.5是肝臟疾病的重要致病因素[3]，特別是與非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）密切相關，如我國學者Sun等[3]分析了58026 名臺灣地區居民的調查數據后發現PM2.5濃度每增加1 μg/mL，NAFLD 發病率上升1.06%（95%CI：1.04～1.08）[4]，來自對國外居民的調查也得到了類似的結論[5]。同時，有動物實驗也顯示長期吸入PM2.5 可加速NAFLD 的發生[6]。我國是世界上大氣污染最嚴重的國家之一，PM2.5 的濃度甚至超過世衛組織標準的幾十倍，這可能是導致我國NAFLD 發病率日益增高的原因之一。因此，研究PM2.5 的肝毒性，揭示其致肝病機理不僅有助于認識大氣污染對健康的危害性，而且能加深對NAFLD 發病原因的了解，具有重要意義。

NAFLD 發病機制復雜，其中以“二次打擊學說”被廣泛認可[7]。該學說認為“初次打擊”是指肝內胰島素抵抗和脂肪儲積，隨后大量游離脂肪酸在肝臟堆積，導致肝細胞過度炎癥反應、氧化應激增強和脂質過氧化造成“二次打擊”，引起肝臟的壞死性炎癥和纖維化，其中氧化應激被認為是二次打擊中的主要致病機制[8]。許多研究發現NAFLD 患者肝臟會發生氧化應激，而氧化應激會造成脂質過氧化，二者共同作用引起肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡，最終導致肝纖維化[9]，抗氧化藥物對NAFLD 具有保護作用也證實了氧化應激在NAFLD 發生發展中的作用。因此，本文采用不同濃度的PM2.5 對肝HepG2 細胞進行染毒，檢測細胞氧自由基（reactive oxygen species, ROS）和脂過氧化產物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量的變化，以及細胞抗氧化相關蛋白如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和過氧化氫酶(catalase,CAT) 的表達情況，分析PM2.5 對肝細胞氧化應激狀態的影響，探討PM2.5 引起NAFLD 的機制。

1 材料與儀器

1.1 試劑與儀器

DCFH-DA（江蘇凱基生物技術股份有限公司），Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa 公司）；總SOD 檢測試劑盒和MDA 檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；定量PCR 儀器（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 PM2.5 采集

參照Ye 和本室所建立的方法在廣州城區采集大氣中的PM2.5，加入PBS 制備成PM2.5 樣品混懸液于-80 ℃保存備用[10-11]。

2.2 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2 細胞購自武漢大學細胞庫。細胞按照說明書，用含10%胎牛血清和1%青鏈雙抗的DMEM 完全培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養，待細胞達到80%～90%融合后進行傳代，取對數生長期細胞用于后繼實驗。

2.3 DCFH-DA 熒光探針法檢測細胞內ROS 水平

按2×105/孔將HepG2 細胞種于6 孔培養板中，待細胞完全貼壁后棄去培養基。實驗分為陰性對照組和低、中、高劑量PM2.5 染毒組（PM2.5 質量濃度分別為12.5、25、50 μg/mL）。根據分組用PM2.5處理4 h 后，加入10 μmol/L DCFH-DA 避光孵育1.5 h，PBS 洗滌3 次后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.4 細胞內MDA 和SOD 含量的測定

按2×105/孔將HepG2 細胞接種于6 孔板中培養，待細胞長到50%融合，按照步驟“2.3”分組并處理細胞，6 h 后分別根據試劑盒說明書要求收集樣品，依照操作步驟檢測細胞MDA和總SOD的含量。

2.5 qRT-PCR 法檢測SOD1、SOD2 和CAT mRNA的表達

按2×105/孔將HepG2細胞接種于6孔板中培養后，按照步驟2.2 進行分組并處理細胞。12 h 后用Trizol試劑從HepG2細胞中提取總RNA,測定RNA 濃度后使用反轉錄試劑盒合成cDNA作為模板進行RT-PCR檢測。反應條件為：95℃預變性30s；然后95℃變性5s，60 ℃退火33 s，72 ℃延伸30 s，循環數為40 個循環。所有樣品均以β-actin 為內參，結果用2-ΔΔCt法計算基因表達變化。引物序列如下：β-actin上游引物：5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′；SOD1 上游引物：5′-ATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGC-3′，下游引物：5′-TTATTGGGCGATCCCAATTACACCACAAGCC-3′；SOD2上游引物：5′-CTCCCCGACCTGCCCTACGAC-3′，下游引物：5′-TGCAGGTAGTAAGCGTG-3′；CAT 上游引物：5′-TGAGGTTGAACAGATAGC-3′，下游引物：5′-CACAGGTATATGAAGATAATTG-3′。

2.6 統計方法

數據以表示，統計學分析采用Graphpad Prism 8 軟件進行，各組間差異采用方差分析（ANOVA）進行均數間多重比較，P<0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PM2.5對HepG2細胞內ROS的影響

結果如圖1 顯示，與陰性對照組比較，PM2.5 染毒組細胞中ROS 的熒光強度顯著增強（P<0.05），且隨著PM2.5濃度增大而增強。由此說明PM2.5可引起HepG2細胞ROS生成增多。

圖1 PM2.5對HepG2細胞ROS生成的影響（DCFH-DA 熒光探針法，200×，n=3）Figure 1 Effects of PM2.5 on ROS production in HepG2 cells（DCFH-DA fluorescent probe,×200,±s,n=3)

3.2 MDA和SOD檢測結果

與陰性對照組相比，PM2.5 可使細胞內SOD 的水平顯著下降(圖2A)，同時使MDA的水平顯著升高(圖2B)，且二者與陰性對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。說明PM2.5 不僅使細胞脂過氧化物MDA 生成增多，上調HepG2 細胞的氧化水平，同時下調細胞內主要的抗氧化酶SOD 含量，抑制肝細胞的抗氧化能力，最終造成肝細胞氧化應激狀態。

圖2 PM2.5染毒對HepG2細胞SOD和MDA含量的影響Figure 2 Effects of PM2.5 on the levels of SOD and MDA in HepG2 cells(±s,n=3)

3.3 PM2.5 對HepG2 細 胞SOD1、SOD2 和CAT mRNA表達的影響

與陰性對照組比較，PM2.5染毒組SOD1、SOD2和CATmRNA 表達均明顯下調，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。本結果與結果“3.2”中有關SOD 的研究結果一致，表明PM2.5 對HepG2 細胞氧化應激的影響不僅在于促進ROS 生成，還與降低細胞抗氧化能力有關。

圖3 PM2.5對HepG2細胞SOD1、SOD2和CAT mRNA表達的影響Figure 3 Effects of PM2.5 on the mRNA expression of SOD1、SOD2和CAT in HepG2 cells(±s,n=3)

4 討論

根據世界衛生組織的報告，每年有近300 萬人死于空氣污染相關的疾病[12]。PM2.5 由于粒徑小，比表面積大，在大氣中懸浮時間長的物理特性和容易富集多種有機物及重金屬的化學特性，使之更容易進入機體內并引發疾病[13]。越來越多的證據表明，長期暴露于PM2.5 可能是肝臟疾病發病率和死亡率增高的一個重要風險因素[14]。除前述流行病學研究證實PM2.5 暴露與NAFLD 相關外[4]，動物實驗也證實了二者的聯系，如Jian[15]等發現氣管內滴注PM2.5可誘導小鼠肝臟出現脂肪變和非酒精性脂肪性肝炎等NAFLD 表現，該結果與其他研究結果一致[16-17]。因此，PM2.5 被認為是一種新的NAFLD 致病危險因素。

體外細胞模型是研究PM2.5 毒性的常見方法。多個研究在體外培養肝細胞，觀察了PM2.5 染毒對肝內細胞的毒性，如有研究用代謝組學的方法證實PM2.5體外染毒導致肝細胞代謝紊亂[11,18]；還有研究報道PM2.5 可誘導肝細胞凋亡[19]；我們前期也發現證實PM2.5 通過激活SREBP-1c 和LXR-α引起肝細胞脂肪堆積[10]。

氧化應激在NAFLD 的起始和進展中均發揮著至關重要的作用。常見肝毒性物質引起肝損傷都與氧化應激有關，如乙型肝炎病毒、氰酸鹽、腸源性肝毒物等導致NAFLD 都與ROS 增多相關[20-21]。同時研究還顯示抑制ROS 對NAFLD 具有保護作用，多種中藥發揮護肝作用都與抑制肝臟的氧化應激有關[22-23]。這充分說明了氧化應激在NAFLD“二次打擊”中的關鍵作用。

為了證實PM2.5 對肝細胞氧化應激的影響，本研究首先用DCFH-DA 熒光染色法觀察了PM2.5 染毒肝細胞ROS 的生成情況，結果顯示PM2.5 染毒后HepG2 細胞內可見大量綠色熒光，證實了肝細胞受到PM2.5 攻擊后會產生大量的ROS。實驗還發現PM2.5 使肝細胞內MDA 明顯增多。MDA 是ROS與生物膜磷脂中的多價不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應生成的脂過氧化產物，不僅反映細胞受損情況，而且MDA 可加速氧化應激反應，協同ROS干擾肝臟內細胞的正常功能。提示PM2.5 染毒促進ROS的生成。

SOD 是細胞內主要的抗氧化物質，其可及時清除機體產生的ROS，使得細胞的氧化/抗氧化維持在一種動態平衡狀態[24]。抗氧化物質的減少是細胞氧化應激的原因之一。本研究發現PM2.5干預后細胞內主要的抗氧化損傷酶類SOD 含量顯著減少，并進一步采用定量PCR 分析其編碼基因SOD1和SOD2的表達情況，結果顯示PM2.5 染毒后肝細胞SOD1和SOD2的表達也明顯下降，此外結果還顯示細胞內另一個主要的抗氧化酶CAT的基因表達在PM2.5干預后也明顯降低。這些結果提示PM2.5不僅促進ROS 生成，還可以抑制細胞的抗氧化能力，最終造成肝細胞氧化應激，這可能與PM2.5 引起NAFLD有關。雖然本實驗僅從體外觀察了PM2.5對肝細胞氧化應激的影響，但是最近有研究顯示PM2.5 可引起高脂飲食小鼠肝臟ROS 生成增多從而加速NAFLD 的疾病進程[17]，也證實了我們的實驗結果，因此推測氧化應激可能是PM2.5 引起NAFLD 的主要機制之一，后繼我們將建立動物模型，以氧化應激為靶點研究PM2.5 的具體信號途徑并尋找防治PM2.5肝毒性的藥物。

綜上所述，本研究在體外初步證實PM2.5 染毒引起HepG2 細胞氧化應激。此外，前期我們和其他研究者發現PM2.5 可引起血管內皮細胞和肺上皮細胞等多種細胞的氧化應激反應[26-27]，因此引起機體氧化應激可能是PM2.5 導致包括NAFLD 在內的多種疾病的共同途徑，為后繼實驗將以氧化應激為靶點尋找抗PM2.5 毒性的防治方法提供了基礎。