2 型糖尿病足不同感染程度對氧化應(yīng)激的影響及病原菌分布和耐藥分析

王昭俐，張永強(qiáng)，馬軍民，崔凡*

（蕪湖市第一人民醫(yī)院1.檢驗科；2.骨科；3.內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241000）

糖尿病足是糖尿病下肢遠(yuǎn)端神經(jīng)異常或不同嚴(yán)重程度血管病變導(dǎo)致的足部感染、組織層破壞或潰瘍。糖尿病患者發(fā)生糖尿病足幾率為15%～25%，尤以2 型糖尿病足為主。隨著近年來人口老齡化加劇和糖尿病人群擴(kuò)大，2 型糖尿病足感染率也呈上升趨勢[1]。糖尿病足感染危害性大，導(dǎo)致截肢風(fēng)險提高50%左右，合并感染患者較非感染患者死亡風(fēng)險更高，約為2 倍。明確感染后病原菌種類和菌株耐藥性對臨床治療具有指導(dǎo)作用，同時便于預(yù)后觀察和改善[2]。氧化應(yīng)激指標(biāo)被證實能評估糖尿病感染嚴(yán)重程度，但其表達(dá)水平與2 型糖尿病足感染嚴(yán)重程度是否有關(guān)并不明確[3]。為進(jìn)一步明確2 型糖尿病不同感染程度的氧化應(yīng)激指標(biāo)變化、病原菌分布和耐藥情況，從而指導(dǎo)今后感染預(yù)防、診斷、治療等工作，開展本研究并報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織在1999 年推出的2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合美國感染協(xié)會在2012年推出的糖尿病足感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，或發(fā)生2 型糖尿病足但并未感染。排除標(biāo)準(zhǔn)[4-5]：其他類型糖尿病；長期使用免疫抑制劑；自身免疫性疾病；疑似惡性潰瘍；精神疾病史；嚴(yán)重心肝腎腦疾病。根據(jù)糖尿病足Wagner 分級法對糖尿病足患者感染分級[6]：足部潰瘍表淺，無臨床感染征象為Wagner 1級；潰瘍較深，合并組織感染，無深部膿腫或骨髓炎為Wagner 2 級；深部潰瘍，有骨髓炎或膿腫為Wag‐ner 3 級；足背、足跟、腳趾等局限性壞疽，表現(xiàn)為缺血性壞疽，一般合并神經(jīng)病變，為Wagner 4 級；全足壞疽，為Wagner 5 級。其中Wagner1 級為無感染的對照組；Wagner 2級為輕度感染組，Wagner 3級為中度感染組，Wagner 4級、5級為重度感染組[7-8]。

1.1.2 資料 回顧分析蕪湖市第一人民醫(yī)院2017年7月－2020 年4月60 例無感染的2 型糖尿病足患者資料，歸為未感染組，2 型糖尿病病程為5～17 年。另選157 例發(fā)生感染的2 型糖尿病足患者資料；2 型糖尿病病程為5～20年；均檢測血清氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、血清超氧化物歧化酶（superoxide dis‐mutase,SOD）、褪黑素（MT）；根據(jù)感染程度分為輕度感染組、中度感染組、重度感染組，分別為66 例、51例、40例，糖尿病病程分別為6～20年、6～19年、5～19 年。上述各組性別、年齡、2 型糖尿病病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具可比性，見表1。本院倫理委員會批準(zhǔn)本研究。

表1 各組一般資料對比Table 1 Comparison of general data of each group(±s)

表1 各組一般資料對比Table 1 Comparison of general data of each group(±s)

組別未感染組輕度感染組中度感染組重度感染組χ2/F值P 值n 60665140- -性別（男/女）25/3539/2728/2323/170.1070.8924平均年齡/a 64.12±3.1264.87±3.0963.98±4.5664.99±3.650.4190.59252型糖尿病病程/a 8.98±1.339.06±1.548.87±1.398.76±1.090.3760.7051

1.2 方法

1.2.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 患者于檢測前一晚常規(guī)禁飲禁食，次日清晨采空腹外周靜脈血3 mL，離心處理取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清SOD、MT、MDA 水平，使用上海臻科生物科技有限公司試劑盒。

1.2.2 病原菌檢測 取樣：無菌生理鹽水對潰瘍局部清創(chuàng)，采集深部病損組織放于無菌塑料樣品杯中，2 h內(nèi)送至微生物實驗室。標(biāo)本處理：研磨標(biāo)本，三區(qū)劃線法接種于血/中國藍(lán)分隔瓊脂平板上，平板置入含5%CO2的35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。標(biāo)本涂片、革蘭染色，顯微鏡觀察病原菌，判斷種類；對于可疑厭氧菌感染標(biāo)本，研磨后的標(biāo)本接種在血瓊脂平板上，置入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋內(nèi)，35 ℃培養(yǎng)。病原菌初篩和鑒定：培養(yǎng)24 h 后，用接種環(huán)挑取菌落涂片、革蘭染色，顯微鏡觀察病原菌形態(tài)，單一有意義病原菌生長直接鑒定病原菌，行藥敏試驗；混合感染標(biāo)本先分離提純有意義病原菌，鑒定病原菌，行藥敏試驗。革蘭陽性菌接種在血平板上，陰性菌接種在中國藍(lán)平板上；真菌接種在沙保羅瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，鑒定病原菌，進(jìn)行藥敏試驗。培養(yǎng)7 d 無病原菌生長為陰性。挑選單獨純化菌落，使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-2 COMPACT 檢定儀鑒定；革蘭陽性菌菌懸液濃度：0.5～0.63 麥?zhǔn)蠁挝唬桓锾m陰性菌菌懸液濃度：0.5～0.63麥?zhǔn)蠁挝唬粎捬蹙鞍魲U菌菌懸液制備濃度：2.7～3.3麥?zhǔn)蠁挝弧?/p>

1.2.3 藥敏試驗 革蘭陽性菌和陰性菌均使用全自動藥敏分析儀法，分別使用AST-GP67 卡、ASTGN09 卡。真菌選擇微量稀釋法檢測和ATB FUN‐GUS 3 藥敏試驗；根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的藥敏試驗方法和藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果；敏感率=敏感菌株株數(shù)/該類菌株總株數(shù)×100%。多重耐藥菌為同一菌株耐藥≥2 種，統(tǒng)計不同感染程度組所有檢出菌株多重耐藥情況。

1.3 觀察指標(biāo)

各組血清MDA、SOD、MT 水平，菌株檢出數(shù)和病原菌類型占比，多重耐藥菌占比，主要病原菌對臨床常用藥物敏感率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“”表示，t/F檢驗；計數(shù)資料以%表示，χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同感染級別組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

血清MDA 從低至高依次為未感染組、輕度感染組、中度感染組、重度感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；血清SOD、MT 從高至低依次為未感染組、輕度感染組、中度感染組、重度感染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.001）。見表2。

表2 不同感染級別組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)對比Table 2 Comparison of serum oxidative stress indexes in different infection levels(±s)

表2 不同感染級別組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)對比Table 2 Comparison of serum oxidative stress indexes in different infection levels(±s)

組別未感染組輕度感染組中度感染組重度感染組F 值P 值n 60665140- -MDA/（μmol·mL-1）25.13±2.1827.54±2.8730.43±3.1933.67±3.7618.98<0.001 SOD/（nU·mL-1）78.65±6.4373.43±6.1267.54±5.9460.17±4.8921.54<0.001 MT/（ng·L-1）48.04±3.4340.54±3.1936.32±2.4329.82±3.8723.09<0.001

2.2 不同感染級別組病原菌檢測結(jié)果比較

其中輕度感染以革蘭陽性菌為主，中度和重度感染以革蘭陰性菌為主，輕度感染組病原菌分布與中度和重度感染組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P<0.05）。見表3。

表3 不同感染級別組病原菌檢測結(jié)果對比Table 3 Comparison of detection results of pathogens in different infection levels[n(%)]

2.3 不同感染級別組主要病原菌對藥物敏感率分析

輕度感染組多重耐藥菌占20.83%（15/72）；中度感染組多重耐藥菌占29.69%（19/64），重度感染組多重耐藥菌占39.62%（21/53），其中輕度感染組與重度感染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2=6.145（P=0.0464）。各組藥敏檢測結(jié)果見表4-6。

表4 輕度感染組革蘭陽性菌對藥物敏感率分析Table 4 Analysis of drug sensitivity of Gram-positive bacteria in mild infection group（n=17）

表5 中度感染組革蘭陰性菌藥敏度分析Table 5 Analysis of drug sensitivity of Gram-negative bacteria in moderate infection group（n=34）

3 討論

糖尿病足是導(dǎo)致糖尿病患者住院和下肢截肢、死亡的重要原因，因為患者機(jī)體免疫力低下，周圍神經(jīng)、血管缺血性病變以及足部皮膚容易受損，損傷皮膚表面極易感染且創(chuàng)面久不愈合[9]。由于高血糖抑制白細(xì)胞趨化，因此發(fā)生感染后病原菌容易擴(kuò)散，病情惡化，故需盡早抗感染治療的。目前我國糖尿病足病原菌分布和耐藥性有明顯地域性差異，因此分析當(dāng)?shù)靥悄虿∽愀腥竞蟛≡湍退幮允种匾猍10-11]。此外糖尿病足發(fā)病和進(jìn)展均與氧化應(yīng)激有關(guān)，因此有必要觀察感染后應(yīng)激指標(biāo)變化。

SOD、MT、MDA 是目前臨床應(yīng)用最多的酶類和非酶類血清氧化應(yīng)激指標(biāo)，能較準(zhǔn)確、客觀地反映患者機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。本研究中血清MDA從低至高依次為未感染組、輕度感染組、中度感染組、重度感染組；血清SOD、MT 從高至低依次為未感染組、輕度感染組、中度感染組、重度感染組（P<0.05），說明2 型糖尿病足感染導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激異常。考慮是因為：①氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，促使內(nèi)皮細(xì)胞衰老，導(dǎo)致血管內(nèi)屏功能紊亂，引發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥，參與糖尿病足潰瘍形成和感染[13]。②氧化應(yīng)激反應(yīng)一定程度上誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促使炎性因子持續(xù)釋放，導(dǎo)致潰瘍面長期處于炎性期，周圍正常細(xì)胞壞死凋亡，延遲愈合，增加感染風(fēng)險[14]。③氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胰島素缺乏（胰島素對感覺神經(jīng)元、軸突受體有營養(yǎng)作用）導(dǎo)致神經(jīng)損傷，導(dǎo)致潰瘍面持久不愈，增加感染風(fēng)險[15]。

本研究結(jié)果顯示輕度感染以革蘭陽性菌為主，中度和重度感染以革蘭陰性菌為主，輕度感染組病原菌分布與中度和重度感染組比較均有差異（P<0.05）。輕度感染組革蘭陽性菌主要為金黃色葡萄球菌；中度感染組革蘭陰性菌主要為大腸埃希菌；重度感染組革蘭陰性菌主要為陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌、弗氏檸檬酸桿菌。本研究結(jié)果與殷慧慧等[16]研究報道的2 型糖尿病輕度感染以金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌為主，中度和重度感染以大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等革蘭陰性菌為主的結(jié)論相似。均體現(xiàn)為糖尿病足感染加重，病原菌從以革蘭陽性菌為優(yōu)勢菌逐漸變?yōu)楦锾m陰性菌為優(yōu)勢菌的趨勢。李艷艷等[17]報道上海糖尿病足感染主要為金黃色葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌；毛喆[18]等指出浙江糖尿病足感染以糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌為主，與本研究結(jié)果有明顯差異，這與近年來關(guān)于2 型糖尿病足感染病原菌Mate 分析指出的國內(nèi)糖尿病足主要病原菌存在明顯地區(qū)差異的結(jié)論一致。考慮各地2型糖尿病足感染病原菌不同是因為生活習(xí)慣差異、氣候環(huán)境差異、臨床常用抗菌藥差異等導(dǎo)致[19]。此外本研究中，隨著感染從輕度變?yōu)橹囟榷嘀啬退幘急葟?0.83% 升高到39.62%，提示感染加重，多重耐藥幾率更高。本研究中輕度感染組革蘭陽性菌對萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素、二甲胺四環(huán)素敏感率均>90%；中度感染組革蘭陰性菌對亞胺培南、丁胺卡那霉素敏感率均>90%；重度感染組革蘭陰性菌對亞胺培南敏感性>90%。可見感染加重，臨床常用藥物中能達(dá)到90%藥敏感率的藥物減少。考慮這種現(xiàn)象與中重度感染患者可能有糖尿病足史、住院史，或有抗菌藥使用史有關(guān)[20]。

基于以上結(jié)果和既往相關(guān)研究，在糖尿病足首次確診時可根據(jù)Wagner 分級法確定糖尿病嚴(yán)重程度、應(yīng)激反應(yīng)情況等進(jìn)行治療，結(jié)合臨床特征和當(dāng)?shù)夭煌瑖?yán)重程度感染后主要病原菌分布和耐藥性指導(dǎo)抗菌藥使用。在清創(chuàng)、控制血糖、改善循環(huán)、調(diào)劑應(yīng)激反應(yīng)等基礎(chǔ)上，對輕度感染患者可使用針對革蘭氏陽性菌的窄譜抗菌藥等治療；中度感染給予左氧氟沙星等廣譜抗菌藥治療；重度感染給予頭孢吡肟、亞胺培南等治療，此外考慮重度感染存在多重耐藥，需要聯(lián)合用藥，必要時結(jié)合外科手術(shù)等方法進(jìn)行治療。