茚二酮顯現潛在手印的應用研究進展

陸一帆，羅亞平

(中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038)

茚二酮是一種雙環芳烴β-二酮類化合物，應用于科學、工業眾多領域，在有機合成、醫藥和染料生產中常用作基質。茚二酮衍生物及其類似物在醫學、化學和司法等領域具有重要的應用價值。1997年，Ramotowski在Jouille及其同事與美國特勤局提出以茚二酮作為滲透性客體手印顯現試劑[1]。茚二酮是茚三酮的類似物，顯現汗潛手印的原理是與汗液中的氨基酸、多肽、蛋白質發生反應，氨基酸分子中的α-氨基和α-羧基在酸性和加熱條件下由于茚二酮作用發生氧化脫氫，與胺反應形成亞胺，再脫羧降解生成2-氨基-1-茚酮，然后與過量茚二酮進一步發生反應，生成橙色熒光絡合物，自然光下呈現淺粉色(焦利粉)，在綠光激發下透過橙色濾光片呈明亮的橙黃色[1-3]，可在激光或多波段光源照射下觀察并拍照提取。之后，各國研究人員對茚二酮作為手印顯現試劑的效果進行了研究并成功應用于實際案件。

1 茚二酮顯現潛在手印配方

潛在手印顯現技術多種多樣，茚二酮是滲透性客體表面汗潛手印的常用顯現試劑之一。顯現需將茚二酮粉末配置成工作液，浸潤客體后晾干，在一定條件下靜置或加熱[4-5]。目前各機構和實驗室工作液配方和顯現條件各不相同，可能歸因于氣候環境條件的差異和紙漿類型、添加劑種類以及紙張回收利用水平的區別。針對澳大利亞、新西蘭、美國、歐洲的主要手印研究團隊和警察實驗室的一項調查顯示，各地茚二酮配方差異較大(見表1)。

1.1 茚二酮

用于手印顯現的茚二酮主要指1,2-茚二酮，研究人員也對茚二酮衍生物的作用進行了探索。鄰近的環二酮類化合物也可用于潛在手印顯現，但是不及1,2-茚二酮及其許多單、二甲氧基衍生物的熒光性能優越。4,5-二甲基-1,2-茚二酮在靈敏度和顯現牛皮紙上潛在手印的熒光效果方面優于1,2-茚二酮。趙雅彬團隊合成并應用了5,6-二甲氧基-1,2-茚二酮，實驗結果顯示其效果優于1,2-茚二酮，也有研究人員認為1,2-茚二酮與5,6-二甲氧基-1,2-茚二酮均能較好顯現印刷品上的新鮮手印，效果大致相同。

表1 各地茚二酮配方[5]Table 1 Indanedione formulations in various places[5]

1.2 極性溶劑

為保證工作液的穩定性，配置茚二酮工作液需加入極性溶劑。Wiesner研究了工作液pH值對顯現的影響，認為不含乙酸的配方效果更好[6]。然而，多數機構認為乙酸是可以增強手印熒光的重要成分[7]。

甲醇在溶解茚二酮的過程中會產生半縮酮，該結構的共軛程度較低，會使溶液呈現出更淺的顏色甚至無色(茚二酮粉末為黃色，不含醇類的工作液呈淡黃色)，含甲醇的茚二酮試劑在480 nm處的吸光度峰值顯著降低也證實了這一點[7-8]。半縮酮可以促進茚二酮與氨基酸的反應正向進行，從而提髙含甲醇配方的顯現效率和手印的熒光亮度，但是阻礙了焦利粉反應產物的形成，顯現出的手印痕跡在自然光下呈現極淺的粉色。乙醇在溶解茚二酮的過程中也會產生半縮酮，因產量較小對反應的促進作用不大，但是乙醇極性小，可以保護檢材，相反甲醇極性較大，過量甲醇會導致手印紋線擴散，影響后續鑒定工作[9]。

1.3 載體溶劑

載體溶劑在茚二酮工作液中占比最高，《茚三酮顯現潛在手印方法的評估》[10]中指出，必須優先選用對健康和環境危害盡可能小的載體溶劑，所以應避免使用環己烷和石油醚等。各類相對安全環保的載體溶劑也被陸續引入茚二酮工作液。

研究人員提出用不易燃且相對環保的HFE 7100(九氟丁基甲醚)、HFC 4310mee(1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-十氟戊烷)和HFE 71de(HFE 7100和1,2-二氯乙烯的混合物)替代原載體溶劑。各新興載體溶劑對靈敏度、穩定性和熒光亮度的影響存在爭議，多數研究認為HFE 7100=HFE 71de>HFC 4310mee>石油醚。但是Bicknell的實驗顯示石油醚比HFE 7100效果好，焦利粉顏色更深、熒光亮度更強并且成本更低[11]。HFE 71de相比其他兩種溶劑會溶解沖散更多油墨，對書寫、印刷的檢材造成破壞，并且含有1,2-二氯乙烯(對人體有毒性)[12]，目前HFE 7100是綜合評價最高的茚二酮載體溶劑。

由于含氟溫室氣體造成的全球變暖效應，歐盟考慮對部分氫氟酸溶劑實施禁令，關于含氟溫室氣體的歐洲議會和歐盟理事會法規(EU)NO 517/2014已于2015年1月1日正式實施，HFE 7100作為附件二所列具有全球變暖潛能值的“其他氟化溫室氣體”，雖未被禁用，但生產、進出口等都受到了一定限制。Olszowska等團隊已證明全球變暖潛能值更低的Solstice-PF替代HFE 7100具有可行性[13-14]。

1.4 鋅化

英國、澳大利亞、美國等都提出鋅鹽進一步處理茚二酮工作液浸潤過的檢材可以提高靈敏度，也可以增強手印熒光[11,15-16]。澳大利亞的研究人員嘗試直接在茚二酮工作液中加入鋅鹽(氯化鋅或硝酸鋅)以簡化鋅化步驟，也取得了良好的手印顯現效果：靈敏度更高、熒光亮度更強[12]，鋅鹽還可以提高試劑的穩定性，降低顯現對環境相對濕度的依賴[17-18]。茚二酮和潛在手印氨基酸之間的反應對環境濕度非常敏感，少量鋅離子(茚二酮和鋅的摩爾比為1∶25～1∶4)可以以路易斯酸的形式作為茚二酮與氨基酸反應的催化劑，在較低相對濕度環境下，穩定限速水解過程中關鍵中間體1,3-偶極子水解轉化為2-氨基-1-茚酮，增強手印顯現效果，相對濕度較高時，催化作用不明顯。同時鋅離子可以通過穩定作為反應產物的熒光團，提高熒光手印的持久性[3]。Bicknell測得茚二酮/鋅工作液在3個月內可以保持穩定[11]，非鋅化工作液的有效期長達1年，保質期大大降低是鋅化試劑的缺點，可通過將茚二酮與鋅鹽試劑分別保存、用時混合來解決。Berdejo則認為在茚二酮中添加氯化鋅并不能進一步改善熒光手印顯現效果[19]。

2 茚二酮顯現潛在手印處理條件

2.1 溫度和濕度

最初茚三酮處理的檢材通常需要在室溫下放置多天才能顯現出手印，20世紀70年代初，檢驗人員開始使用蒸汽熨斗加熱加濕茚三酮處理過的檢材，多方實驗最終確定茚三酮顯現潛在手印最佳處理條件是80 ℃和相對濕度65%[7]。

在茚二酮的應用研究中，可能由于氣候變化導致的實驗環境差異，來自不同國家、同一國家不同地區研究人員的實驗結果不盡相同。各地多數要求對晾干后的檢材進行加熱處理，但是對是否加濕要求不一致。英國傾向于在0%相對濕度下100 ℃加熱，相對濕度60%及以上或者溫度超過120 ℃都會減弱手印熒光，低至20 ℃長時間放置，茚二酮和氨基酸的反應也可以順利進行[7]。在以色列，加熱和60%相對濕度加濕是最佳顯現條件[20]，另有以色列研究人員發現將檢材冷卻到液氮溫度能顯著增強手印熒光[6]。在澳大利亞和新西蘭環境條件下，用熱壓板加熱比用烘箱加熱具有更好的熒光效果，最佳條件是160～165 ℃的熱壓板加熱10 s，同時建議使用茚二酮-茚三酮-物理顯影液的順序顯現紙張上的潛在手印。將檢材浸潤在工作液中兩次并延長加熱時間，也可以增強紙張上手印的顏色和熒光。顯然茚二酮顯現手印有必要根據環境確定處理條件。

水分是手印顯現的關鍵，茚二酮與氨基酸的反應能否順利進行在很大程度上取決于環境的相對濕度[3]。高濕度會導致氨基酸擴散，所以氨基酸靈敏試劑不適用于被浸泡過的檢材，也不適用于保存在高濕度環境下的陳舊檢材，接近紙張飽和的高濕度也會導致焦利粉水解降解為1,2-茚二酮或茚二酮衍生物，降低顯現靈敏度。當相對濕度在60%以下時，茚二酮與氨基酸的反應相對較差，顯現效果大大降低[18]。低濕度條件下，特別是在工作液中不添加氯化鋅的情況下，70～100 ℃長時間加熱會導致生成非熒光低聚物，影響手印熒光亮度。有鋅鹽加入的工作液會減少相對濕度、紙張含水量和環境的局部波動對顯現反應的影響。當茚二酮與氯化鋅的摩爾比為1∶25～1∶5時，茚二酮與氨基酸的反應速率與在70%相對濕度以上時的反應速率相同[3]，摩爾比接近1∶1時不能改善手印熒光，且對生成焦利粉的反應有不利影響。這些結論在一定程度上解釋了世界各地研究人員關于茚二酮作為手印顯現試劑的有效性和處理條件的結果相互矛盾。

2.2 承痕客體

承痕客體在茚二酮與氨基酸之間的反應中起著多種作用。紙張基質中纖維素的作用類似于表面催化劑，穩定早期反應的中間體，還能將水分子固定在反應位點附近[3,8]，通過氫鍵相互作用促進焦利粉的形成，進一步提高反應速率、增強熒光；纖維素對熒光產物也有穩定作用，可以延緩焦利粉的降解。多數商務票據紙張中所含微量金屬可以作為路易斯酸催化劑，以與鋅離子相同的方式促進反應進行[21]。

2.3 熒光效果

茚二酮處理后的檢材需特定光源激發出反應產物的熒光，再使用OG590長通濾光片觀察手印，460,532,577 nm光源均可以激發出強烈熒光，其中532 nm效果最好，手印熒光強且與背景反差較大[22]。氨基酸種類對光譜沒有影響，各類氨基酸的吸收光譜和熒光光譜是一致的。茚二酮與氨基酸的反應產物易光解，經茚二酮顯現的手印在黑暗中保存時間更長，在室溫條件下比較穩定，降解緩慢，其熒光在第一周開始下降，并在近兩周內達到穩定水平[23]。

3 茚二酮顯現潛在手印的應用

3.1 對DNA的影響

接觸DNA檢驗是當前DNA檢驗最常見的類型[24]，在顯現潛在手印之前收集接觸DNA可能會破壞手印痕跡[25]，對潛在手印進行一定處理后能更準確地定位接觸位置、確定提取點，所以需要在盡可能不破壞DNA的情況下顯現潛在手印[26]。茚二酮工作液成分不會對DNA造成損害，但是顯現操作過程會遺失少量DNA。所以茚二酮處理對提取接觸DNA造成的影響主要體現在PCR定量，Haneul采用茚二酮顯現煙蒂上的汗潛手印后進行DNA提取和實時熒光定量PCR，與對照組相比DNA恢復量減少了27%[27]。但是茚二酮處理能顯現接觸點的精確位置并且不破壞STR分型[28]，Galinsky使用茚二酮處理紡織物，近86%的檢材顯現出熒光區域，為檢驗接觸性疑難檢材提供了新的思路：使用茚二酮定位接觸區域，確定位置集中采集DNA[29]。

茚二酮處理和DNA提取的時間間隔對提取分析成功率影響較大，茚二酮處理后需盡快提取DNA，經處理的手印6 d內可以檢測到完整的DNA圖譜[30]。

3.2 其他顯現方法比較聯用

顯現滲透性客體汗潛手印的化學顯現法包括硝酸銀、茚三酮、茚二酮、DFO和物理顯影液等。硝酸銀法對曝光有較高要求，所以較少使用。茚三酮、茚二酮、DFO的顯現原理都是與手印中的氨基酸、多肽以及蛋白質發生反應，能顯現遺留時間較長的汗潛手印，是顯現滲透性表面手印常用的試劑，其中DFO和茚二酮都是常見的熒光試劑[4]。

案件中物理顯影液的手印顯現率高于茚二酮，但是物理顯影液操作復雜且會破壞DNA結構[31]。自然光觀察已處理的汗潛手印時，茚三酮比茚二酮和DFO效果更好，因為其手印顏色更深，與背景反差較大。最初茚二酮合成困難，導致其可用性有限，在未鋅化和確定最佳顯現條件之前，同為熒光試劑的DFO比茚二酮普及率更高。茚二酮處理導致的底物染色程度比DFO低，但是多數實驗結果顯示DFO的顯現效果優于當時的茚二酮。

茚二酮工作液配方和顯現條件進一步優化后，在大多數底物上顯現的手印質量都高于茚三酮和DFO[6,19,32-37]，顯出率比茚三酮高46%[6]，熒光亮度甚至可以達到DFO處理的四倍[11]。2002年，茚二酮通過總部位于荷蘭的BVDA International公司進入市場，合成方法優化使原料稀缺問題得到解決。至此，茚二酮在顯現滲透性客體手印的順序中可以同時取代茚三酮和DFO。

推薦滲透性客體汗潛手印顯現順序為光學方法顯現-茚二酮-茚三酮-物理顯影液。因陳舊手印氨基酸擴散，靈敏度高的茚二酮反而不易顯現出清晰紋線，有時候茚三酮的后處理可以得到更符合鑒定要求的手印，茚三酮的魯赫曼紫會完全吸收熒光，所以茚三酮應在茚二酮之后使用。茚二酮顯現后用茚三酮處理與單一使用茚三酮處理相比，前者的茚三酮對氨基酸的消耗更大，原因之一可能是在茚二酮第一次處理過程中，沉積的氨基酸與紙張之間的物理連接減弱，使這些氨基酸更容易與茚三酮反應，這種雙重應用顯著提高顯現紙張上潛在手印的成功率[38]。茚二酮對滲透性客體上的潛血手印也具有良好的顯現效果，顯現新鮮血潛手印茚二酮的效果優于DFO和茚三酮，顯現遺留7 d以上的潛血手印則DFO靈敏度更高。

3.3 疑難客體顯現

茚二酮是單氨基酸靈敏試劑顯現汗潛手印的傳統方法中最有效的，在牛皮紙和紅色書寫紙張上的顯現效果相對較差，適合復雜背景滲透性客體(無熒光性質)上的含氨基酸手印的顯現處理，在顯現疑難客體手印方面表現優異。

Michal使用茚二酮成功顯現火車票(以色列)上的潛在手印，由于熱敏材料受熱發黑，在使用茚二酮工作液浸泡晾干后需常溫靜置12 h以上[39]；李力使用不含醇的茚二酮工作液處理熱敏紙，可以在紙張不變黑的情況下顯現手印[40]；Sungwook用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)與鋅化茚二酮聯用，制備出顯現熱敏紙表面潛在手印的最佳配方[41]。易祥冰用多種方法對硅油紙張上的潛在手印進行顯現，其中茚二酮配合激光器顯現效果最佳。任建新測得茚二酮工作液處理后衛生紙和熱敏紙的最佳處理溫濕度均低于白紙、牛皮紙和報紙[42]。王聰使用茚二酮成功顯現流通和未流通的人民幣上的潛在手印[43]。茚二酮還是顯現血潛手印化學方法順序的首選之一。

茚二酮在真空條件下可以應用于非滲透客體，也成功顯現手套內側的手印，但是效果較差[44]，相比非滲透性客體專用顯現方法，不建議使用茚二酮。

4 結論和展望

滲透性客體上比非滲透性客體上更容易顯現出潛在手印[45]，茚二酮法作為一種潛在手印顯現方法，能夠應用于大多數滲透性客體上潛在手印的顯現。自1997年應用于手印顯現至今，已經憑借靈敏度高、熒光效果好、操作簡便、可應用于復雜背景客體等優勢在各國警察部門得到廣泛應用，茚二酮不影響接觸DNA分型以及對接觸痕跡的有效顯現，為集中采集DNA提供了條件。1,2-茚二酮、甲醇、乙酸、HFE 7100、鋅鹽都是提高顯現效果的有效工作液成分，加熱加濕是應用廣泛的后處理方式。

國內關于茚二酮顯現潛在手印的相關研究開展較晚，應用研究遠多于對原理、優化、最佳顯現條件的探究。盡管茚二酮已被澳大利亞、英國等列為滲透性客體潛在手印顯現的第一順位方法，其在國內的普及前景尚不明朗。氣候環境條件對茚二酮的顯現效果有較大影響，尚未有團隊系統研究茚二酮在國內氣候環境下的最佳配方條件、后處理條件；工作液處理后需要激發操作，基層單位多波段光源或激光器配置較少；都是茚二酮無法在國內現場勘查機構推廣的原因。研發、優化出易于操作、保質期長、安全環保的茚二酮工作液配方，確定適用于國內環境的處理條件，是茚二酮顯現技術未來應用于國內潛在手印顯現的發展方向。