負荷試驗CT 灌注成像結合HIF1α、MMP2 及VEGF 評價大鼠C6 膠質瘤侵襲力

李竹君 陸 娜 于 洋 劉 穎△

（1復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200032；2復旦大學附屬華山醫院放射科 上海 200040）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形細胞膠質瘤中惡性程度最高的腦腫瘤。大部分患者的預后不佳，中位生存期一般低于1 年［1］。侵襲力在膠質瘤進展及其惡性程度評價中發揮著重要作用［2］，且已成為治療神經膠質瘤的重要靶向［3-5］，因而評價膠質瘤的侵襲力在臨床上有較高的應用價值。

評價膠質瘤侵襲力的金標準是免疫組織化學染色，主要有基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、缺 氧 誘 導 因 子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。MMP2 可以降解Ⅳ型膠原，即降解基膜可反映腫瘤侵襲力［6-7］；HIF1α 反映組織中的氧穩態，在膠質瘤的微血管生成中擔任重要角色［8-9］；VEGF在腫瘤組織血管生成中發揮核心作用，指征膠質瘤侵襲力［10］。但免疫組化所用的組織標本一般通過手術、穿刺、活檢等有創方式獲取且周期較長，因此探尋一種無創活體評價膠質瘤侵襲力的方法有助于簡化診療過程，減少患者負擔。

乙酰唑胺是臨床上常用來擴張血管的藥物，在正常情況下會使腦阻力血管擴張進而引發腦血流量上升［11］。乙酰唑胺負荷常被用來檢測腦血管異常區域，有用于診斷慢性腦供血不足、頸動脈狹窄等疾病的潛力［12-13］，但尚未應用到腫瘤診斷層面，而神經膠質瘤也無法耐受乙酰唑胺的舒血管作用。因此，通過乙酰唑胺負荷前后腦部CT 灌注生物標志物的變化可以了解膠質瘤的生長狀況。本研究旨在尋找可以無創評價膠質瘤侵襲力的CT 灌注生物標志物。

材料和方法

大鼠膠質瘤模型建立20 只雄性清潔級SD（Sprgue-Dawley）大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），重約250~300 g，隨機分成4 組，每組5 只，分別為膠質瘤原位植入10、14、18 天組以及對照組。接種前，每只大鼠用2%異氟烷麻醉，再將其固定于立體定位儀上，沿頭皮中縫行縱線切口。在顱骨上鉆1 mm 直徑圓孔，孔洞位置在前囟前方1 mm，偏右3 mm。用微量進樣針緩慢推入10 μL 的C6 膠質瘤PBS 混懸液，注射速度約為1 μL/min，深度在顱骨下方5 mm，留置5 min 后慢速抽出，用少量骨蠟輕擦孔洞，再縫合頭皮。約10 天后大鼠C6 膠質瘤動物模型可建成。

SD 大鼠飼養均在清潔標準環境中，12 h/12 h光暗周期。實驗操作符合復旦大學附屬華山醫院動物實驗倫理要求（2020 華山醫院JS-057）。

負荷試驗與CT 灌注成像CT 掃描在256 層CT 機型（Philips Brilliance iCT 256，美國Cleveland公司）上開展，試驗前大鼠先用2%異氟烷麻醉，將靜脈留置針插入大鼠陰莖背靜脈中以進行對比劑給藥。首次掃描時確保整個鼠腦處于可掃描范圍之內。用高壓注射器以1mL/s 的流速注射對比劑歐 乃 派 克（2 mL/kg，Omnipaque?300，美 國GE 公司）。CT 灌注成像流程見本團隊文獻［14］。

CT 數據處理采用Philips 自帶軟件，流入動脈為大腦中動脈，基于去卷積運算，生成偽彩圖。在每張彩圖上劃定3 個感興趣區（region of interest，ROIs），取平均值。在乙酰唑胺負荷前后記錄腦血流量（cerebral blood flow，CBF）、腦血容量（cerebral blood volume，CBV）、表 面通透性（surfacepermeability，PS），并計算百分比變化率。

免疫組織化學染色每組大鼠于對應天數進行CO2吸入型安樂死，然后用4%多聚甲醛進行灌注固定。所有大鼠腦組織石蠟切片均經標準化流程進行脫臘，抗原修復以及封閉后敷一抗。所用一抗為HIF1α（A16873，中國愛博泰克公司）、MMP2（NB200-193，美國Novus Biologicals 公司）和VEGF（9698，美國CST 公司）。使用DAKO En Vision 系統（peroxidase/DAB+，兔/鼠）在標準方案下檢測抗體結合情況，蘇木精襯染。

染好的組織切片由兩名病理醫師分析，一致性達100%。采用半定量方法，每張切片挑選3~5 個視野，在光學顯微鏡下拍照（Stemi 305，德國Carl Zeiss 公司），使用I-solution 軟件（I-Solution，加拿大IMT 公司）計算陽性率。

統計學分析采用GraphPad Prism（version 8.0）統計學軟件進行分析。獨立樣本配對t檢驗統計乙酰唑胺負荷前后影像學生物標志物之間的關系。ANOVA 檢驗不同腫瘤種植組間的差異。灌注生物標志物與HIF1α、MMP2、VEGF 之間的關系用Pearson 相關系數進行分析。經Bonferroni 校正后，P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

負荷試驗前后組內灌注成像生物標志物對比與對照組相比，乙酰唑胺負荷前生物標志物CBF、CBV、PS 值均隨種植天數的增加而上升（P<0.01）。施加負荷之后，CBF、CBV、PS 數值全部大于負荷之前的生物標志物值（P<0.01，表1）。14 天組別大鼠乙酰唑胺負荷前后CT 灌注彩圖見圖1。

表1 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表1 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV 和PS 水平Tab 1 Levels of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.pre-challenge，（2）vs.control，（3）vs.day 10，（4）vs.day 14 ，P<0.01.

Group Control Day10 Day14 Day18 n 555 5 CBFpre-challenge（mL·100 g-1·min-1）53.7±4.7 63.1±2.0（2）77.4±14.0（2）（3）95.0±1.4（2）（3）（4）CBF post-challenge（mL·100 g-1·min-1）118.4±18.3（1）163.5±3.0（1）154.7±6.9（1）146.9±2.5（1）CBV pre-challenge（mL/100 g）8.6±0.8 38.2±0.9（2）46.0±1.2（2）50.1±1.2（2）（3）CBV post-challenge（mL/100 g）19.3±1.5（1）57.3±1.3（1）57.3±7.7（1）62.3±2.3（1）PS pre-challenge（mL·100 g-1·min-1）1.2±0.1 10.9±0.8（2）15.5±0.6（2）（3）18.2±0.3（2）（3）（4）PS post-challenge（mL·100 g-1·min-1）11.2±0.8（1）31.0±0.8（1）27.0±0.2（1）19.0±0.2（1）

圖1 大鼠C6 膠質瘤乙酰唑胺負荷前后CT 灌注彩圖Fig 1 CT perfusion color maps in a rat with C6 gliomas pre and post acetazolamide challenge

負荷后不同組間灌注成像生物標志物對比與對照組相比，18 天組CBF 百分比變化率顯著降低（P<0.01），10 天組、14 天組與對照組之間無明顯差異。相對于對照組，10 天組、14 天組、18 天組CBV及PS 百分比變化率顯著降低，且隨著腫瘤種植天數的增加，CBV 及PS 百分比變化率隨之降低（P<0.01，表2）。

表2 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV，PS 百分比變化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

表2 乙酰唑胺負荷前后CBF，CBV，PS 百分比變化率Tab 2 Percentage changes of CBF，CBV，PS pre-and post-acetazolamide challenge （±s）

（1）vs.Control，（2）vs.day 10，（3）vs.day 14，P<0.01.

Group Control Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 5 CBF percentage change（%）119.5±21.2 127.5±5.2 105.0±36.2 54.6±2.0（1）CBV percentage change（%）125.6±9.0 50.2±5.8（1）24.6±15.1（1）（2）24.5±4.3（1）（2）PS percentage change（%）816.2±116.4 185.5±19.8（1）74.6±6.0（1）（2）4.5±0.8（1）（2）（3）

免疫組織化學染色結果分析14 天組和18 天組 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于10 天 組（P<0.01）。18 天 組 的VEGF、MMP2 和HIF1α 高 于14天組（P<0.01）。10 天、14 天和18 天組中所有免疫組化病理學標志物陽性率見表3。10 天、14 天和18天組的鏡下免疫組化結果見圖2。

圖2 大鼠C6 膠質瘤HIF1α、MMP2、VEGF 免疫組織化學染色圖Fig 2 Histologic images of HIF1α，MMP2 and VEGF staining in rats with C6 gliomas

表3 大鼠C6 膠質瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫組織化學染色結果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

表3 大鼠C6 膠質瘤HIF1α、MMP2 和VEGF免疫組織化學染色結果Tab 3 Histopathological values of HIF1α，MMP2，VEGF in rats with C6 gliomas （±s）

（1）vs.day 10；（2）vs.day 14，P<0.01.

Group Day 10 Day 14 Day 18 n 5 5 5 HIF1α 2.82±0.9 5.7±0.7（1）9.2±1.1（1）（2）MMP2 1.8±0.5 3.9±0.8（1）7.2±1.1（1）（2）VEGF 3.9±0.3 7.5±1.7（1）12.4±1.3（1）（2）

灌注生物標志物與HIF1α，MMP2，VEGF 之間相關性分析HIF1α、MMP2、VEGF 與負荷前CBF、CBV、PS 呈正相關。HIF1α、MMP2、VEGF和CBF、CBV、PS 百分比變化率之間呈負相關（P<0.01，表4 和圖3）。

圖3 大鼠C6 膠質瘤HIF1α、MMP2、VEGF 與CT 灌注生物標志物之間Pearson 相關性分析圖Fig 3 Pearson correlation diagrams between HIF1α，MMP2，VEGF and PCT with challenge parameters in rats with C6 glioma

表4 大鼠C6 膠質瘤HIF1α，MMP2，VEGF 與CT 灌注生物標志物之間Pearson 相關性分析Tab 4 Pearson correlation of PCT with challenge parameters and histopathological values in rats with C6 gliomas

討 論

CT 灌注成像在腦腫瘤診斷中應用廣泛，檢查速度快、結果直觀準確，可無創地評價微循環血流動力學變化。研究顯示256 層CT 灌注成像生物標志物CBV、CBF 和PS 能有效反映人腦膠質瘤的血管生成狀況，證明CT 灌注成像在評估腫瘤生長上有很大潛力［15］。評價腫瘤進展必須考慮多個因素，已有研究指出抗血管生成治療會誘發腫瘤侵襲力增強進而導致其惡性進展［16］，因此，多維度評價膠質瘤進展至關重要。

HIF1α、MMP2 和VEGF 作為常 見的組織病理學生物標記物在膠質瘤評價中有重要意義。膠質瘤內部通常是缺氧環境，腫瘤細胞為了降低氧消耗會抑制HIF-1 降解，進一步活化HIF1α 亞基信號通路，刺激其下游因子如VEGF、MMP2 的表達，促進腫瘤血管生成，調節細胞代謝，增強腫瘤的生長與侵襲［17］。另一方面，研究指出VEGF/VEGF2 信號通路能增強血管通透性，幫助腫瘤細胞滲出和轉移，VEGF 本身也可以降低腫瘤細胞免疫應答，促進腫瘤細胞的浸潤，且VEGF 與MMP2 通常在腫瘤中 的 表 達 水 平 成 正 相 關［18-19］。由 此 可 見，HIF1α、MMP2 和VEGF 3 種因子的免疫組化染色結果能為評價大鼠C6 膠質瘤的侵襲能力提供有力證據。

本研究發現CBF 百分比變化率、CBV 百分比變化率和PS 百分比變化率與標記腫瘤侵襲力的組織病理學生物標志物間呈現負相關，即HIF1α、MMP2、VEGF 免疫組化陽性率越高，腫瘤的侵襲能力越強，病變血管對乙酰唑胺的反應也越微弱，表現在CBF、CBV 和PS 的百分比變化率越小。本研究注意到PS 百分比變化率相關性尤其顯著，這一發現與先前研究結果吻合，即血腦屏障（blood brain barrier，BBB）完整性的破壞與膠質瘤的侵襲能力之間聯系緊密，而血腦屏障完整性一般是用CT 灌注成像技術計算對比劑從血管內到血管外組織間隙的單向傳輸速率進而獲得表面通透性（PS）的定量數據來表示［20-21］。

與磁共振（MRI）灌注成像相比，CT 灌注成像成本更低，檢測方便，獲得的是完全定量的數據，且CT 灌注成像不容易受鈣化、出血、金屬等影響，因此目前應用更加廣泛［22］。本研究通過對比標準免疫組織化學診斷標記物，進一步明確CT 灌注生物標志物與腫瘤侵襲力的相關性，可能為臨床醫師提供更直觀可靠的影像學依據。

本研究的局限性在于缺乏直接的臨床試驗證據，人與大鼠之間確實存在諸多差異。考慮到試驗中輻射劑量隨采集次數線性增加，確實不宜招募志愿患者在臨床實踐中進行該試驗。但無論如何，本研究希望其結果可以為膠質母細胞瘤的臨床影像學檢測提供更多的解讀思路。

綜上所述，本研究證實CT 灌注成像影像學生物標志物CBF 百分比變化率、CBV 百分比變化率和PS 百分比變化率作為膠質瘤侵襲力預測指標有一定意義，乙酰唑胺負荷CT 灌注成像在無創評價膠質瘤侵襲力的過程中具有潛在的應用價值。

作者貢獻聲明李竹君 動物和細胞實驗，文章撰寫。陸娜 CT 影像學部分實驗。于洋 影像學實驗數據分析。劉穎 免疫組織化學結果分析。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。