RACK1對人宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制

李金秋，徐麗秀，朱佳瑜，夏依達·吐爾遜，阿仙姑·哈斯木

新疆醫科大學基礎醫學院/新疆地方病分子生物學重點實驗室，烏魯木齊 836001

宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發病正逐漸年輕化(20～39歲)，2020年的統計數據顯示，中國宮頸癌新發病例達11萬例，死亡病例約6萬例，居惡性腫瘤第10位[1]。晚期宮頸癌患者死亡的主要原因為腫瘤細胞生長速度過快及難以控制的盆腔淋巴結轉移[2]。腫瘤的發生發展是一個復雜的過程，而過度的細胞增殖及細胞凋亡程序的紊亂是造成惡性腫瘤發生的主要原因之一[3-4]。激活性蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1，RACK1)，是一種胞質內游離的支架蛋白，可與蛋白激酶C(PKC)及其他多種關鍵信號蛋白相互作用，進一步介導細胞內的信號轉導，直接參與多個重要基因的表達調控，影響細胞增殖、凋亡及遷移[5]。目前已有研究發現，RACK1在多種惡性腫瘤中呈高表達并與患者的不良預后密切相關，已被確定為脂肪細胞分化和代謝紊亂所需的新基因[6]。但RACK1異常表達對宮頸癌細胞增殖及凋亡的作用機制仍不明確。本研究檢測RACK1在宮頸癌組織中的表達水平，并通過構建慢病毒穩定轉染細胞系驗證RACK1對宮頸癌細胞惡性增殖及凋亡能力的影響，以期為明確宮頸癌發病機制及改善患者的預后提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 收集新疆醫科大學第一附屬醫院婦科2020年12月－2021年12月收治的24例CSCC患者的宮頸癌組織和24例無宮頸病變的正常宮頸組織。本研究獲新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(20180223-128)。所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 細胞及試劑 宮頸癌SiHa、C33a細胞株及正常宮頸H8細胞株購自武漢普諾森生命科技有限公司。RACK1-siRNA慢病毒由上海吉凱有限公司構建。RIPA組織細胞裂解液、Trizol試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司，c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2單克隆抗體購自美國CST公司，RACK1、磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化細胞信號傳導與轉錄活化因子3(p-STAT3)、JAK2、STAT3抗體購自美國Abcam公司，β-actin兔抗人多克隆抗體購自美國Protein Teach公司，QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒購自德國Qiagen公司，7AAD凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養、轉染及分組 用含10%胎牛血清(FBS)及1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基培養SiHa、H8細胞，用含10% FBS及1%青鏈霉素雙抗的DMEM中糖培養基并添加1%的谷氨酰胺培養C33a細胞。均放置在恒溫、5% CO2培養箱中培養。顯微鏡下觀察細胞密度達80%～90%時轉染慢病毒。SiHa和C33a細胞均根據不同處理方法分為正常對照組(NC)、空載組(sh-NON)和沉默組1(shRACK1-1)、沉默組2(shRACK1-2)。具體轉染步驟按照慢病毒構建公司說明書進行操作。轉染24 h后，將部分細胞消化并均勻鋪在激光共聚焦小皿內，待完全貼壁后，加入DAPI避光染細胞核15 min，PBS沖洗3次，每次15 min，將小皿放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染效率，拍照。qPCR驗證轉染后RACK1的表達情況。

1.3.2 宮頸組織RNA的提取 采用Trizol提取宮頸組織中的RNA，在液氮中取出癌組織以及正常組織，剪成1～2 mm的塊狀，放入2.0 ml U底管中，加入4 mm大型鋼柱珠子1粒，3 mm小型鋼珠2粒，蓋上蓋子放進液氮中冷凍60 s；取出2.0 ml U底管，加入1 ml Trizol溶液。設置研磨儀參數(頻率60 Hz)，研磨30 s。研磨充分后，采用Trizol法提取C33a、SiHa和H8細胞總RNA，根據RevertAid First Strand cDNA試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA。

1.3.3 qRT-PCR檢測宮頸癌組織及C33a、SiHa細胞中RACK1、c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2mRNA的表達水平 根據QuantiNova SYBR Green PCR kit試劑盒說明，配制總反應體積為10 μl的反應體系，以β-actin作為內參照。檢測CSCC組織、NC組織及H8細胞中RACK1mRNA的表達水平，以及CSCC組織內c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2mRNA的表達水平，并檢測shRACK1-1、shRACK1-2、sh-NON組和NC組C33a、SiHa細胞中RACK1、c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2mRNA的相對表達水平。采用2–ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，實驗均重復3次。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The qRT-PCR primer sequences

1.3.4 Western blotting檢測RACK1、c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達水平 收集各組細胞沉淀加入RIPA細胞裂解液與PMSF(100:1)，提取各組細胞總蛋白并使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，根據蛋白濃度進行定量。高溫變性后每組取30 μg蛋白進行80 min電泳分離，電轉至PVDF膜上，室溫用5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃一抗孵育過夜，二抗(HRP標記)孵育2 h。采用ECL法顯色，使用化學發光儀進行拍照并分析其灰度值，計算各蛋白相對表達量。

1.3.5 MTT實驗檢測細胞活性 采用MTT法檢測各組C33a、SiHa細胞的增殖能力，分別在接種后第24、48、72 h檢測OD值。將細胞以5×103個/150 μl密度接種于96孔板中，每組設3個復孔，每隔24 h取出，45°傾斜96孔板，將20 μl MTT溶液沿空壁加至培養基中，隨后繼續培養，4 h后棄去上清，沿孔壁緩緩加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標儀設定所需的程序后，振蕩10 min，檢測波長490 nm處的OD值。

1.3.6 平板克隆實驗檢測細胞集落形成能力 取各組對數生長期細胞，胰酶消化，將細胞吹散并懸浮于完全培養基中。每組細胞分別以103個/孔接種至6孔板中，每孔含2 ml完全培養基。37 ℃培養箱中培養2周，當出現肉眼可見的形似菌落時終止培養。棄上清，PBS洗3次，每次10 min，每孔加入3 ml固定液，常溫固定30 min后，PBS洗2次，加800 μl結晶紫溶液浸染10 min，PBS沖洗至液體澄清，自然干燥。觀察大體趨勢后，顯微鏡下計數細胞團并拍照。

1.3.7 流式細胞術檢測細胞凋亡水平 收集各組穩定轉染的細胞株，PBS洗3次，胰酶消化后5000 r/min離心10 min，加入100 μl結合緩沖液，重懸細胞并將細胞密度調整為1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC和PE，避光雙染15 min，再次加入400 μl緩沖液，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平的變化。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；RACK1mRNA與c-myc、caspase-9、caspase-3、Bax、Bcl-2mRNA表達水平的相關性采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RACK1在宮頸癌組織、正常宮頸組織和宮頸癌細胞中的表達情況 qRT-PCR檢測結果顯示，與正常宮頸組織(NC)相比較，宮頸癌組織(CSCC)中RACK1mRNA表達水平明顯升高(P<0.001，圖1A)；且C33a、SiHa細胞中RACK1mRNA的表達水平明顯高于H8細胞(P<0.001，圖1B)。Western blotting檢測結果顯示，與H8細胞(0.4083±0.0931)相比，C33a(1.3697±0.0587)和SiHa(1.2848±0.0899)細胞中RACK1蛋白表達水平明顯增高(P<0.001，圖1C)。

圖1 RACK1在宮頸癌組織(CSCC)、正常宮頸組織(NC)和宮頸癌細胞中的表達Fig.1 Expression of RACK1 in cervical cancer and normal cervical tissues and cells

2.2 宮頸癌C33a和SiHa細胞轉染慢病毒后RACK1mRNA和蛋白的表達情況 Western blotting檢測結果顯示，shRACK1-1組和shRACK1-2組C33a、SiHa細胞的RACK1蛋白表達水平較NC組、sh-NON組明顯降低(P<0.001，圖2A)，而sh-NON組與NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。qRT-PCR檢測結果與Western blotting檢測結果一致(圖2B)。故后續實驗僅選用shRACK1-1、shRACK1-2和sh-NON組進行檢測。

圖2 慢病毒轉染后各組宮頸癌C33a、SiHa細胞RACK1 mRNA及蛋白表達情況Fig.2 mRNA and protein expression of RACK1 in cervical cancer C33a and SiHa cells of each group after lentivirus transfection

2.3 沉默RACK1對宮頸癌細胞增殖能力的影響MTT法檢測結果顯示，shRACK1-1、shRACK1-2組C33a、SiHa細胞在24 h、48 h和72 h的生長速度均較sh-NON組明顯降低(P<0.001，圖3A)。平板克隆實驗結果顯示，與sh-NON組比較，shRACK1-1組和shRACK1-2組C33a、SiHa細胞的集落形成能力明顯被抑制(圖3B)。

圖3 沉默RACK1對宮頸癌C33a和SiHa細胞增殖及集落形成能力的影響Fig.3 Effect of RACK1 silencing on proliferation and colony formation of cervical cancer C33a and SiHa cells

2.4 沉默RACK1對宮頸癌細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，shRACK1-1組及shRACK1-2組C33a、SiHa細胞總凋亡率均較sh-NON組明顯增高(P<0.001)(圖4)。

圖4 流式細胞術檢測沉默RACK1對宮頸癌C33a和SiHa細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of RACK1 silencing on apoptosis of cervical cancer C33a and SiHa cells (Flow cytometry)

2.5 沉默RACK1對宮頸癌C33a和SiHa細胞增殖及凋亡相關蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，沉默RACK1后，與sh-NON組比較，shRACK1-1組和shRACK1-2組C33a、SiHa細胞中增殖相關的關鍵蛋白c-myc和抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯降低，而促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Ba x的表達水平明顯升高(P<0.001或P<0.01，圖5A)。qRT-PCR檢測結果與Western blotting檢測結果一致(P<0.001，圖5B)。

圖5 沉默RACK1后各組C33a、SiHa細胞增殖、凋亡相關蛋白及mRNA的表達情況Fig.5 Proteins and mRNA expression related to proliferation and apoptosis in each group of C33a and SiHa cells after RACK1 silencing

2.6 宮頸癌組織中RACK1mRNA與增殖、凋亡相關基因表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示，宮頸癌組織中RACK1mRNA的表達水平與c-myc(r=0.713，P<0.001)、Bcl-2(r=0.846，P<0.001)mRNA呈明顯正相關，而與caspase-3(r=–0.679，P<0.001)、caspase-9(r=–0.735，P<0.001)、Bax(r=–0.691，P<0.001) mRNA表達水平呈明顯負相關(圖6)。

圖6 宮頸癌組織中RACK1 mRNA與c-myc、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA表達的相關性Fig.6 Correlation between mRNA expression of RACK1 and the mRNA expression of c-myc, caspase-3, caspase-9, Bax and Bcl-2 in cervical cancer tissues

2.7 沉默RACK1對宮頸癌細胞中JAK2/STAT3通路的影響 Western blotting檢測結果顯示，與sh-NON組比較，shRACK1-1組、shRACK1-2組C33a、SiHa細胞的非磷酸化JAK2和STAT3表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，而p-JAK2、p-STAT3表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.001，圖7)。

圖7 沉默RACK1對宮頸癌細胞JAK2/STAT3通路的影響Fig.7 Effect of RACK1 silencing on JAK2/STAT3 pathway in cervical cancer cells

3 討 論

宮頸癌作為婦科常見的惡性腫瘤，全球每年新增病例超過50萬，而死亡人數高達30萬，嚴重威脅患者的生命安全，并加重社會及家庭的經濟負擔[6]。宮頸癌發病的主要原因為人類乳頭瘤病毒(HPV)持續感染，其次為多個性伴侶、性生活過早、吸煙等[7]。盡管隨著早期篩查的普及和臨床治療方法的改進，宮頸癌發病率已大幅降低，但宮頸癌晚期轉移仍是造成其預后不良的重要原因[8]。在我國，西部地區宮頸癌死亡率較沿海城市高，尤其在新疆地區，宮頸癌作為高發腫瘤嚴重影響當地女性患者的生活質量[9]。因此，明確腫瘤細胞增殖的分子機制，遏制細胞失控性增殖進而減緩腫瘤的惡性進展，對宮頸癌的臨床治療及患者的預后均具有積極意義。

RACK1是一種多功能支架蛋白，在細胞信號樞紐和蛋白活性調節中發揮重要作用，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。RACK1在乳腺癌[10]、口腔鱗狀細胞癌[11]、非小細胞肺癌[12]、前列腺癌[13]等多種腫瘤中的表達明顯增高，且與患者的不良預后密切相關。Liao等[14]發現，RACK1在宮頸癌中的表達明顯升高，下調RACK1的表達可延緩宮頸癌細胞的惡性進展。Wang等[15]發現，RACK1可促進宮頸癌miR-302b/c/d-3p的表達，抑制細胞周期蛋白O(Cyclin O)的表達，并誘導細胞發生凋亡。近年來有研究發現，RACK1可與其他多種蛋白結合形成信號復合體參與腫瘤細胞的增殖及遷移，如RACK1與GNA14's相互作用后通過MAPK/JNK和PI3K/Akt信號通路抑制肝細胞癌的惡性進展[16]。2020年，Duan等[17]發現，RACK1可通過與NLRC3和NEK7相互作用，促進NLRP3炎性小體的組裝，進而介導NLRP3炎性小體的活化。此外，還有研究發現，RACK1表達上調可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而減緩胃癌細胞的生長和上皮-間質轉化(EMT)的發生[18]。以上研究均提示，RACK1在腫瘤進展過程中扮演的角色并非一成不變，可能會受到組織特異性及地域環境等因素的影響。本研究檢測了24例CSCC組織及24例NC組織RACK1mRNA的表達情況，以及兩種宮頸鱗狀癌細胞系(C33a和SiHa)和正常宮頸上皮細胞系(H8)中RACK1mRNA及蛋白的表達情況，結果發現RACK1在CSCC組織和C33a、SiHa細胞中均呈高表達，與上述文獻報道一致，提示RACK1可能與宮頸癌的惡性進展相關。

腫瘤細胞的無限增殖和死亡抑制為腫瘤進展提供了潛在的動力。有研究發現，RACK1具有與幾種促凋亡蛋白相互作用的能力。在結腸癌細胞中，RACK1可與凋亡蛋白Fem1b相互作用，并促進其泛素化，而下調RACK1則可導致Fem1b介導的細胞凋亡[19-20]。有研究提出，RACK1保護腫瘤細胞免于發生凋亡的作用主要與其調節BimEL的降解而產生的抗性有關[21]。本研究發現，RACK1沉默后，宮頸癌細胞SiHa、C33a的增殖能力明顯下降，細胞凋亡率明顯增高；增殖相關蛋白c-myc、抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低，而與細胞凋亡密切相關的蛋白caspase-3、caspase-9和Bax表達明顯增高。為進一步證實RACK1與宮頸癌細胞增殖及凋亡有關，本研究應用qRT-PCR方法檢測宮頸癌組織中RACK1mRNA的表達水平，并分析其與增殖和凋亡相關基因表達的相關性，結果顯示，在宮頸癌組織中，RACK1的表達與凋亡相關基因caspase-3、caspase-9和Bax呈明顯正相關，而與c-myc、Bcl-2呈明顯負相關。以上結果均提示，沉默RACK1可抑制宮頸癌細胞的增殖能力，促進腫瘤細胞發生凋亡。

JAK2/STAT3作為經典的信號轉導通路，其異常活化往往涉及腫瘤細胞的多種生物學改變，包括促進腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲等[22-23]。Yuan等[24]發現，補體C3過表達可激活JAK2/STAT3通路加速胃癌進展。另有研究顯示，circSPARC可通過調節JAK2/STAT3通路促進結直腸癌的惡性進展[25]。然而，RACK1對JAK2/STAT3通路的調控機制鮮有報道，Zhang等[26]發現，RACK1通過募集JAK2至核糖體來調控STAT3的活化，進而促進卵巢癌細胞的增殖。因此，RACK1促進腫瘤惡性進展的作用與JAK2/STAT3通路密切相關。本研究通過檢測JAK2/STAT3信號通路蛋白的表達水平，進一步探討了RACK1對宮頸癌細胞增殖與凋亡的可能作用。結果顯示，JAK2/STAT3通路的關鍵蛋白(p-JAK2和p-STAT3)在shRACK1-1組、shRACK1-2組中的表達水平明顯高于sh-NON組，而JAK2和STAT3蛋白表達未見明顯改變，提示RACK1可通過JAK2/STAT3信號通路來調節宮頸癌細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，R ACK1在宮頸癌中呈過表達趨勢，靶向沉默RACK1基因可有效降低增殖相關蛋白c-myc和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增強促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Bax的表達，該過程與JAK2/STAT3信號通路有關。但本研究仍存在不足之處，如對RACK1通過JAK2/STAT3信號通路調控細胞增殖與凋亡的探討中缺少體內驗證及通路恢復實驗，因此，后續可進一步分析RACK1對JAK2/STAT3通路具體的分子調控機制，為RACK1作為評估宮頸癌生物學行為的潛在分子標志物提供理論基礎。