基于膜技術分離純化乳清蛋白的研究進展

馬鎵莉，盧會霞，苗曉雪

（天津市跨介質復合污染環(huán)境治理技術重點實驗室，南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300350）

乳品工業(yè)是食品工業(yè)中污染最嚴重的行業(yè)之一，其中乳清是干酪生產的主要副產物，是一種淡黃色或綠色的不透明液體，其高有機負荷被認為是乳制品廢水中的重要污染物來源。目前對于乳制品廢水的處理通常采用生化法，該方法雖能有效地降低廢水中的化學需氧量（COD）和生物需氧量（BOD），使污水達標排放，但廢水中具有經濟價值的蛋白、脂肪、糖等物質卻得不到有效回收而造成了資源浪費。國家《乳制品工業(yè)產業(yè)政策》也明確提出了對乳清綜合利用技術的支持。因此，將乳清中的蛋白進行回收利用對于乳制品行業(yè)的節(jié)能減排以及可持續(xù)發(fā)展意義重大。

乳清蛋白富含必要氨基酸，易于消化吸收，是一種優(yōu)質蛋白，素有“蛋白質之王”之稱。乳清蛋白除了具有增稠、起泡等功能特性之外，乳清蛋白濃縮物或其中的單一蛋白還具有獨特的營養(yǎng)和醫(yī)學價值而廣泛用于食品和營養(yǎng)保健品行業(yè)。近年來，對于乳清蛋白的分離和純化方面的研究日益受到了企業(yè)和眾多研究者的關注（圖1）。

圖1 通過Web of Science檢索與“separation and isolation of whey protein”“membrane and whey protein”相關的發(fā)文數量

自20 世紀50 年代以來，許多技術被用于分離純化乳清蛋白。但鹽析、酸堿沉淀、化學沉淀、熱蒸發(fā)等早期技術大多只能用于實驗室規(guī)模，產量極低，且酸、熱等條件會造成蛋白質變性，失去營養(yǎng)和功能特性。因此目前分離乳清蛋白的主要方法是色譜法和膜分離法。其中離子交換色譜法與膜分離法相結合也可用于大規(guī)模分離乳清蛋白，例如Maciel 等采用微濾、超濾、色譜法相結合的方法分離甜乳清中的乳鐵蛋白。對乳清先微濾再超濾，能夠預純化乳鐵蛋白至1.1mg/L，最后通過陽離子交換色譜最終得到乳鐵蛋白濃度為17.4mg/mL、純度為92.7%、回收率為87.0%。雖然色譜法具有高分離性能，分離出的蛋白純度高，但它循環(huán)時間長、成本太高，且存在樹脂再生、水和化學消耗等問題。因此，膜技術因其簡單、節(jié)能、收率高、無二次污染、易于工業(yè)放大以及不會改變蛋白的性狀和營養(yǎng)價值，回收過程沒有相變的發(fā)生等優(yōu)點成為蛋白質分離領域最有前景的分離方法。本文在對乳清及其中所含蛋白特性分析的基礎上，總結近年來膜技術在乳清蛋白分離中的應用研究，重點介紹電驅動膜技術在乳清蛋白分離和資源化方面的應用最新進展。

1 乳清及乳清蛋白的特性和應用

乳清是干酪生產中的副產物，隨著干酪產量的不斷增加，每生產1噸干酪會排放9噸乳清，世界乳清產量每年(1.8～1.9)億噸，年增長率為1.0%～2.0%。但目前只有50%的乳清被處理用作動物飼料和食物等，其中仍有40%～50%的乳清作為廢水排放。乳清的有機負荷非常高，BOD 為30～50g/L、COD為60～80g/L，因此在乳清廢水排放前必須進行嚴格的處理，降低其中的有機物含量，確保達標排放。傳統(tǒng)的乳清處理方法可以通過物理、化學、生物等多種方法處理，也有研究者采用膜技術處理乳清廢水，如Mansor等研發(fā)了一種新型復合膜，建立了一種經濟有效的奶酪乳清廢水處理方法，該方法對乳清廢水中的COD、BOD、總懸浮物和濁度的去除率分別達到為99.8%、99.7%、99.8%和99.6%。但上述方法是將乳清作為廢水，處理的目的是為了達標排放或水資源的回收利用，而無法實現(xiàn)乳清中蛋白質、乳糖等功能活性物質的資源化回收利用。實際上乳清可通過不同途徑進行資源化利用（圖2），即可以直接將乳清作為化肥或飼料處置；或者通過發(fā)酵工藝來獲得增值產品，如有機酸、酶、細菌素等；或者將乳清看作是一種蛋白質來源，采用適當的分離和純化技術對其中的蛋白質和乳糖等高價值的化合物進行回收利用，與其他加工技術相結合生產出多種乳清產品，如乳清粉、還原糖乳清、脫鹽乳清、乳清蛋白濃縮物（WPC）、乳清蛋白分離物（WPI）、乳鐵蛋白和糖巨肽等。實現(xiàn)乳清的資源化利用具有重要的環(huán)境意義和經濟效益。

圖2 乳清的幾種利用途徑

乳清中的營養(yǎng)物質占原料奶的55%（質量分數，下同），其中固形物含量約6%～7%、粗蛋白0.6%～0.8%、粗脂肪0.3%，乳糖3%～5%。根據生產的奶酪類型和使用酶的不同，乳清可以分為兩類：甜乳清和酸性乳清。甜乳清是生產凝乳酶類干酪過程中產生的，而酸性乳清是在礦物質或乳酸凝結的制作過程產生。當然，乳清的組成和特性很大程度上也取決于牛奶的來源、動物的飼料、所用的加工方法、季節(jié)和哺乳期等。此外，不同的發(fā)酵工藝和時間將導致乳清的pH 及成分有所不同；不同熱處理溫度對乳清中蛋白質和脂肪含量也有所影響。

乳清蛋白是多種功能性蛋白的混合物，主要成分是α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白，次要成分是乳過氧化酶、乳鐵蛋白、乳脂肪球膜、蛋白胨、生長因子和其他生物活性因子及酶。乳清蛋白中各類蛋白的含量及特性見表1。其中α-乳白蛋白對熱最穩(wěn)定，是唯一能結合鈣的乳清蛋白成分，其結構及氨基酸比例與人乳相似度極高，因此在嬰幼兒奶粉中有廣泛應用。但β-乳球蛋白是致敏蛋白，降低β-乳球蛋白是提升牛乳產品母乳化的有效方法。乳鐵蛋白是一種可結合并運輸鐵離子的蛋白質，具有免疫調節(jié)功能，可參與阻斷過度的免疫反應以及促進嬰幼兒自身免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟，對預防新生兒感染有一定作用而被大量應用在嬰幼兒配方奶粉中。免疫球蛋白是乳清蛋白質中熱敏感性最強的一種蛋白質，通常以單體或多聚體的形式存在。目前已實現(xiàn)了從乳清蛋白中分離乳鐵蛋白、免疫球蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等單個蛋白的分離。但是，分離的純度和規(guī)模仍然較低，尤其是分子量比較接近的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白更難分離。我國的乳清蛋白開發(fā)應用尚處于起步階段，功能性明確、技術含量較高的乳清蛋白質保健品目前在市場上還很少見。隨著工藝技術的進一步成熟，今后乳清蛋白的應用將會不斷擴展到嬰幼兒食品、中老年保健食品、免疫功能食品、減肥食品和運動營養(yǎng)食品以及醫(yī)療等領域。因此，開發(fā)高效、易于工業(yè)放大、環(huán)境友好的乳清蛋白分離技術，獲得更多的乳清蛋白產品，對于健康中國戰(zhàn)略的實施意義重大。

表1 乳清蛋白的組成及特性[3,27-28]

2 壓力驅動膜在乳清蛋白分離中的應用

2.1 超濾過程在乳清蛋白分離中的應用

膜技術相對于其他分離乳清蛋白的技術最大的優(yōu)勢在于成本效益高，運行過程中不會發(fā)生相變，占地面積小，且易于放大，因此，在乳清蛋白分離濃縮中的應用日益廣泛。超濾技術能夠在最大程度上將乳清中的營養(yǎng)成分資源化利用，是乳清蛋白分離回收中應用最為普遍的膜技術。超濾膜允許礦物質、水、乳糖和其他低分子量化合物通過，而將大分子蛋白質截留，從而實現(xiàn)蛋白的分離和濃縮。陳婷等早期的研究證明使用超濾技術分離和濃縮乳清得到具有經濟效益的乳清蛋白粉是可行的，按固形物衡算，每噸乳清可以回收5.13kg 乳清蛋白粉，乳清中蛋白的回收率高達82.74%。超濾最常用于制備WPC 和WPI 等產品。WPC 或WPI 為蛋白混合物，基本含有全部乳清蛋白。目前主要通過超濾和噴霧干燥進行大規(guī)模工業(yè)生產，蛋白質含量一般為35%～85%。

也有一些研究者嘗試從乳清中分離和制備出具有抗高血壓、抗氧化活性和抗肥胖潛力等獨特價值的單個功能活性蛋白，例如α-乳白蛋白（α-La）。該研究最早在Bottomley的專利中描述了用截留分子量（MWCO）為100kDa 的超濾膜來獲得富含α-La 的透過液，再用MWCO 為10kDa 的超濾膜來對透過液進行高倍濃縮，得到的濃縮液中α-La 的質量分數是β-Lg 的3 倍。Muller則用連續(xù)濃縮和連續(xù)滲濾的組合工藝得到了α-La 質量分數50%的WPC。孫顏君等采用微濾和超濾結合的方法制備得到WPC80，先用微濾降低乳清中的酪蛋白和脂肪，后通過超濾得到高α-La 濃度的WPC，所制得的WPC80 中α-La 的質量分數占總蛋白的64.37%。該研究發(fā)現(xiàn)要提取單獨的α-La 主要的難點在于將α-La與分子量相近的β-Lg分離。

為進一步研究α-La 和β-Lg 的分離選擇性，Cheang等采用α-La和β-Lg的二元混合物模型溶液，在pH 為5.5、總離子強度為50mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液中，以2～4m/s 的過濾速度通過MWCO為30kDa的復合再生纖維素膜，得到超濾選擇性大于55。這是由于低pH和低離子強度下，基本不荷電的α-La透過率最高且β-Lg二聚體分子由膜孔徑篩分作用可以很好地截留。緊接著，Cheang等進一步從WPI中分離α-La和β-Lg，得到的分離選擇性為21，這比之前的55 要小得多。這是由于混合蛋白質溶液中蛋白質之間的不穩(wěn)定造成了聚集。這說明從真實的乳清溶液中要分離單一的蛋白質，超濾的選擇性仍有待提高。

為了提高蛋白的回收率和純度，提高生產效率，將超濾與滲濾技術結合來回收乳清蛋白具有重要意義。滲濾可以克服高濃度料液透過率低的缺點，不斷加水稀釋有效降低了產品中乳糖和脂肪的含量。最初Muller 等研究了三種不同的工藝模式，即連續(xù)濃縮、間歇濃縮、連續(xù)濃縮-連續(xù)滲濾組合工藝。研究表明，連續(xù)濃縮-連續(xù)滲濾的組合工藝可以提高滲濾液中α-La 的純度和產量，純度50%、收率在80%以上。Almecija 等使用MWCO為300kDa 的管狀陶瓷膜進行連續(xù)滲濾，探究了pH對分離乳清蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)在pH為4～5時，α-La和β-Lg可以全部截留。在pH為3或9的條件下，乳清中牛血清白蛋白（BSA）和乳鐵蛋白（LF）純度提高了1.5倍，同樣在pH為9的條件下，免疫球蛋白G（IgG）純度提高1.6 倍。Baldasso等通過不連續(xù)滲濾來濃縮純化乳清蛋白，所得濃縮蛋白的純度大于70%，還發(fā)現(xiàn)少量多次添加滲濾水量時滲濾的效果更好。Cheang等研究了通過切相流過濾系統(tǒng)的滲濾過程分離α-La和β-Lg，最終β-Lg收率為90%，α-La的收率為70%。

雖然滲濾模式改善了超濾的分離性能，但是它加入大量去離子水稀釋來去除雜質，很難在獲得高純度的同時達到高收率，即單級系統(tǒng)通常很難同時獲得高的產率和純度。Porter則首次提出多級（級聯(lián)）超濾的概念，認為通過多個膜系統(tǒng)的優(yōu)化連接可以改善膜分離性能。范麗娟等則采用兩級超濾從牛初乳乳清中分離提取IgG，第二級超濾過程使第一級濃縮液中IgG純度得到進一步提高，最終濃縮液中的IgG回收率為87.6%，IgG在總蛋白中的含量高達71%。Patil等使用三種不同的級聯(lián)構型分離乳清蛋白，其中逆流級聯(lián)系統(tǒng)無法同時得到高收率和高純度，而調整后的級聯(lián)構型和Lightfoot提出的理想級聯(lián)構型都在回收率和純度方面有更高的性能，純度和回收率可同時達到80%。

總之，超濾技術是乳品行業(yè)中常見的操作單元，能夠高效地從乳清中分離濃縮得到乳清蛋白。另外，采用滲濾以及級聯(lián)超濾的方法可以進一步提高蛋白的收率和純度，甚至可以獲得一定純度的單個功能活性蛋白。盡管超濾在乳清蛋白分離和純化中的應用日益受到關注，但是目前超濾技術在蛋白分離中的應用也具有一定的局限性，主要體現(xiàn)在對某些目標分離蛋白的低選擇性，難以分離分子量大小接近的蛋白質，以及濃差極化、膜污染問題導致通量下降等方面。

2.2 荷電膜超濾過程在乳清蛋白分離中的應用

在乳清加工過程中，雖然常利用超濾過程來制備WPC 和WPI，但是當制備單個功能活性蛋白，尤其蛋白間分子量大小接近時，僅靠超濾膜的孔徑篩分作用，很難將目標蛋白有效地分離，獲得的蛋白純度也很低。有研究者指出，在乳清蛋白的分級分離過程中，只有當待分離目標蛋白與共存蛋白之間的分子量相差10 倍以上時，超濾過程才能將兩者有效地分離。為了提高分子量接近的蛋白間的分離度，有研究者嘗試采用荷電超濾膜，即借助蛋白質分子表面的電荷與超濾膜表面的電荷之間的靜電作用，以提高超濾膜的選擇性，從而實現(xiàn)分子量接近的蛋白間的分離。

乳清中α-La 和β-Lg 的相對分子量非常接近，僅憑超濾膜孔徑大小的篩分作用很難將兩者有效分離。但兩者的等電點不同（表1），因此可通過調節(jié)溶液的pH，進而改變α-La 和β-Lg 的凈電荷，從而使得二者和超濾膜間的靜電作用力存在差別，以提高超濾膜對兩種蛋白的選擇性。如Cowan等對聚醚砜超濾膜改性，使膜表面或孔中荷負電，用這種改性后的荷電超濾膜分離α-La和β-Lg的二元混合物。當二元模擬混合體系的pH為7.2時，荷電聚醚砜膜的選擇性比不荷電的原膜高5倍，從1.42提高到7.5 左右。該研究結果表明，荷負電的超濾膜與荷負電的β-Lg之間的靜電排斥作用增強了β-Lg的截留率，從而使得超濾膜的選擇性提高。Arunkumar等則在pH為4.3時使用MWCO為300kDa荷正電的復合再生纖維素膜，來分離α-La和β-Lg的二元混合物，其研究結果同樣表明，與不荷電的復合再生纖維素膜相比，荷電超濾膜的選擇性提高了近5倍，該研究進一步證明了荷電膜能夠有效地提高α-La和β-Lg間的分離選擇性。

上述研究中，雖然所使用荷電復合再生纖維素超濾膜的MWCO 比待截留的β-Lg 的分子量大15～20 倍，但借助于超濾膜與β-Lg 間的靜電斥力作用，仍可保持高的β-Lg 截留率和高的選擇性。此外，Arunkumar 等也嘗試了從牛奶血清滲透液（MSP）中分離α-La和β-Lg。MSP相比乳清中包含更多的β-Lg，β-Lg會更容易在膜表面堆積，因此α-La必須要穿過更厚的β-Lg溶液層，才能透過膜面，在一定程度上增加了α-La 的傳質阻力。但與不荷電的膜相比，荷正電的復合再生纖維素膜對MSP 中α-La 和β-Lg 的的選擇性仍然提高了近兩倍。此外，該研究中還使用了不同的級聯(lián)構型來提高兩種蛋白純度。結果表明，使用相同的荷正電超濾膜構成的三級膜系統(tǒng)更為適宜，α-La和β-Lg的純度分別可達87%和83%。即采用荷電膜進行級聯(lián)超濾可達到和色譜分離相當的純度，有望為α-La和β-Lg的分離提純提供一種新方法。

除了將荷電超濾膜用于乳清中最難分離的α-La和β-Lg 間的分離提純過程，也可用于分離其他乳清蛋白。如Vlino等使用MWCO為100kDa荷電膜對含有BSA 和LF 的二元混合物進行分離。當溶液pH 為5 時，BSA 不荷電而LF 荷正電，采用荷正電的膜可以使BSA 幾乎全部透過膜而LF 完全截留，BSA 的通量可達30.2g/(m·h)，遠高于Ndyaie所報道的通量2.0g/(m·h)。此外，也有研究者嘗試從乳清蛋白中分離糖巨肽（GMP）。如Bhushan用荷正電的膜從β-Lg 和GMP 的二元混合物中分離出GMP，不荷電的GMP 滲透過膜，而荷正電的β-Lg受到超濾膜的排斥作用而截留。最終結果表明，使用荷電的膜比不荷電的膜選擇性提高了6倍。緊接著作者還進行了放大實驗，證明了荷電膜可以從真實的奶酪乳清中分離出GMP。值得一提的是，在乳清中添加鹽會抵消掉膜荷電帶來的選擇性優(yōu)勢，但是通量會明顯增大。也有研究者制備含有聚六亞甲基雙胍制成的MWCO為1000kDa荷正電超濾膜用于乳清中GMP 的分離，與未荷電改性的超濾膜相比，其選擇性提高了14倍。另外，在超濾膜材料不變的情況下對比一級超濾與三級超濾系統(tǒng)對奶酪乳清中GMP的分離效果發(fā)現(xiàn)，一級膜系統(tǒng)可得到純度為90%的GMP，而三級膜系統(tǒng)則可將所分離的GMP的純度提高至97%。該研究再次證明荷電超濾膜采用級聯(lián)超濾的方法仍是獲得高純度和高收率的有效途徑。此外，所制備的含有聚六亞甲基雙胍制成的這種強荷正電膜可在電導率高達40S/m的乳清乳液中直接使用，無需額外添加清水稀釋，即該方法可以直接從奶酪乳清中分離出色譜純級的蛋白，這使得荷電膜超濾代替色譜法成為了可能，從而有利于乳清蛋白分離的大規(guī)模工業(yè)應用。

荷電膜不僅可用于單個目標蛋白的分離提純，也可以用來濃縮乳清蛋白。如Arunkumar 等就研究了使用大孔徑荷負電的再生纖維素膜濃縮乳清蛋白。將MWCO為100kDa的荷電膜與MWCO為10kDa的未荷電改性的超濾膜進行比較，結果表明，兩種情況雖得到相同的蛋白質截留率，但MWCO 為100kDa 的荷電超濾膜的通量卻比MWCO 為10kDa的未荷電改性的超濾膜的高出兩倍。這是因為，荷負電的超濾膜與荷負電的蛋白質之間存在靜電排斥作用。因此，使用大孔徑的荷電超濾膜可以在保持高蛋白質截留率的同時獲得更高的通量。此外，Arunkumar 等還測試了板式和卷式兩種不同膜組件對超濾濃縮乳清蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)使用兩種不同構造的膜組件，乳清蛋白截留率均可達98%。

由上可知，將荷電超濾膜用于乳清蛋白的分離、濃縮工藝，與普通超濾過程相比，具有更高的選擇性和滲透通量，蛋白質的收率也相應有所提高。荷電超濾膜不僅可用于乳清蛋白中主要的蛋白成分，如α-La和β-Lg等的分離，也可用于含量更少的蛋白，如LF和GMP等的分離過程。此外，荷電超濾膜的使用還可在一定程度上減少或避免膜污染的問題，增加了膜使用壽命的同時減少了運維費用，有利于進一步推動超濾膜技術在乳清蛋白分離與濃縮方面的工業(yè)應用。

3 電驅動膜在乳清蛋白分離中的應用

壓力驅動膜以跨膜壓力為驅動力，對于分子量大小相近的乳清蛋白，其選擇性仍然有限，需要通過多級膜系統(tǒng)或與其他技術相結合才能達到理想的的收率和純度。而電驅動膜以外加電場力為驅動力，借助于電泳遷移和孔徑篩分的共同作用，可進一步提高目標蛋白的分離選擇性。此外，壓力驅動膜過程中，溶液中不同的蛋白質在外界壓力的作用下容易沉積在膜表面或吸附堵塞膜孔；而電驅動膜分離過程中，電場力的存在會使得料液中部分荷相反電荷的大分子蛋白質背離超濾膜方向的遷移速度增加，膜面凝膠層減少或者消失，從而在一定程度上減輕了濃差極化和膜污染程度，有助于提高目標蛋白質溶液的滲透通量以及延長膜的使用壽命。因此，近年來電驅動膜技術在乳清蛋白分離中的應用引起了人們的關注。

3.1 電超濾過程在乳清蛋白分離中的應用

電超濾（EUF）是在傳統(tǒng)膜過濾單元上疊加電場，通過蛋白質電泳遷移率的差異和膜孔徑篩分作用來增強膜分離的選擇性，是降低濃差極化提高滲透通量和產品純度的有效方法之一。其有效性在果汁澄清以及濃縮和純化蛋白質中已經得到證實。在采用EUF濃縮BSA溶液的實驗中，Song等研究發(fā)現(xiàn)當施加電場時，目標蛋白質BSA 濃縮兩倍所需要的時間比不施加電場減少了80%。這說明EUF在提高滲透通量的同時增大了BSA 蛋白的截留率，加快了蛋白質的濃縮，成為常規(guī)超濾濃縮乳清蛋白的可行替代工藝。另外，在EUF 中滲透通量隨著電場、壓力和錯流速度的增加而增加，且pH 在蛋白等電點時可實現(xiàn)最大的分離度和更高的滲透通量。并且使用大孔徑的超濾膜時，膜污染進一步減少，滲透通量更高。

在膜上施加外加電場不僅提高滲透通量，也是提高分離選擇性和產品純度的有效方法。例如在分離兩個等電點不同的蛋白質過程中，適當調節(jié)pH可以使蛋白帶不同的電荷，選擇電場的極性就可使分子量較大的蛋白質分子向遠離膜的方向移動，從而便于分子量較小的蛋白質分子跨膜遷移，獲得更高的通量和純度。用電微濾（EMF）分離乳清蛋白混合物中LF的實驗中發(fā)現(xiàn)，在pH為7的中性條件下，LF 荷正電而β-Lg 和α-La 荷負電，當施加電場且陰極位于進料液一側時，α-La和β-Lg跨膜遷移到滲透室，而LF向遠離膜方向遷移被截留下來。LF 與兩種主要乳清蛋白β-Lg 和α-La 的分離因子分別達到3.0和9.1。這說明電場的應用使分離選擇性明顯增強。另外，外加電場使膜的滲透通量增加了3倍，且膜污染的程度顯著降低，該研究證明了EUF在奶酪乳清中的分離潛力。

影響EUF 性能的主要因素有兩個方面。一是進料液的性質：蛋白的荷電性及荷電量、酸堿度、進料濃度、電導率和電泳遷移率。二是主要的工藝參數：跨膜壓力、進料流速、電場強度和電流類型。這些因素需要相互調節(jié)以達到目標蛋白的分離或濃縮，同時減少膜表面的污染。例如EUF 應用于乳清蛋白分離時應確保被分離的蛋白質等電點明顯不同，以保持蛋白質的電泳遷移率具有顯著差異。同時還應注意待分離混合體系中鹽離子的濃度，由于鹽離子和蛋白質在外加電場的作用下，存在競爭遷移，過高的鹽離子濃度會對EUF 分離蛋白過程產生不利影響，即荷電的蛋白質在低離子強度的溶液中具有更好的分離效果。另外，電極與溶液界面會發(fā)生電解反應，影響溶液pH，進而對蛋白分離選擇性和收率造成負面影響。

此外，EUF過程中大多采用直流電場，但也有研究表明，交變電場或脈沖電場能明顯引起凝膠層和膜孔中荷電粒子的震動，從而進一步減輕蛋白污染，提高膜的滲透通量，降低過程運行能耗。以乳清蛋白中BSA 配制的模擬溶液為研究對象，Zumbusch等發(fā)現(xiàn)，當施加交變電場時，BSA的滲透通量增加，且電場的影響在低頻下更為明顯。Oussedik 等發(fā)現(xiàn)利用脈沖電場進行EUF是降低膜阻力的有效方法，采用脈沖電場（=700V/m）可使?jié)B透通量提高約300%。因此，不同的電場形式也為乳清中獲得具有潛在應用價值的蛋白質組分提供了一種有效的方法。

3.2 電滲析/超濾耦合技術在乳清蛋白分離中的應用

電滲析/超濾耦合技術（EDUF）是一種分離荷電大分子物質的新型技術。用超濾膜代替部分離子交換膜，或在傳統(tǒng)電滲析器的陰、陽離子交換膜間引入超濾膜，從而將電滲析和超濾過程有機結合而成的一種膜過程。EDUF將電滲析的應用領域擴展到了生物分子，如聚氨基酸、肽或蛋白質等的分離和濃縮領域。該技術主要根據物質分子量和電荷的不同來進行分離。最基礎的EDUF 構型是在傳統(tǒng)電滲析器的陰、陽離子交換膜之間引入一張超濾膜，從而構成的四隔室結構（圖3）。其中進料室位于陽極一側，進料液中的陽離子組分透過超濾膜遷移到回收室。EDUF中唯一的驅動力是垂直于流體流動方向的電場力，每種物質的荷電性不同，荷質比不同，則電泳遷移率亦不同，進而導致遷移速度和遷移方向各不相同，而達到分離的目的。EDUF 與傳統(tǒng)超濾過程相比，具有更高的選擇性，能夠有效減輕壓力驅動超濾膜過程的的膜污染問題。此外，電滲析過程中發(fā)生的脫鹽作用使得它更適用于從高電導率的進料溶液中分離蛋白質。

圖3 EDUF膜對結構

EDUF 的操作模式一般分為分離模式和洗脫模式兩種（圖4）。在分離模式下，兩個隔室分別加入含有兩種溶質A 和B 的混合溶液。在洗脫模式下，其中一個隔室包含A和B的混合溶液，另一個隔室則加入緩沖溶液。Galier 等研究了分離和洗脫兩種操作模式，以分離α-La 和牛血紅蛋白。當α-La 和牛血紅蛋白的二元混合模型溶液的初始濃度為0.1g/L 時，在洗脫模式下獲得的濃縮α-La 純度99.0%，收率66%，而在分離模式下α-La 純度60%，收率84%。很明顯，分離模式的蛋白收率是洗脫模式收率的1.3 倍，這表明就生產而言，分離模式可以達到更高的收率，并且對于分離相反電荷的蛋白質更可取。相反，為了分離純度更高，洗脫模式則是首選，特別是對于分離荷同種電荷的蛋白質。

圖4 EDUF的兩種模式

除此之外，其他研究者也驗證了EDUF在分離單個乳清蛋白方面的可行性。Ndiaye 等使用EDUF 體系從乳清中分離出了LF。當使用MWCO為500kDa的聚醚砜超濾膜從pH 為3.0、LF 含量為1g/L 的稀溶液中分離LF 時，過程運行4h后的收率達到46%。但當從LF 含量較高（1.1g/L±0.2g/L）的模擬乳清溶液中分離LF，LF 的收率則只有15%，明顯低于稀溶液時的遷移率。這可能是由于LF 與乳清中其他共存的蛋白間存在相互作用、相互競爭的關系，也有可能是因為乳清中所含的小分子礦物質首先遷移，從而降低了LF的電泳遷移率。更重要的是，在該研究中還發(fā)現(xiàn)，β-Lg 在每一種實驗條件下，透過液中所占的比例都很高。尤其是在pH為3.0和4.0時，透過液中β-Lg的含量占總遷移蛋白的60%～64%。這個含量比之前采用壓力驅動或者離子交換工藝得到的β-Lg 含量都要高，且過程的比能耗最低。該研究證明了EDUF從乳清中分離β-Lg 的潛力。Wang 等研究了用EDUF 將LF和IgG與其他乳清蛋白分離，且在分離過程中使用一對限制膜來防止回收的LF 和IgG 泄露到電極溶液中。而Deng 等則比較了不荷電的聚丙烯酰胺膜和陰、陽離子交換膜分別作為電極限制膜時過程的分離性能。發(fā)現(xiàn)使用聚丙烯酰胺膜可以保持料液環(huán)境穩(wěn)定，進料室和透過室的pH 變化很小；以陽離子交換膜作為限制膜的EDUF構型可獲得最高的蛋白質回收率，而當分離帶有凈正電荷的蛋白質時，則最好使用陰離子交換膜作為限制膜，以減小膜面蛋白吸附污染。

EDUF 分離過程的選擇性可以通過調整緩沖溶液組成及pH、膜孔徑等來提高。根據分離目的以及分離模式的不同，EDUF分離體系中的超濾膜平均孔徑可以選擇大于目標蛋白大小，以截留混合物中的其他大分子物質，而使得目標蛋白順利透過超濾膜；也可以選擇小于目標蛋白大小的膜孔徑，以允許更小的物質通過，目標蛋白被截留而實現(xiàn)蛋白的濃縮和純化過程。此外，當溶液的pH 大于蛋白質等電點時，蛋白帶負電，而溶液的pH 小于等電點時，蛋白則帶正電。因此，在外加電場的作用下，可通過調整緩沖溶液組成及pH，使得待分離的目標蛋白與其他共存蛋白荷有不同性質的電荷，繼而在電泳遷移和孔徑篩分的雙重作用下，實現(xiàn)目標蛋白的分離和濃縮。如Gailer 等曾報道，在EDUF分離蛋白過程中，過程的選擇性主要是基于溶液中不同物質傳質速率的差異，而這種差異可能是由于電泳遷移率的差異（基于電荷模式），也可能是由于膜孔和溶質的大小不同而產生的尺寸排斥效應（基于尺寸的模式），或是兩者的組合（基于電荷和基于尺寸的模式）。在嘗試利用EDUF 過程分離α-La和β-Lg的實驗中，曾討論了電荷模式和尺寸模式兩種方法分離兩種蛋白的可行性。最終研究發(fā)現(xiàn)，改變溶液的pH 比改變膜孔孔徑對提高α-La的收率更為有效，使用MWCO為100kDa的醋酸纖維素膜、pH 為4.8 時，獲得了更高的分離效率，二者的分離系數為1.2。另外，在分離α-La和牛血紅蛋白的研究中則發(fā)現(xiàn)，在不影響純度和產品收率的情況下，增加進料的濃度可以至少將產量提高5 倍。而不同的膜材料也對蛋白遷移有影響，Wang采用的相轉化法制備的聚丙烯醇膜對LF 和IgG有強排斥性，則允許乳清中其他蛋白質以高通量通過。

3.3 EDUF分離乳清蛋白活性肽的應用

將乳清蛋白進一步水解，分離出其中具有特定價值的活性肽是乳清蛋白資源化利用的另一種方法。乳清蛋白是大分子蛋白，在人體中水解成短肽和游離氨基酸后方可被吸收，且對熱、酸敏感，易變性。研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白通過酶解或發(fā)酵等方法可以獲得多種具有獨特理化性質的生物活性肽。活性肽相對分子量小，可被人體快速吸收。目前，人們已經從乳清蛋白水解液中提取了諸如抗菌肽、降血壓肽、抗氧化肽等活性肽。

近年來一些研究顯示采用EDUF可以成功從食品副產品中分離不同來源的肽，該技術不僅已用于分離和純化大豆、亞麻籽、魚、雪蟹、苜蓿或乳清蛋白水解物，而且還用于分離脫乙酰殼多糖低聚物、煙草多酚、綠茶兒茶素或蔓越莓果汁中抗氧化劑的富集等。對于乳清中的β-Lg，用胰蛋白酶水解后的產物中大約含有40 個肽。Poulin 等通過EDUF 成功地從β-Lg 的胰蛋白酶水解產物中分離出了13 種多肽。用兩或三張超濾膜可實現(xiàn)同時分離陽離子和陰離子活性肽，其中可以用于抗高血壓的ACE抑制肽β-lg142-148的收率最高，為10.72%。另外，超濾膜的引入方式、電場強度和進料溶液流速對目標肽分離性能的影響研究結果表明，有效膜面積的增加和電場強度的提高可使目標肽濃度增加。相反，料液流速對總肽向透過液中的遷移沒有太大影響，但會引起選擇性的變化。Doyen 等實現(xiàn)了在一個電滲析裝置中同時進行β-Lg 的酶促水解和水解產物的分離。成功分離出15個陰離子肽和4個陽離子肽。另外，蛋白質水解前的預處理、使用不同的酶來酶解蛋白、蛋白質本身的水解都會影響EDUF過程中對活性肽的分離。如沈浥等研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶酶解的效果最好，而相比單酶酶解，復合酶酶解不僅可以提高乳清蛋白模擬溶液的酶解效率，在一定程度上還可以修飾苦味肽，減少產品苦味。

超濾膜的理化性質對EDUF分離活性肽有顯著的影響。Bazient 課題組發(fā)現(xiàn)在濾膜的九種理化性質對比中，zeta電位、電導率、粗糙度和過濾層大孔分布百分比四個性質對肽的整體遷移顯著相關。此外對個別單肽而言，接觸角也有相當大的影響。同時根據冗余分析發(fā)現(xiàn)，zeta 電位和粗糙度是肽污染的主要因素，表明肽的污染主要是由粗糙的膜表面與活性肽間的靜電相互作用造成的。另外采用MWCO分別為30kDa和50kDa聚醚砜膜對比發(fā)現(xiàn)，膜孔徑不影響肽的污染，而相同條件下聚偏氟乙烯膜和聚丙烯腈膜顯示，當膜孔徑增大時，肽的污染減少，且無論肽的親水性如何，疏水性的膜總是比親水性膜的污染程度更大。此外，在Kadel的結論中最后給出了分離各種乳清蛋白水解物中主要活性肽的濾膜最佳類型。例如分離降膽固醇肽IDALNENK 最好是采用分子量5kDa 的聚醚砜膜，這為其后的研究工作提供了極大的便利和有益參考。

4 乳清蛋白分離中的膜污染及其控制

在膜分離過程中，膜污染和濃差極化現(xiàn)象是造成膜通量下降的主要原因。同時蛋白的流失也制約著膜技術在乳清蛋白回收中的推廣應用。Muller等研究發(fā)現(xiàn)隨著跨膜壓力的升高，膜污染加重，導致通量下降，透過的α-La濃度減小，降低了α-La的收率。孫顏君等表明乳清中含有磷酸鈣，它起到穩(wěn)定乳清蛋白結構的作用。由于磷酸鈣分子量較小，很容易透過膜孔徑與蛋白分離，當磷酸鈣失去了蛋白保護層，容易在膜表面和膜孔中形成沉淀。另外，乳清蛋白聚集體的形成也是超濾過程中造成膜污染的原因，這種現(xiàn)象是由于蛋白質-蛋白質和蛋白質-膜的相互作用力造成的。在乳清蛋白分離的膜過程中，pH 和鹽離子的變化均會影響蛋白質的構象和電荷的變化，從而聚集沉積在膜表面使污染加劇。因此，通過調節(jié)超濾過程中的操作參數，如料液組成和濃度、pH、溫度、離子強度以及跨膜壓力等可以改善膜污染問題。研究顯示，在蛋白質等電點條件下膜污染嚴重且通量最小，當pH 遠離等電點時通量增加，這主要是由于蛋白質在等電點處溶解度最小，容易沉積在膜表面。此外，較低的跨膜壓力、略高的溫度、低離子強度都能在一定程度上減少膜污染。另外考慮到乳清蛋白是一種復雜的混合蛋白，針對不同目標蛋白的不同性質，對應的最適操作條件也不同。

除此之外，也有研究者發(fā)現(xiàn)，乳清中的α-La、β-Lg以及活性肽等與大分子蛋白IgG相比，更容易在膜表面發(fā)生沉積以及堵塞在膜孔中導致膜污染。研究證實，與小尺寸蛋白質相比，大尺寸蛋白質對膜的影響較小，也更容易清潔。因此在超濾濃縮乳清蛋白的過程中增加蛋白質尺寸也可以減少膜污染，同時增加膜通量和乳清蛋白回收率。其中，酶催化使蛋白質聚合，可以增大蛋白質整體大小，產生的酶聚合蛋白同樣具有一定的功能特性可應用于食品和化工領域。王文瓊等采用酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合，聚合后的大分子蛋白在膜表面形成疏松的餅層，增加了小分子蛋白的截留，酶處理后濾餅阻力和膜總阻力顯著性降低。相對于沒有通過酶聚合處理的對照組，膜通量提高了20%，乳清蛋白的截留率提高了27%。另外，采用轉谷氨酰胺酶催化交聯(lián)蛋白質時，膜通量提高了30%～40%，截留率則提高了15%～20%。該研究結果表明，不同酶催化蛋白得到的蛋白形狀、表面電荷、形成的餅層都不相同，得到的通量和蛋白收率也不同。據文獻報道，在能夠交聯(lián)蛋白質的各種酶中，轉谷氨酰胺酶是最有效的，因為它可以通過形成分子內和分子間交聯(lián)來催化α-La、β-Lg，甚至酪蛋白巨肽，從而形成高分子聚合物。

酶催化蛋白聚合可以減少膜污染的另一個原因是溶液中微粒的粒徑和形狀對膜過濾效果的影響。研究表明，當濾液中的物質為方塊或者針形，過濾的速率會大大增加，而當濾液中的物質為圓形時，過濾速率會減小。這主要是因為方形和針形兩種形狀所形成的餅層可以增加過濾速度。由于乳清蛋白中的α-La和β-Lg為球形蛋白，因此在蛋白聚合酶的作用下聚合形成不規(guī)則形狀，在膜表面形成疏松的餅層，增加了過濾的速度，膜通量增加。

調節(jié)膜與蛋白之間的相互作用也是減輕膜污染和濃差極化的方式之一，采用新型的膜材料或者改善現(xiàn)有膜材料的親疏水性、荷電性等方式增大對溶質分子的排斥力，以減少膜表面蛋白沉積。例如，當蛋白質表面的靜電荷和膜表面的電荷之間的電性相反時，膜與蛋白間的靜電吸引作用將會促進蛋白質在膜表面的吸附，吸附蛋白也有可能在膜上發(fā)生變性和聚集。而當膜與蛋白間存在靜電排斥作用時，將會有效減輕或避免蛋白在膜面的吸附。另外，膜材料的親、疏水性也會影響膜通量的大小。如聚砜膜是疏水性膜材料，疏水性膜對蛋白的吸附能力比較強，蛋白質會在膜表面沉積或吸附到膜孔中而導致膜孔阻塞通量下降，這與Damar 等實驗中得到的結論相同。一般認為，在超濾過程中，親水性的膜對乳清蛋白具有較高的滲透通量和較低的通量衰減率；且親水性的膜清洗后膜通量的恢復通常更快。當然，目前很多改性的新型超疏水復合膜對蛋白同樣具有高的膜通量和截留率，且同時兼具良好的抗污能力。除此之外，膜的粗糙度對蛋白的跨膜遷移也有影響，高粗糙度的膜增加了蛋白和乳糖的截留率

目前，無機陶瓷膜由于耐高溫、耐腐蝕、抗污染強等優(yōu)點也逐漸用于乳清蛋白膜回收的研究中。在Erdem等、Almcijam 等、Hinkocva 等的實驗中陶瓷膜展現(xiàn)了較高的蛋白截留率。但就總體來看，在乳清蛋白回收領域主要還是采用價格低廉、技術成熟的高分子聚合膜。常見的膜材料，例如再生纖維素膜對乳清蛋白有更高的濃縮效果，有較高的抗污染性能，但是它的選擇性較差。同時，在分離α-La和β-Lg的實驗中發(fā)現(xiàn)，復合再生纖維素膜對α-La的截留率更高，而聚醚砜膜對β-Lg的截留率較高。此外，聚醚砜膜用于制備乳清蛋白粉效果更好，有明顯的耐氯性。總而言之，具有親水性、表面光滑、孔隙率高、粗糙度低、孔結構呈海綿狀結構的膜材料最適合分離濃縮乳清蛋白，因為它具有較強的抗污染能力、高的截留率和高通量。

由于蛋白質和超濾膜間相互作用的復雜性，目前膜污染仍然是膜技術應用于乳清蛋白分離濃縮方面的主要挑戰(zhàn)。有研究者建立了不同的數學模型用于預測膜污染過程中膜通量隨時間的變化規(guī)律，其中完全堵塞、中間堵塞、標準堵塞、濾餅形成等模型通常都被用來分析蛋白質過濾中的通量衰減問題。例如Corbatón-Báguena 等結合兩種主要污染機制（完全孔隙堵塞和濾餅形成）構建組合模型，所構建模型的擬合精度高于0.960。也有研究者借助新技術對膜污染的形成過程進行監(jiān)測，如采用紅外光譜、紫外/可見反射光譜監(jiān)測法、共聚焦激光掃描顯微鏡、熒光光譜、流動電勢、超聲波時域反射儀等先進分析儀器，檢測乳清的超濾過程中膜污染的形成機制，探討蛋白質-蛋白質、蛋白質-膜之間的相互作用機理，為有效控制膜污染提供理論依據。

5 結語

乳品行業(yè)乳清廢水的排放造成了大量的蛋白資源浪費和水資源浪費，加重了環(huán)境保護的難度。因此，將乳清中的蛋白進行資源化回收利用具有極大的環(huán)境意義和經濟效益。乳清蛋白的高營養(yǎng)和功能特性使其在食品和制藥領域具有廣闊的應用前景和市場潛力。隨著乳清蛋白分離技術產業(yè)化的實現(xiàn)，將會提高乳清蛋白產品性價比，降低市場中功能性食品或保健品的原料成本，獲得極大的經濟效益。本文總結了眾多學者在探索乳清蛋白分級分離方面取得的大量研究成果。目前超濾技術已廣泛用于工業(yè)化制備乳清蛋白粉等產品，且電驅動膜分離技術EUF以及EDUF工藝體現(xiàn)了良好的分離效果。探索出低成本、高選擇性、高純度、高收率、可工業(yè)化實施的膜分離方法是未來的主要發(fā)展方向。另外還需要從以下幾個方面進行深入的理論研究與工藝開發(fā)。

（1）目前還少有研究從乳清中分離提取得到純度較高的單個α-La或β-Lg產品。因此需要積極探索開發(fā)新型膜材料、模組件和工藝設計等，進一步提高兩者的分離效率。

（2）荷電超濾膜技術與EDUF技術都極大地提高了過程的分離選擇性，因此將荷電超濾膜結合EDUF 技術具有重要意義。可以進一步研究EDUF工藝中超濾膜不同的荷電性、荷電量對乳清中蛋白質分離的影響。

（3）對于EUF和EDUF技術，其應用到實踐中還存在很多技術上和商業(yè)化的難題，需要通過進一步研究評估其技術和經濟可行性。

（4）分離純化后的濃縮干燥工藝，也是實現(xiàn)功能性乳清蛋白產業(yè)化的重要部分，需要進一步研究如何保持純化后蛋白質一定的生物活性及其特有結構，以便發(fā)揮其功能特性。