慢病毒介導的短發夾RNA敲低PIWIL2基因對肝母細胞瘤細胞生物學行為的影響

李桐 楊霞 陳勝男 何靜 劉瑤 郝希偉 夏楠 董蒨，

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 小兒外科； 2 數字醫學與計算機輔助手術實驗室)

肝母細胞瘤(hepatoblastoma，HB)是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤，約占兒童肝臟原發性惡性腫瘤的80%[1]，且近年來全球HB的年發病率呈上升趨勢。手術切除聯合化療提高了HB患兒的長期生存率(5年生存率已達80%以上)[2]，但仍有部分患兒化療效果不佳，出現復發，致預后較差[3]。關于HB發生的啟動基因以及靶向藥物治療一直是目前的研究熱點[4-6]。本研究團隊前期根據16例HB患兒的腫瘤組織及瘤旁正常組織全外顯子測序的結果，進行生物信息學分析，篩選出一個新的候選基因——PIWL樣蛋白2(PIWIL2)基因，目前研究結果顯示PIWIL2在食管鱗狀細胞癌、肝癌等多種人類腫瘤組織中的表達均上調，提示該基因可能參與了這些腫瘤的發生發展[7]。但PIWIL2基因在HB中的功能尚未見報道。基于此，本研究應用免疫組織化學(IHC)方法對HB腫瘤組織及其瘤旁正常組織中PIWIL2蛋白的表達進行檢測，并通過構建慢病毒介導的短發夾RNA(shRNA)載體敲低HB細胞HUH6中PIWIL2，進一步探討PIWIL2對于HB細胞增殖和遷移的影響，探討HB的發病機制和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2015年7月—2020年12月青島大學附屬醫院小兒外科收治的經病理組織學檢查確診的33例HB患兒的腫瘤組織及瘤旁正常組織標本。HB細胞HUH6、正常肝細胞LO2購自中國科學院細胞庫(上海)，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(南京諾唯贊生物技術有限公司)，CCK-8試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)，慢病毒載體及轉染試劑(上海吉凱基因醫學科技股份有限公司)，PIWIL2多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1IHC方法檢測患兒HB組織中PIWIL2蛋白的表達 將33例患兒的HB組織及瘤旁正常組織標本經過40 g/L甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片。按照試劑盒說明書進行IHC，封片，于倒置光學顯微鏡下觀察染色結果并對病理切片進行全景掃描。IHC結果判讀標準：①染色強度：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。②陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，陽性細胞比例<30%為1分，陽性細胞比例30%～60%為2分，陽性細胞比例>60%為3分。染色強度和陽性細胞百分比的乘積為最終IHC評分結果。

1.2.2HUH6細胞及LO2細胞培養和HUH6細胞的感染 HUH6細胞及LO2細胞在含體積分數0.05青鏈霉素溶液以及體積分數0.10胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養液中于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度培養箱中培養，培養至對數生長期后用于后續實驗。首先根據慢病毒感染手冊進行HUH6細胞慢病毒感染的預實驗，結果顯示慢病毒感染HUH6細胞的最佳感染復數(MOI)為10，最佳作用時間為12 h，作為后續HUH6細胞的感染條件。分別以shRNA-PIWIL2慢病毒和陰性對照慢病毒感染HUH6細胞，分為實驗組和對照組，感染12 h以后更換完全培養液繼續培養，感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察被感染細胞的熒光強度，計算熒光細胞的比例，采用含2 mg/L嘌呤霉素的完全培養基對兩組細胞進行篩選，獲得穩定感染的細胞，培養至對數生長期后用于后續實驗。

1.2.3RT-qPCR檢測HUH6細胞、LO2細胞及實驗組、對照組細胞PIWIL2 mRNA的表達 取處于對數生長期的HUH6細胞、LO2細胞及實驗組、對照組細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，根據RT-qPCR試劑盒使用說明書配置反應體系并進行RT-qPCR，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為對照，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達量。引物名稱及其序列見表1。每個樣品均設置3個復孔，實驗重復3次，結果取均值。

表1 引物名稱及其序列 Tab.1 Primer names and sequences

1.2.4克隆形成實驗、CCK-8實驗檢測細胞的增殖能力 克隆形成試驗：取處于對數生長期的兩組細胞，以每孔約1 000個細胞接種于6孔板中，每組設3個復孔。培養至第14天，PBS洗滌3次，甲醛固定后以2.50 g/L結晶紫染液進行染色，蒸餾水沖洗，室溫晾干后顯微鏡下觀察并拍照。以Image J軟件計算細胞克隆形成數目，實驗重復3次，結果取均值。CCK-8實驗：取處于對數生長期的兩組細胞，以每孔約3 000個細胞接種于96孔板中，每組6個復孔，嚴格按照CCK-8試劑盒說明書操作，分別于第1～4天同一時間點使用酶標儀檢測波長450 nm處各孔的吸光度值，實驗重復3次，結果取均值。

1.2.5Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力 將包含處于對數生長期兩組細胞的培養液更換為無FBS培養液，培養12 h后，以每孔約2×105個細胞接種于上層小室中，下室加入600 μL含體積分數0.20的FBS培養液，培養48 h后，拭去上層小室細胞，PBS洗滌3次，甲醛固定后以2.50 g/L結晶紫染液進行染色，再蒸餾水沖洗，室溫晾干后顯微鏡下觀察并拍照。以Image J軟件計算遷移細胞數。實驗重復3次，結果取均值。

2 結 果

2.1 HB腫瘤組織及瘤旁正常組織中PIWIL2蛋白的表達

IHC染色和全景掃描結果顯示，HB患兒腫瘤組織中PIWIL2蛋白表達為強陽性，腫瘤細胞胞質呈棕褐色，癌旁組織中PIWIL2蛋白表達為弱陽性或陰性，細胞質呈淡黃色或不著色(圖1)。PIWIL2蛋白定位于細胞質，黑色箭頭示腫瘤組織，細胞質呈棕褐色；白色箭頭示瘤旁正常組織，細胞質呈淡黃色。腫瘤組織和瘤旁正常組織中PIWIL2蛋白的IHC評分分別為(7.24±2.19)、(3.42±2.14)分，兩者比較差異有顯著性(t=7.16，P<0.05)。

圖1 HB患兒腫瘤組織及瘤旁正常組織中PIWIL2蛋白表達(IHC染色，100倍)Fig.1 The protein expression of PIWIL2 in tumor tissue and adjacent tissue in children with HB (IHC staining, ×100)

2.2 兩種或兩組細胞中PIWIL2 mRNA的表達水平比較

HUH6細胞與LO2細胞PIWIL2 mRNA相對表達量分別為184.50±15.30、1.00±0.35，兩者比較差異具有顯著性(t=20.77，P<0.05)。對照組和實驗組HUH6細胞PIWIL2 mRNA的相對表達量分別為1.00±0.11、0.22±0.06，兩者比較差異具有統計學意義(t=11.74，P<0.05)

2.3 兩組細胞增殖能力、遷移能力比較

克隆形成實驗結果顯示，對照組和實驗組細胞克隆形成數目分別為220.30±17.03、74.67±8.67，兩者比較差異具有顯著的意義(t=7.62，P<0.05)。CCK-8實驗結果顯示，時間、組別及時間與組別交互作用均對細胞的增殖有明顯影響(F組別=86.48，F時間=138.95，F時間*組別=33.08，P<0.05)；單獨效應分析結果顯示，與第1天相比，兩組第2～4天細胞的增殖水平明顯提高(F=22.35～149.68，P<0.05)，與對照組第3、4天相比，實驗組第3、4天細胞增殖水平明顯降低(F=17.68、165.40，P<0.05)。見表2。Transwell遷移實驗結果顯示，對照組與實驗組遷移至下室的細胞數分別為266.70±9.21、56.33±5.55，兩者比較差異具有顯著性(t=20.05，P<0.05)。

表2 兩組細胞增殖能力比較Tab.2 Comparison of cell proliferation ability between the two groups

3 討 論

近年來針對腫瘤治療的靶向藥物取得顯著進展，通過靶向藥物特異性地作用和調控腫瘤發生過程中的靶分子及信號通路，從而達到治療腫瘤的目的[8]。HB作為兒童肝臟惡性腫瘤，長期以來威脅兒童的生命健康，HB發病機制并不明確，因此進一步探尋HB發生機制及治療的新靶點尤為重要。

PIWIL2屬于Argonaute蛋白家族的Piwi亞族，Piwi亞族在胚胎形成發育以及干細胞的自我更新中發揮著重要的作用[9]。目前對其家族中PIWIL2基因研究最多。正常情況下，PIWIL2僅表達于生殖細胞和胚胎干細胞中，在生殖細胞發育和維持胚胎干細胞的多能性方面起核心作用[10-11]，同時PIWIL2在多種惡性腫瘤中也作為促癌基因發揮顯著作用[12-15]。LI等[16]研究發現，PIWIL2蛋白在結腸癌組織中的陽性表達率明顯高于鄰近的非結腸癌組織；WANG等[17]進一步發現，PIWIL2廣泛表達于結腸癌及其癌前病變腺瘤組織中，且從癌旁正常組織、腺瘤組織到結腸癌PIWIL2蛋白陽性表達率呈遞增趨勢，提示PIWIL2可能對結腸癌具有早期診斷意義。ZHAO等[18]的研究顯示，PIWIL2在食管鱗狀細胞癌中高表達，且與疾病發生發展及預后關系密切，也表明PIWIL2表達可能與腫瘤的預后有關。本研究應用IHC方法法檢測HB患兒腫瘤組織及瘤旁正常組織中PIWIL2蛋白的表達情況，結果顯示，腫瘤組織中PIWIL2蛋白表達水平顯著高于瘤旁正常組織，另外RT-qPCR檢測結果也顯示PIWIL2在HUH6細胞中高表達，在LO2細胞中低表達，提示PIWIL2可能在HB發病中發揮著重要作用。

腫瘤的生物學行為包括異型性、轉移和擴散，惡性腫瘤的特征表現為短時間內的過度增殖和失控性生長，這是由于腫瘤細胞惡性增殖的發生及抗凋亡機制的激活導致的[19-20]。腫瘤細胞通過多種途徑誘導部分或全部的凋亡途徑失活，以維持細胞持續增殖[21]。有研究發現PIWIL2的高表達與腫瘤細胞及腫瘤干細胞的增殖、凋亡以及細胞的轉移、侵襲等均顯著相關，PIWIL2敲低可誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長[22-25]。本研究為進一步揭示PIWIL2在HB細胞生物學行為中的作用，采用慢病毒介導shRNA敲低HUH6細胞中PIWIL2的表達，CCK-8實驗、克隆形成實驗及Transwell遷移實驗結果均顯示，敲低PIWIL2會抑制HUH6細胞的增殖和遷移，提示PIWIL2在HB的發生發展中具有重要作用。

近年來的研究證實PIWIL2可通過不同途徑調控腫瘤的發生發展，沉默PIWIL2可下調前列腺癌上皮細胞-間質轉化相關調控因子Snail、Slug和Twist的表達，還可以降低基質金屬蛋白酶9的表達[26]。PIWIL2可通過P38途徑磷酸化角蛋白8來抑制其降解，從而抑制Fas介導的細胞凋亡[27]。ZHANG等[28]通過用PIWIL2基因對人包皮成纖維細胞進行重編程，將穩定過表達PIWIL2細胞接種到裸鼠體內，成瘤率100%，腫瘤組織中干細胞相關轉錄因子Oct-4、Nanog以及Sox2表達上調，提示PIWIL2可以促進成纖維細胞向腫瘤干細胞惡性轉化，并進一步對獲得的腫瘤干細胞樣細胞轉錄組測序發現，PIWIL2可能參與了DNA損傷修復以及堿基錯配修復、堿基切除修復等途徑[29]。此外，PIWIL2抑制GSK3β誘導的β-catenin磷酸化和泛素化，從而增加β-catenin在細胞核中的積累，上調β-catenin和細胞周期蛋白D1表達，可促進腫瘤細胞的增殖[14]。Wnt/β-catenin通路是誘導HB發生最主要的一條通路，多達80%的HB患者中可檢測到CTNNB1(編碼β-catenin)基因的突變[5]，提示PIWIL2在HB發生中起著至關重要的作用。

綜上所述，PIWIL2在HB腫瘤組織及HUH6細胞中高表達，敲低PIWIL2能明顯抑制HUH6細胞增殖，降低細胞遷移能力，提示PIWIL2可能具有調節HB細胞增殖與遷移能力。后續本課題組會進一步探討PIWIL2調控HB細胞增殖和遷移的關鍵通路，以進一步闡述HB發生發展的機制。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL27051)。所有試驗過程均符合《赫爾辛基宜言》。受試對象親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL27051), and all experimental protocols were carried out by following the Declaration of Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：李桐、楊霞、陳勝男、何靜、劉瑤、董蒨參與了研究設計；李桐、郝希偉、夏楠、董蒨參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byLITong,YANGXia,CHENShengnan,HEJing,LIUYao, andDONGQian. The manuscript was drafted and revised byLITong,HAOXiwei,XIANan, andDONGQian. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.