以人臍帶間充質干細胞為種子細胞促進脂肪移植存活率的研究

劉超 魏計超 莫志洋 趙亞平 高慧 趙愛群 李燕 李素芬 孫鵬飛

(1 石家莊市人民醫(yī)院整形美容中心，河北 石家莊 050000； 2 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院藥劑科；3 青海省人民醫(yī)院整形外科； 4 石家莊市人民醫(yī)院手術室； 5 中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院整形七科)

自體脂肪作為一種理想的軟組織填充材料，其不僅可修復因先天畸形、后天創(chuàng)傷或腫瘤術后導致的軟組織缺損，還可對軟組織凹陷和面部年輕化患者進行填充塑形。但自體脂肪的吸收率比較高，制約了其在臨床應用推廣[1]。自體脂肪移植后，在毛細血管再生以前，脂肪無法獲得氧氣和營養(yǎng)，脂肪細胞容易液化壞死，從而被機體吸收代謝，無法達到脂肪填充的理想效果[2]。因此，如何有效提高脂肪細胞移植后的存活率是整形外科領域研究的熱點。另外，在自體脂肪移植中，許多體型較瘦的患者因受到自體脂肪量少的限制，無法達到取材的目的而影響治療。因此本研究團隊一直在尋找一種用組織工程脂肪提高自體脂肪移植存活率的方法。

間充質干細胞(MSCs)可以分化為多種細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞等，在再生醫(yī)學以及組織工程學中是公認的新型種子細胞。其中，人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)的分化能力更強[3]。本實驗將具有多向分化潛能的hUC-MSCs作為種子細胞，誘導其分化為組織工程脂肪，探討其在脂肪移植中提高脂肪存活率的能力，為組織工程脂肪應用于整形外科臨床奠定理論基礎。

1 材料及方法

1.1 材料來源

BALB/c雄性裸鼠30只(北京華阜康生物科技有限公司)，6～8周齡，體質量(25±2)g。SD雄性大鼠 10只(河北醫(yī)科大學動物實驗中心)，8～10周齡，體質量(200±10)g。DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(美國HyClone 公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，青霉素-鏈霉素混合液(美國Gibco公司)。

1.2 hUC-MSCs的獲取、培養(yǎng)、鑒定及成脂誘導

無菌條件下獲取石家莊市人民醫(yī)院婦產科足月妊娠分娩新生兒臍帶標本，1～3 h內在無菌條件下處理，首先將臍帶剪成約4 cm長組織段，去除臍靜脈和臍動脈，將臍帶中華通膠組織撕裂成條索狀，剪成體積約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，向90 mL DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中加入含體積分數0.10胎牛血清10 mL及5 000 kU/L的青霉素-鏈霉素混合液1 mL，均勻混合成培養(yǎng)液。將臍帶組織塊置入培養(yǎng)液中，于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度孵育箱內培養(yǎng)，7 d后首次換液，以后每3 d換液一次，待細胞融合度約80%時，以2.5 g/L的胰酶消化液消化，按1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。采用流式細胞術檢測培養(yǎng)至第4代時hUC-MSCs表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表達。然后應用含有1.0×10-6mol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛的誘導基對第4代hUC-MSCs進行成脂誘導。每3 d換液一次，24 d后進行油紅O脂肪染色鑒定誘導情況。

1.3 脂肪顆粒制備

10只SD大鼠均使用脫椎方式處死，將大鼠腸系膜、腹股溝處的脂肪取出，使用PBS液沖洗3次后，將其剪成體積約為0.5 mm×1 mm ×1 mm～1 mm×1 mm×1 mm大小顆粒，用50 mL離心管裝入脂肪顆粒并混合10 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，使用離心機對脂肪顆粒進行離心(1 200 r/min)，時間為3 min，將上層的脂肪顆粒取出備用。

1.4 動物模型制備

采用隨機數字表法將30只裸鼠分為7 d組、14 d組和28 d組，每組10只裸鼠。每組裸鼠均采用同體對照法，左側為實驗側，右側為對照側。使用1 mL注射器將成脂誘導24 d后的第4代hUC-MSCs 40 mg與大鼠脂肪顆粒360 mg均勻混合后注射至裸鼠左側(實驗側)腹部筋膜下，并將相同劑量的單純大鼠脂肪顆粒注射至裸鼠右側(對照側)腹部筋膜下。

1.5 移植脂肪組織病理學觀察及質量維持率測定

分別于第7、14、28天將3組裸鼠脫椎處死，使用眼科剪刀從裸鼠腹部筋膜下取出全部脂肪組織，使用電子天平稱質量后進行病理切片制備及HE染色，對3組裸鼠實驗側與對照側脂肪組織結構、細胞形態(tài)以及微血管含量等進行觀察比較。計算各組裸鼠移植脂肪組織質量維持率并行比較，移植脂肪組織質量維持率=(取出總脂肪組織質量/400 mg)×100%。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 hUC-MSCs流式細胞學檢測及成脂誘導結果

對第4代hUC-MSCs采用流式細胞學檢測顯示，細胞表面抗原CD29、CD44、CD105表達陽性率均在90%以上，CD14、CD34、CD45幾乎不表達，符合間充質細胞特性，鑒定第4代hUC-MSCs為純化的hUC-MSCs細胞。

hUC-MSCs加入成脂誘導基3～5 d后，hUC-MSCs細胞由梭形或多角形逐漸變得圓鈍(圖1A)。6～8 d后細胞呈圓梭形，細胞的胞漿內形成脂滴，細胞內脂滴逐漸融合變大，誘導23 d后鏡下觀可以明顯看到脂滴相互融合(圖1B)。誘導24 d經油紅O脂肪染色，細胞內可見大量被染成紅色的透亮的脂滴(圖1C)。由此可以判斷hUC-MSCs轉化成了脂肪細胞。

A：hUC-MSCs加入成脂誘導基3 d后的形態(tài)，B：hUC-MSCs加入成脂誘導基23 d后的形態(tài)，C：hUC-MSCs加入成脂誘導基24 d后進行油紅O染色的形態(tài)圖1 hUC-MSCs成脂誘導后鏡下觀(200倍)Fig.1 Morphological changes of hUC-MSCs after adipogenic induction under a microscope (200×)

2.2 3組裸鼠移植脂肪組織HE染色結果比較

7 d組對照側脂肪組織內部有炎性細胞，可見組織壞死和空泡形成。另外，脂肪組織外側有纖維組織形成(圖2A)。14 d組對照側脂肪組織內部壞死組織明確，脂肪組織切片呈網格狀(圖2B)。28 d組對照側脂肪組織中可見明顯壞死區(qū)，新生血管數目少(圖2C)；3組實驗側脂肪組織結構正常，新生血管明顯增多，脂肪組織炎癥不明顯(圖2D～F)。

A～C：7、14、28 d組裸鼠對照側移植脂肪組織HE染色結果，D～F：7、14、28 d組裸鼠實驗側移植脂肪組織HE染色結果

2.3 3組裸鼠移植脂肪組織質量維持率比較

7、14、28 d組實驗側移植脂肪組織質量維持率分別為(99.81±1.36)%、(95.20±1.83)%、(90.64±2.37)%。 7、14、28 d組對照側則分別為(71.26±5.85)%、(59.14±2.32)%、(50.59±1.94)%。重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、側別以及時間與側別交互作用對移植脂肪組織質量維持率有顯著的影響(F時間=126.54，F側別=2471.83，F時間*側別=30.43，P<0.05)。單獨效應結果顯示，7、14、28 d組裸鼠實驗側移植脂肪組織質量維持率呈逐漸降低(F=58.47，P<0.05)，對照側移植脂肪組織質量維持率也逐漸降低(F=225.28，P<0.05)；3組裸鼠實驗側移植脂肪組織質量維持率均顯著高于對照側(F=1 490.66～2 142.95，P<0.05)。實驗側脂肪組織外觀體積明顯大于對照側(圖3)。

A：實驗側，B：對照側

3 討 論

脂肪顆粒來源于人體或動物皮下脂肪，取材廣泛，且與機體相容性好、排斥性較低，是天然的生物填充材料[4]。移植自體脂肪的血管化一般發(fā)生在移植手術以后的24～48 h，脂肪血管化之前缺血缺氧的環(huán)境常導致脂肪細胞的壞死和吸收等[5-7]，提高自體脂肪移植后的存活率是自體脂肪移植手術成敗的關鍵，也一直是整形外科醫(yī)生的研究熱點。另外，在脂肪移植過程中，許多患者因為體型瘦小，脂肪量較少而使脂肪取材困難[8-9]。因此本研究將原材料來源廣泛、取材方便、易于培養(yǎng)、純度高、免疫源性低、具有多向分化潛能的hUC-MSCs作為種子細胞誘導生成脂肪細胞，并探究hUC-MSCs生成的脂肪細胞與脂肪顆粒共同移植對移植后脂肪組織存活率的影響。本研究期望同時解決組織工程脂肪來源問題和提高自體脂肪移植存活率問題，為hUC-MSCs來源組織工程脂肪在整形外科的應用提供實驗依據。

本研究使用hUC-MSCs來源的脂肪細胞與天然的脂肪細胞顆粒混合后移植于裸鼠腹部筋膜實驗側，并將對側設置為對照側。經對比研究發(fā)現，隨著移植時間的延長，移植脂肪細胞質量維持率逐漸降低。但7、14、28 d組實驗側脂肪細胞質量維持率持續(xù)高于對照側。由此可知，在移植脂肪組織中添加hUC-MSCs來源的脂肪細胞可以有效提高脂肪細胞的存活率，降低脂肪細胞的吸收率。

美國整形外科協會在討論自體脂肪移植存在的問題和面臨的挑戰(zhàn)時指出，移植脂肪1年以上的存活率僅為30%，同時也質疑了脂肪移植后的長期維持率和實際存活率[10]。有研究證實，移植后的脂肪顆粒早期處于缺血缺氧狀態(tài)，在這種環(huán)境中，脂肪組織會被液化和吸收。但缺氧對干細胞的旁分泌具有促進作用[11]，在缺血缺氧環(huán)境中，血管內皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)在hUC-MSCs的旁分泌作用下，可出現明顯的高表達。VEGF能促進血管內皮細胞的分裂和增殖，可有效促進脂肪移植后的血管化。bFGF是一種重要的有絲分裂刺激因子，可以促進新生血管形成。隨著新生血管的形成，可以有效改善缺血缺氧的環(huán)境，從而提高移植脂肪組織的存活率。VEGF、bFGF等因子不僅可以加快新生血管的形成，而且具有明顯的抗炎作用，可以有效促進脂肪組織移植后的成活[12-14]。因此本研究認為，移植進入裸鼠體內的hUC-MSCs來源的脂肪細胞仍然存在hUC-MSCs特性，在脂肪移植早期極度缺血缺氧狀態(tài)下，仍然會通過旁分泌方式釋放VEGF、bFGF等，加速移植脂肪組織中新生血管的形成，使血運快速重建，避免了脂肪細胞在長時間缺血缺氧狀態(tài)下壞死，從而提高了移植脂肪細胞的存活率[15-16]。

綜上所述，hUC-MSCs來源的脂肪細胞與天然的脂肪細胞顆粒混合后移植可以有效提高移植脂肪細胞的質量維持率。本研究為以hUC-MSCs為種子細胞的組織工程脂肪在脂肪移植中的應用奠定了實驗基礎。

本研究的局限性在于，由于經費和實驗條件的限制，并沒有探討hUC-MSCs來源的脂肪細胞提高移植后脂肪存活率的具體機制，以后本課題組將對這方面進行更深入的研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過石家莊市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準(文件號201912026)。所有動物處理和實驗過程均遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》的規(guī)定。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Shijiazhuang People’s Hospital (Approval Letter No.201912026). All experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The Regulations of The People’s Republic of China on The Administration of Experimental Animals.

作者貢獻：劉超、孫鵬飛參與了研究設計；劉超、魏計超、莫志洋、趙亞平、高慧、趙愛群、李燕、李素芬、孫鵬飛參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUChao, andSUNPengfei.The manuscript was drafted and revised byLIUChao,WEIJichao,MOZhiyang,ZHAOYaping,GAOHui,ZHAOAiqun,LIYan,LISufen, andSUNPengfei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.