辣椒枯萎病拮抗木霉菌的篩選及鑒定

章行遠，吳奇飛，卯婷婷*，金義蘭，張昌容，班菲雪，劉少蘭，喬 飛

(1.貴州省植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.安順學院，貴州 安順 561000)

0 引言

【研究意義】辣椒自15世紀隨哥倫布環球航行被傳出美洲后[1]，中國在明朝時期引入并作為觀賞植物種植。目前中國辣椒種植面積居全球前列，產量位居全球第一[2]。但隨著種植面積擴大，提升經濟效益的同時，辣椒病害的發生日益嚴重，枯萎病是辣椒常見病害之一，發病率一般為15%～30%[3]；長期連作破壞了農田生態系統穩定，導致該病發生率更高。目前對辣椒枯萎病的防控措施主要為化學防治，雖有高效、使用簡便、成本低廉等優點，但增加了農藥殘留、降低土壤微生物多樣性，并導致土壤硬化、病原菌耐藥性增強等問題。隨著消費者對有機食品需求的日益提高，以及生物技術的發展，挖掘可利用的生防資源防治辣椒枯萎病具有重要意義。【前人研究進展】辣椒枯萎病致病菌為尖孢鐮刀菌萎蔫專化型〔FusariumoxysporumSchl.f.sp.vasinfectum(Atk)Snyder & Hansen〕，17～37℃均可發生，最適生長溫度為24～28℃，潮濕環境有利于病原菌傳播蔓延；病原菌菌絲體和繁殖體厚垣孢子隨病殘體在土壤的表土層越冬，且可存活6～8年；通過風、水等流體傳播；病原菌從根部薄弱部位侵染辣椒，產生有毒物質破壞代謝功能并堵塞導管，導致側根腐爛，降低植株支撐能力，并使葉片喪失生理功能直至植株死亡；植株染病后平均2周死亡[4-5]。許多生防菌對辣椒枯萎病病原菌有抑制作用，劉云龍等[6]研究發現，施用哈茨木霉菌和某些解磷菌可以抑制辣椒疫病和枯萎病的發生并促使作物提前8 d開花，產量提高15%。THANGAVELU等[7-8]研究表明，枯草芽孢桿菌、木霉菌和熒光假單孢菌按照一定比例混配對辣椒枯萎病的病原菌有強抑制作用，并可提高植株體內POX酶、幾丁質酶活性和酚類物質含量，在施用6 d后達最大值，從而提高植株抗病性。王文斌等[9]研究發現，萬壽菊根部物質對辣椒枯萎病菌菌絲生長有顯著抑制作用，抑菌效果隨提取物濃度降低而減弱，50 mg/mL無菌水提取物48 h內抑菌率達100%；萬壽菊根部提取物可顯著提高辣椒幼苗的CAT、SOD和POD活性，增強植株抗病性。張俊慶等[3,10]成功分離到對辣椒枯萎病病原菌有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和哈茨木霉菌株。【研究切入點】國內外報道用于防治辣椒枯萎病的生防資源相對較少，在貴州鮮見利用生防菌防治辣椒枯萎病的報道。【擬解決的關鍵問題】采用平板稀釋法分離辣椒連作區域內植株根際土壤微生物，再采用平板對峙法篩選對辣椒枯萎病有拮抗效果的生防菌，最后利用菌落直徑測量法結合形態學和分子生物學方法鑒定拮抗菌發酵液抑菌活性及拮抗菌株種類，以期為綠色防控辣椒枯萎病提供有效的生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤 供試土壤為辣椒根際土壤，采自貴州省貴陽市花溪區(北緯26°30′40″，東經106°39′44″，海拔1 174 m，丘陵地形，旱地黃壤土，四季降雨，年均降雨量1 130 mL)辣椒連作區。

1.1.2 病原菌 供試病原菌為尖孢鐮刀菌辣椒枯萎病致病專化型，菌株由貴州省植物保護研究所生物防治研究室分離保藏。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18.5 g，純水1 000 mL；為了更高地分離土壤真菌，在PDA培養基中額外加入0.05 g鏈霉素和0.25 g氯霉素[11]。木霉選擇性培養基：五氯硝基苯0.3 g，葡萄糖3.0 g，MgSO40.2 g，KH2PO40.9 g，NH4NO31.0 g，KCl 0.15 g，玫瑰紅0.15 g，瓊脂18 g，氯霉素0.25 g，鏈霉素0.05 g以及1 000 mL蒸餾水[12]。PD液體培養基：蒸餾水1 000 mL，葡萄糖20 g，土豆200 g，自然pH[13]。

1.2 方法

1.2.1 辣椒根際土壤微生物分離純化 于辣椒苗期、花期、果實采摘前和果實采摘后4個階段，采用5點取樣法采集辣椒種植區域距土表10～15 cm的根際土壤并混勻，每個時期各采集土樣3份，記錄采集時間、辣椒生長狀態和采集量等。將無菌水和采集的土樣按照10∶1比例稀釋后，在搖床上以150 r/min的速度振蕩20 min制備土壤初懸浮液，采用梯度稀釋法，逐級制備濃度為1×10-1CFU/mL、1×10-2CFU/mL、1×10-3CFU/mL和1×10-4CFU/mL的土壤懸浮液[14-15]。在PDA培養基上均勻涂布100 μL土壤懸浮液，每個濃度3次重復。置于28℃恒溫培養箱，培養3 d后觀察記錄真菌菌落數量，并挑選生長單一完整的菌落，利用木霉選擇性培養基分離純化得到木霉菌，并保存。

1.2.2 平板對峙法初篩 以尖孢鐮刀菌病原菌為靶標病原菌，分離得到的木霉菌株為待測菌。在PDA培養基的兩側分別接種直徑5 mm的病原菌和待測菌菌餅，參照樊炳君等[16]的方法，28℃培養6 d后觀察菌落生長情況，有明顯抑制病原菌生長的待測菌標定為拮抗菌，并測量菌落直徑，計算抑菌率，獲得辣椒枯萎病拮抗菌株并保存。

1.2.3 拮抗菌發酵液抑菌活性試驗 將拮抗菌株的菌塊接種于PD液體培養基中，26℃ 150 r/min培養4 d，取10 mL培養液于7 500 r/min離心10 min。上清液過0.45 μm過濾器去除菌體，獲得含有拮抗菌次生代謝產物的發酵液，與PDA按1∶10混勻配制培養基。未添加菌株發酵液的培養基為空白對照，接種尖孢鐮刀菌菌塊，26℃培養7 d，測量尖孢鐮刀菌菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率=[(空白對照菌落直徑-處理組菌落直徑)/空白對照菌落直徑]×100%

1.2.4 拮抗菌株鑒定 形態學方法鑒定：選取有抑菌效果的菌株，在PDA上26℃培養7 d后，觀察記錄菌落形態及顏色，刮取菌絲及孢子，以蒸餾水作為懸浮劑制片，在顯微鏡下觀察菌絲、產孢結構和孢子形態，并測量孢子大小[17]。

分子系統學鑒定：拮抗菌接種于鋪滿無菌玻璃紙的PDA培養基上，待菌絲生長鋪滿整個培養皿后，收集菌絲體、在液氮中研磨至粉末狀，提取DNA；采用ITS1、ITS4和TEF1-728F、TEF1-rev引物分別擴增ITS和TEF基因，ITS引物的反應體系參照卯婷婷等[13]的方法，采用25 μL反應體系：DNA模板1 μL，上下游通用引物ITS1和ITS4各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，無菌水9.5 μL；TEF引物的反應體系同為25 μL反應體系：DNA模板1 μL，上下游通用引物TEF各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL，無菌水9.5 μL。PCR擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，34次循環；72℃延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。在GeneBank中下載拮抗菌株近緣種的ITS和TEF序列，采用ClustalW對齊后拼接，在MEGA 11中用Maximum Likelihood方法構建系統發育樹，采用bootstrap自舉檢驗1 000次。根據形態學和分子系統發育樹確定拮抗菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 辣椒根際土壤微生物分離

從表1看出，利用PDA培養基從采集的12份有效土樣中共分離純化得到真菌50株，其中，從苗期土樣中分離到LJ060209、LJ060210和LJ060201等共22株菌株，從開花期土樣中分離到LJ07160601、LJ07160843和LJ07160121等共16株菌株，從果實采摘前土樣中分離到LJ08072、LJ08074和LJ080726等共9株菌株，從果實采摘后土樣中分離到LJ09240301、LJ09240303和LJ09240304共3株菌株，分別占總分離菌株的44%、32%、18%和6%。

表1 辣椒根際土壤分離獲得的真菌菌株

2.2 分離菌株的抑菌效果

從表2看出，菌株LJ06020803、LJ060204、LJ060205、LJ060211和LJ09240304共5株菌株對辣椒枯萎病病原菌有顯著抑制作用，各處理病原菌菌落直徑為10.83～19.50 mm，表現為LJ06020803LJ060211>LJ060205>LJ09240304>LJ060204。其中，菌株LJ06020803的抑菌率最高，極顯著高于其余處理；菌株LJ060211其次，抑菌率為70.61%，極顯著高于其余處理；菌株LJ060204和菌株LJ09240304的抑菌率最低，二者無顯著差異，但均極顯著低于其余處理。從封二圖Ⅰ看出，空白對照處理辣椒枯萎病病原菌已幾乎鋪滿整個培養皿，而菌株LJ06020803處理辣椒枯萎病病原菌菌落生長明顯被抑制。

表2 拮抗菌株對辣椒枯萎病病原菌的抑菌效果

2.3 發酵液的抑菌活性

從封二圖Ⅱ看出，LJ06020803菌株無菌體發酵液對辣椒枯萎病病原菌有一定的抑制作用，在含LJ06020803菌株無菌體發酵液的PDA培養基上培養4 d后，辣椒枯萎病病原菌的菌落直徑為33.5 mm，空白對照的菌落直徑為56.7 mm，抑菌率為40.92%。

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態學 從封二圖Ⅲ看出，菌株LJ06020803在木霉選擇性培養基上生長7 d長滿培養皿，易產孢，淺綠色。在PDA培養基上培養72 h后，菌落直徑為90 mm，菌絲白色，產孢稀少；培養至7 d后，菌落正面黃綠色至草綠色，產孢區聚集狀；菌絲無色，分生孢子梗無色，簡單分枝, 初級分枝近似直角，瓶梗輪枝狀，大小為(4.5～7.5)μm×(2.0～3.0)μm；分生孢子卵圓形至橢圓形，大小為(2.0～3.0)μm×(2.5～3.5)μm，淺欖黃色至淺草綠色。與GAMS等[14]描述的哈茨木霉(T.harzianum)的形態一致。

2.4.2 分子生物學 通過PCR擴增，獲得菌株LJ06020803的ITS和TEF基因序列，長度約550 bp。從圖1看出，在由ITS序列和TEF序列共同構建的系統發育樹中，菌株LJ06020803的近緣種均以二分支樹的形式聚集在一起，菌株LJ06020803與哈茨木霉(T.harzianum)處于同一分支，自舉支持率(MPBS)100。與非洲哈茨木霉(T.afroharziaum)形成姊妹支，自舉支持率為(MPBS)80%。結合形態特征及分子系統學特征，確定菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(T.harzianum)。

圖1 基于菌株LJ06020803的ITS和TEF序列構建的系統發育樹

3 討論

篩選自然界中抑菌微生物作為農作物病害的綠色防控生防資源是近年來的研究熱點，也是今后綠色農業的發展方向。已有研究表明，多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)對于小麥赤霉病、黃瓜霜霉病、辣椒疫霉病、白菜莖腐病和番茄根結線蟲等均有較好的防治效果[18-22]；木霉菌(Trichodermaspp.)施用后，通過產生木聚糖、低聚糖、內肽化合物等小分子量化合物誘導植物產生防御反應[23-25]，同時具有一定促進作物增產的效果[26]，目前被廣泛用于防治西瓜枯萎病和煙草黑脛病等多種病害[27-28]。前人專門針對中國西南地區由連作導致的辣椒病害的生防研究相對較少，且大多采用單次采樣的方法收集土壤。研究選取年降雨量約1 000 mL的貴州丘陵地帶旱地辣椒連作區域的土壤，在辣椒不同生階段長期調查其根系土壤微生物，多次采集土樣，按照常規拮抗微生物分離和篩選方法，以區域常見病害辣椒枯萎病的病原菌作為靶標菌，應用PDA、木霉選擇性培養基、PD液體培養基，通過平板對峙法篩選出對辣椒枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌有較好抑制效果的菌株LJ06020803；形態學特征鑒定發現，菌株LJ06020803的培養形狀及形態學特征與GAMS等[14]描述的哈茨木霉(T.harzianum)一致；分子生物學鑒定其與哈茨木霉(T.harzianum)處于同一分支，自舉支持率為100%。結合形態學和分子生物學鑒定結果，確定菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。研究還發現，在對峙培養中菌株LJ06020803對尖孢鐮刀菌具有顯著的抑制作用，抑制率為78.04%，菌株LJ06020803的無菌體發酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌率為40.92%，具有拮抗作用。同時也說明，該菌株可產生有抑菌活性的次級代謝產物，但目前該代謝產物種類及抑菌機理尚不明確，后期將進一步深入研究，明確抑菌機理，并開發其大田應用技術。

4 結論

貴州辣椒連作地的根際土壤中有較多的木霉菌，試驗共獲得5株對尖孢鐮刀菌具有較好拮抗作用的木霉菌株(Trichodermaspp.)，其中，菌株LJ06020803的對峙培養抑制率最高，為78.04%，其不含菌體的發酵液抑菌率為40.92%。通過形態學和分子生物學方法鑒定，菌株LJ06020803為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。該菌株對尖孢鐮刀菌具有較好的抑制作用，可作為生防菌資源開發防治辣椒枯萎病的生防制劑。