藍莓品種布里吉塔的組培無菌體系建立

張孟琪，秦公偉, 2, 3, 4*，曹小勇, 2, 3，胡選萍, 2，黃大濤，席進成

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室(培育)，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；4.陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心，陜西 漢中 723000)

0 引言

【研究意義】藍莓學名越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物[1]，果實為小漿果，多為藍色，俗稱藍莓。藍莓果肉香甜，具獨特風味，富含多種氨基酸、礦物質和維生素，尤其含有大量的花青素和黃酮，具有保護視力、增強人體免疫力等保健作用[2-3]。在水果市場中，藍莓廣受消費者的歡迎，也受到生產者、農業科學家和政府的關注，藍莓產業發展前景廣闊。我國于2000年開始藍莓產業化生產[4]，截至2020年底，全國藍莓栽培面積6.64萬hm2，總產量34.72萬t，主要分布在貴州、遼寧、山東、四川、安徽、云南等省，經濟效益顯著[5]，對增加農民收入有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】組織培養技術是藍莓生產育苗的主要方式，現已開展了大量藍莓組培方面的研究[6-18]，但研究深度和系統性有望得到進一步完善，可以通過改進培養技術降低污染率、提升增殖倍數[11]，有助于提高苗木生產效益。陜西藍莓產業起步較晚，從2012年開始規?；N植[6]，主要栽培高叢藍莓和兔眼藍莓兩大類型系列品種[7]。布里吉塔為北高叢藍莓晚熟品種，果實大、風味佳，一直是澳大利亞和智利的主栽品種；在國內引種栽培后發現，該品種在不同的栽培地區，表現存在差異性。在北方產區多存在花芽分化不良、產量低等問題[8]，但在陜西栽種長勢好、果實大、豐產穩產，綜合表現良好?！狙芯壳腥朦c】布里吉塔作為區域性適生品種，目前未得到國內苗木生產企業的重視，其組培苗一直處于缺乏狀態?！緮M解決的關鍵問題】以陜西藍莓適生品種布里吉塔為試驗材料，研究外植體采集時間、不同外植體、玉米素核苷(ZT)濃度、細胞分裂素種類對組培苗無菌體系建立的影響，旨在為陜西藍莓適生品種苗木生產提供技術支持，同時為藍莓組培無菌體系建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

北高叢藍莓品種布里吉塔(Brigita Blue)春梢，2021年4月6日至5月24日采自勉縣陜西理工大學秦巴藍莓研究所校企合作共建藍莓試驗示范基地。

1.2 方法

1.2.1 取材 從2021年4月6日開始，隔15 d取材1次，共4個取材時期，分別為4月6日、4月18日、5月5日和5月24日。選擇栽種5年以上、生長健壯且無病害植株，采集當年春梢，裝入潔凈保鮮袋，帶回實驗室處理。

1.2.2 材料預處理 春梢去除下部木質化過高部分，留取上部幼嫩枝條，長度≤15 cm，剪去葉片(注意保留葉柄)，裝入干凈的廣口瓶；1 L帶刻度燒杯擠入洗潔精(約1 mL)，加入純凈水攪拌均勻。將洗潔精溶液倒入廣口瓶振蕩清洗材料，再用純凈水沖洗5次，每日早晚再用純凈水各沖洗1次，2 d后接種。

1.2.3 材料接種 超凈臺通風和紫外滅菌后，依次將材料用75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗4～5遍，放入墊有濾紙的無菌培養皿。接種時將消毒的枝條按照生長成熟度切分為莖上段、莖中上段、莖中下段和莖下段4個部分，但由于4月上旬的枝條較短且未完全成熟，只能切分為莖上段、莖中上段和莖中下段3個部分。將4部分莖段剪為長約2 cm的外植體，接種到培養基中，每瓶接種3個外植體，每個處理接種4瓶，重復3次。接種后，置于(25±2)℃培養室，光照強度2 500～3 000 lx，光照時間12 h/d。

當腋芽萌發的新梢生長緩慢時，剪為長約1.5 cm莖段，接種到繼代培養基中。接種數量、培養條件同初代培養。

1.2.4 培養基 初代培養選用1/2 MS + 1/2 WPM營養組分的培養基作為基礎培養基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L、調pH值5.8，ZT濃度設置1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L 3個水平。繼代培養基中分別添加1.5 mg/L ZT和1.5 mg/L tZR，其他成分同初代培養基。

1.3 數據統計

外植體接種后第2天開始觀察統計組培苗生長情況，隔日統計污染率1次；連續5 d未觀察到有新的腋芽萌發時統計萌芽率；約60 d組培苗進入直線生長末期后統計增殖倍數。

污染率=(污染外植體數/接種外植體數)×100%

總成活外植體數=接種外植體數-污染外植體數-褐化死亡外植體數

萌芽率=(萌芽的外植體個數/總成活外植體數)×100%

增殖倍數=可以繼代接種的莖段數/總成活外植體數

其中，可以繼代接種的莖段數為初代培養外植體腋芽萌發生長獲得的新梢，繼代培養超凈工作臺內無菌操作過程中，在培養皿中切分獲得長度≥1.5 cm的莖段總數。

1.4 數據分析

利用Excel 2016和GraphPad Prism 5軟件統計與分析試驗數據，采用Turkey檢驗法進行組間顯著性差異檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同ZT濃度處理外植體的萌發率及增殖倍數

5月5日第3批次采集的外植體，接種在不同ZT濃度(1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L)的初代培養基上，腋芽約7 d開始膨大。由表1可知，ZT對藍莓布里吉塔莖段的腋芽萌發誘導和生長有良好作用，當ZT濃度為1 mg/L時，萌芽率最高，為77.78%；其次為ZT 1.5 mg/L，為73.33%；ZT為1.25 mg/L時，萌芽率相對較低，僅61.67%。外植體的增殖倍數以ZT 1.25 mg/L最高，為3.75倍；其次為ZT 1 mg/L，為2.94倍；ZT 1.5 mg/L最低，僅2.40倍，但不同濃度間增殖倍數未達到顯著水平。3種ZT濃度的培養基均可作為藍莓品種布里吉塔的初代培養基(圖1)，其中以ZT濃度為1.25 mg/L時效果最佳。

表1 不同ZT濃度處理外植體的萌發率及增殖倍數

注：A，培養基中ZT濃度1.0 mg/L；B，1.25 mg/L；C，1.5 mg/L。

2.2 不同外植體處理初代培養的差異

從圖2可知，5月5日第3批次采集的外植體4 d后開始出現污染，第10天污染率達到峰值。其中，莖上段的污染率最高，為34.78%；莖中上段(8.33%)和莖中下段(4.76%)次之；莖下段污染率最低，僅4.35%，不同莖段的污染率有明顯區別。僅從污染率看，莖中上段、莖中下段和莖下段作為外植體建立無菌體系效果較佳。莖上段污染率高的原因可能是在去除葉片時產生較多切面，且殘留的葉柄不脫落，容易導致污染；莖下段污染率低的原因可能是葉柄部分在預處理和消毒的沖洗過程中部分自行脫落，污染率降低。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)。

莖下段萌芽率最高，為83.33%；莖中上段(81.25%)和莖上段(63.33%)其次；莖中下段最低，僅56.25%，但不同外植體之間萌芽率差異不顯著。不同莖段的增殖倍數與萌芽率呈現的規律不同，莖下段的增殖倍數最高，為4.81倍；莖中下段(3.35倍)和莖中上段(2.83倍)其次；莖上段最低，僅0.90倍，不同外植體之間的增殖倍數差異達到顯著水平。不同外植體在培養基中的生長狀況不同(圖3)，以莖上段作為外植體的組培苗，植株矮小，生長緩慢；以莖中上段、莖中段和莖中下段作為外植體的組培苗生長健壯。綜合污染率、萌芽率、增殖倍數和組培苗的生長狀況4個試驗評價指標認為，以莖中下段和莖下段作為外植體，建立無菌體系效果較好。

注：A，莖上段；B，莖中上段；C，莖中下段；D，莖下段。

2.3 不同采集時間外植體的污染率、萌發率及增殖倍數

由表2可知，4—5月采集外植體的污染率在13.06%～37.68%，萌芽率為68.18%～74.00%，增殖倍數為1.22～3.07倍。不同批次采集對外植體萌芽率的影響差異不顯著，而增殖倍數達到顯著水平。第2批次采集的外植體污染率較高，應是由于4月中下旬氣溫開始升高，材料帶回實驗室進行預處理沖洗后，未考慮溫度影響放置冰箱低溫貯藏，外植體殘留的菌體不斷繁殖、侵入傷口，導致接種后出現較多污染。綜合上述，外植體采樣時間對藍莓初代培養的增殖倍數有重要影響。在無菌體系建立中，4—5月均可進行外植體采集，最佳采集時間為5月份。

表2 不同采集時間處理外植體的污染率、萌發率及增殖倍數

2.4 不同細胞分裂素處理組培苗的繼代增殖狀況

將初代培養獲得的新梢切分后轉接到繼代培養基中，約7 d發現腋芽開始膨大，葉片展開。從表3可知，在組培苗的繼代培養過程中，2種細胞分裂素之間萌芽率和增殖倍數的差異未達顯著水平。從圖4看出，組培苗在添加tZR的培養基上生長更旺盛，葉色濃綠。從組培苗的生長狀況看，tZR更有利于藍莓組培苗的增殖培養。

表3 不同細胞分裂素處理組培苗的繼代增殖狀況

注：A，培養基中添加ZT；B添加tZR。

3 討論

藍莓組織培養中，外植體的選擇在一定程度上影響快繁體系的建立。研究發現，布里吉塔春梢上部幼嫩枝條切分獲得的莖中下段和莖下段作為外植體的效果更佳，春梢上部幼嫩枝條最成熟的部分，組培增殖效果最佳，與王大平[13]對兔眼藍莓的研究結果一致。

采樣時間也是成功建立無菌體系的重要因素。通過試驗得出，4—5月均可進行藍莓外植體采集，5月最佳，與周閏等[14-16]的研究結果一致。原因應是5月采集的春梢木質化程度更高，同時枝條貯藏的營養更多，從而表現出作為外植體時增殖倍數顯著高于4月。

培養基是外植體誘導生長的重要營養來源，在組織培養過程中起著不可替代的作用。培養基中添加3種ZT濃度(1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L)均可在初代培養中誘導腋芽萌發，與李森等[12]的研究結果相同。從節約生產成本角度出發，建議使用低濃度ZT(1.0 mg/L)進行初代培養。

在植物組培無菌體系建立過程中，添加細胞分裂素可促進莖段腋芽萌發。在藍莓組培苗的第1次繼代時，培養基內添加tZR更有利于增殖培養，與尹利方等[17]的研究結果一致，與張力思等[18]認為添加ZT對藍莓莖段增殖效果最佳的結論不同，可能是由于藍莓不同品種在增殖階段對細胞分裂素的需求不同。

試驗建立了藍莓品種布里吉塔的無菌培養體系，下一步將對該品種的繼代培養、生根和馴化進行系統研究，為藍莓其他品種組培的系統研究提供思路及數據支持。

4 結論

通過組培快繁技術建立藍莓品種布里吉塔的組培無菌體系時，應在5月進行外植體采集，并使用幼嫩春梢的中下部分作為外植體，最佳初代培養基為1/2 MS+1/2 WPM+ZT 1.0 mg/L，初代培養誘導新梢在繼代培養基為1/2 MS + 1/2 WPM+1.5 mg/L tZR中成功繼代，且生長狀態良好。