基于NF-κB/bFGF信號通路探討厚樸水煎液聯合奧沙利鉑抑制胃癌的作用

范智彥 聶愛蕊 侯劍梅 趙立濤

(臨沂市第三人民醫院 1藥劑科，山東 臨沂 276023；2臨床藥學室；3臨沂市蘭陵縣中醫醫院藥劑科；4山東大學藥學院)

胃癌是一種發病率很高的消化系統腫瘤，中國胃癌的發病率居全球的第五位，并且死亡率呈現逐年上升趨勢〔1〕。現階段治療胃癌的主要手段有放療、化療、手術和靶向治療。放化療過程中會出現不同程度的不良反應，常常影響患者的治療結果〔2,3〕。因此尋找低毒有效的輔助抗腫瘤藥物尤為重要。厚樸為木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮〔4〕。具有燥濕祛痰、下氣止瀉之功效〔5〕。現代藥理學研究表明，厚樸中的厚樸酚能抑制腫瘤血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增長、黏附和遷移〔6〕。奧沙利鉑是一種常用的化療藥物，可以與DNA形成共價結合，抑制DNA復制與合成，從而發揮抗腫瘤作用〔7〕。研究表明奧沙利鉑對胃癌〔8〕、肝癌〔9〕、卵巢癌〔10〕有作用。然而，目前有關厚樸在胃癌方面的研究較少，并且厚樸與奧沙利鉑聯合對胃癌的藥理作用也鮮有報道。本文探討厚樸水煎液聯合奧沙利鉑對胃癌的作用，通過構建大鼠胃癌模型，觀察厚樸提取液聯合奧沙利鉑對胃癌大鼠的瘤體重量、胃癌組織中細胞凋亡及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和核轉錄因子(NF)-κB的表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1動物和細胞 Wistar雄性大鼠50只，SPF級飼養，體重(220±20)g，由山東大學動物實驗中心提供。人BGC823胃癌細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2試劑和主要儀器 奧沙利鉑(浙江海正藥業股份有限公司)，厚樸(河北安國昌達中藥飲片有限公司)，白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，RPMI1640培養基、胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，末端DNA轉移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，bFGF和NF-κB抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)，高速離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司)，倒置熒光顯微鏡(上海光學儀器廠)，酶標儀(上海閃譜生物科技公司)，超薄切片機(德國萊卡公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3細胞培養和厚樸水煎液的制備 人胃癌BGC823細胞進行常規傳代培養，將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞培養到對數生長期，調整到細胞密度5×105/ml備用。稱取厚樸500 g進行粉碎，加10倍量、8倍量、6倍量的水分別煎煮1 h，紗布濾過，合并濾液，濃縮至生藥量為1 g/ml的厚樸水煎液，4 ℃冷藏備用。

1.4動物模型的建立及給藥 將大鼠腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg，以60Co-γ射線全身照射20 min，24 h后于近腹股溝處接種胃癌細胞懸液1.0 ml，復制大鼠胃癌模型。Wistar大鼠50只隨機分為空白組、模型組、厚樸水煎液組、奧沙利鉑組、厚樸水煎液聯合奧沙利鉑組(聯合組)各10只。空白組不做任何處理，其余各組都進行造模。造模30 d后，厚樸水煎液組灌胃厚樸水煎液(1 g/kg)，1次/d；奧沙利鉑組腹腔注射奧沙利鉑溶液(20 mg/kg)，2次/w。聯合組同時給予厚樸水煎液(1 g/kg)和奧沙利鉑(20 mg/kg)。空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續給藥8 w。

1.5大鼠腫瘤重量測定及腫瘤病理學變化 大鼠末次給藥后，取出大鼠瘤體組織，電子天平稱取瘤體重量，測定抑瘤率。抑瘤率=(對照組平均質量-實驗組平均質量)/對照組平均質量×100%。將瘤體組織用4%多聚甲醛進行固定，包埋成石蠟切片。將切片依次放入二甲苯、HE染色，最后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學變化。

1.6TUNEL檢測腫瘤細胞凋亡情況 將瘤體組織常規脫水后，用4%多聚甲醛進行固定，再用0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為滲透液。使用TUNEL混合溶液與載玻片混合后，再與過氧孵育化物酶(POD)孵育60 min，然后用二氨基聯苯胺(DAB)溶液染色，最后用蘇木素進行染色，上鏡觀察，陽性細胞顯示棕黃色。

1.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平 大鼠腹主動脈取血后，3 500 r/min離心10 min，收集血清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作。測定血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平。

1.8免疫組化檢測bFGF和NF-κB蛋白表達 將腫瘤組織用10%多聚甲醛固定后，加入bFGF和NF-κB抗體進行孵育，最后用DAB和蘇木素進行復染，上鏡觀察，隨機選擇10個視野，陽性染色為棕黃色，統計陽性細胞數及細胞總數，計算凋亡指數(AI)，AI =(陽性細胞數/細胞總數)×100 %。

1.9Western印跡檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB蛋白表達 提取經厚樸水煎液和奧沙利鉑處理的腫瘤組織的總蛋白，用BCA試劑盒測定總的蛋白濃度。然后經過轉膜、封閉進行檢測，用β-actin進行蛋白定量分析。

1.10RT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB mRNA表達 收集經厚樸水煎液和奧沙利鉑處理的腫瘤組織，按照反轉錄試劑盒檢測腫瘤組織中bFGF和NF-κB mRNA表達，采用2-△△Ct法檢測相應mRNA表達量。

1.11統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組瘤體重量及抑瘤率 與模型組〔(2.15±0.47)g〕相比，厚樸水煎液組〔(1.68±0.53)g〕、奧沙利鉑組〔(1.41±0.93)g〕和聯合組的腫瘤組織重量〔(0.87±0.26)g〕明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且聯合組明顯低于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05)；聯合組抑瘤率(59.53%)明顯高于樸水煎液組(21.80%)和奧沙利鉑組(34.42%；P<0.05)。

2.2HE染色觀察各組腫瘤組織病理變化 模型組腫瘤細胞排列緊密，生長旺盛，細胞間質完整清晰，細胞核體積增加，核仁明顯；厚樸水煎液組腫瘤細胞胞質內出現空泡樣，細胞核固縮，染色質異常；奧沙利鉑組腫瘤細胞核間隙增寬，壁細胞異形改變；聯合組腫瘤細胞體積大小不一，核碎裂形成，染色質出現明顯異常，壁細胞大量破裂，腫瘤細胞凋亡較多。見圖1。

2.3TUNEL染色觀察各組腫瘤細胞凋亡情況 模型組腫瘤細胞生長旺盛，基本未發現凋亡細胞；厚樸水煎液組和奧沙利鉑組有部分凋亡細胞；兩藥聯合處理后，腫瘤細胞凋亡明顯增多，凋亡細胞數量明顯高于模型組、厚樸水煎液組和奧沙利鉑組。見圖2。與模型組〔(6.73±2.41)%〕相比，厚樸水煎液組、奧沙利鉑組和聯合組的胃癌組織AI〔(14.61±3.29)%、(15.43±4.87)%、(21.43±1.82)%〕明顯升高(P<0.01)。聯合組AI明顯高于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05)。

圖1 各組胃癌組織病理學變化(HE染色，×400)

腫瘤細胞核染成藍色，黑色箭頭代表凋亡細胞(棕色)圖2 各組胃癌細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.4ELISA檢測血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平 與空白組相比，模型組IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，厚樸水煎液組、奧沙利鉑組和聯合組血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。聯合組明顯低于厚樸水煎液組和奧沙利鉑組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組血清中炎癥因子水平比較

2.5免疫組化檢測胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白表達 陽性細胞為棕色顆粒。與空白組相比，模型組bFGF和NF-κB蛋白表達顯著上升，陽性細胞明顯增多；與模型組相比，厚樸水煎液組和奧沙利鉑組bFGF和NF-κB蛋白表達水平降低，陽性細胞數目明顯減少；與厚樸水煎液組和奧沙利鉑組相比，聯合組bFGF和NF-κB蛋白表達水平進一步降低。見圖3。

黑色箭頭代表陽性細胞圖3 各組胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白表達(DAB染色，×200)

2.6Western印跡及RT-PCR檢測胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達 與空白組相比，模型組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，厚樸水煎液組和奧沙利鉑組和聯合組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)；與厚樸水煎液組和奧沙利鉑組相比，聯合組bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達水平進一步顯著降低(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組胃癌組織中bFGF和NF-κB蛋白及mRNA表達

1～5：空白組，模型組，厚樸水煎液組，奧沙利鉑組，聯合組圖4 Western印跡檢測各組胃癌組織中bFGF和 NF-κB蛋白表達

3 討 論

厚樸是一種常用的中藥〔11〕。研究表明，厚樸中的厚樸酚不僅能促進腫瘤細胞阻滯在G1期和G2/M期〔12，13〕。奧沙利鉑是一種第3代化療藥物，臨床上對晚期胃癌有治療作用，可以誘導腫瘤細胞凋亡，影響腫瘤細胞增殖，其作用機制是奧沙利鉑與DNA鏈進行交聯，阻止DNA的復制和合成〔14〕。現代藥理研究結果表明奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶(FU)協同用藥有明顯的抗胃癌作用〔15〕。

炎癥因子與腫瘤的發生和發展密切相關〔16〕。炎癥因子的感染與局部病變的組織有緊密聯系。炎癥因子可促進腫瘤細胞增殖和遷移，抑制炎癥因子過度表達可延緩腫瘤生長〔17〕。研究結果表明，促炎因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β在癌癥的生存和增殖過程中發揮重要作用〔18〕。本研究結果表明，厚樸提取液和奧沙利鉑均能抑制IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β促炎因子的分泌，發揮機體的抗腫瘤作用，并且二藥聯合效果更佳。

NF-κB主要以二聚體存在于細胞中，可以調節細胞增殖、分化和轉移〔19〕。NF-κB在胃癌細胞中發揮抗凋亡作用，抑制NF-κB過度激活可以促進胃癌細胞凋亡，破壞胃癌細胞的生長周期〔20〕。bFGF是一種具有廣泛生物活性的血管生長因子。bFGF作為NF-κB下游靶標蛋白，主要參與調節細胞的生長、增殖和分化〔21〕。研究表明bFGF在胃癌組織中高度表達，抑制bFGF蛋白表達可以誘導胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞生長〔22〕。本研究結果表明，厚樸提取液和奧沙利鉑均能顯著抑制大鼠胃癌組織中NF-κB和bFGF蛋白的表達，從而發揮抗胃癌作用，尤其是以二藥聯合治療組效果最顯著。

綜上，厚樸提取液和奧沙利鉑能顯著誘導胃癌細胞凋亡，其抗胃癌作用機制與調控NF-κB/bFGF通路，降低NF-κB和bFGF蛋白的表達有關。厚樸提取液和奧沙利鉑具有明顯的協同效應，可進一步提高抗腫瘤效果，達到了臨床治療胃癌的目的。