有氧運動聯合白藜蘆醇通過Nrf2/ARE信號通路抗血管性癡呆大鼠海馬氧化損傷

黎軼 王景振 劉瑞蓮 (宜春學院體育學院，江西 宜春 336000)

血管性癡呆(VD)是由一系列腦血管病變導致的腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的綜合性癡呆疾病〔1〕，由于腦血管因素如缺血性腦卒中、出血性腦卒中導致的腦組織損傷，進而損害相應部位的神經元，影響腦組織中的病理及生理變化，造成記憶力、認知能力和行為習慣等方面出現嚴重的認知功能障礙〔2,3〕。VD的發病機制比較復雜，至今尚未完全闡明，從國內外的研究報道來看，尚缺乏對控制本疾病進程的理想防治方法。而現有的VD治療主要集中于腦卒中的預防、認知功能的改善及行為控制和精神癥狀、血管擴張和腦血流量改善、脂質過氧化反應減輕及對腦血管和神經的保護等〔4〕；藥物的使用也主要傾向于神經遞質調節劑、腦循環改善藥物、自由基清除劑等。從對VD的發病機制方面的研究來看，其發病可能與以下因素有關：中樞膽堿能系統功能障礙、中樞RNA和蛋白質合成減少、局部炎癥反應、氧自由基損傷及機體免疫異常等〔5,6〕。白藜蘆醇最早發現于法國的紅葡萄酒，相關研究表明，紅葡萄酒所具有的保護血管、預防冠心病的主要作用來源于白藜蘆醇，近年來的研究也顯示，白藜蘆醇具有顯著的抗炎〔7〕、抗氧化和抗血小板凝集等作用〔8,9〕。本研究旨在探討有氧運動聯合白藜蘆醇通過核因子E2相關因子/抗氧化反應元件(Nrf2/ARE)信號通路抗VD大鼠海馬氧化損傷。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 健康雄性12～14月齡SD大鼠，體重280～350 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。所有實驗動物標準齒啃類飼料適應性飼養1 w，自由飲食，無異常，用Morris水迷宮篩選出較靈活的大鼠84只，隨機分為空白對照(C)組、空白對照運動(CE)組、VD模型(VD)組、VD模型運動(VE)組、白藜蘆醇對照(R)組、白藜蘆醇干預(RV)組、運動干預組和白藜蘆醇聯合運動干預(RE)組，每組12只，其中除對照組外的其他組大鼠進行VD造模。

1.2研究方法

1.2.1VD模型的構建 大鼠術前禁食12 h，禁水4 h。參照相關文獻，用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，消毒剃毛后，頸正中切口，縱向切開皮膚及皮下組織，玻璃分針避開迷走神經分離雙側頸總動脈，以4號手術線，拉緊絲線扣，阻斷血流30 min，觀察到大鼠心跳加快，呼吸深慢即松開絲線扣恢復血流10 min后，再次阻斷血流30 min，反復3次后，雙重絲線結扎，術中注意確保大鼠體溫，術后送至通風和空調設備的SPF動物房飼養。對照組大鼠除不結扎頸總動脈外，麻醉及手術過程均與模型組相同。術后7 d進行Morris水迷宮檢測，依據超出對照組大鼠游至平臺平均時間的95%上限值的標準的模型組大鼠選定為VD大鼠。白藜蘆醇治療組于術后第4周開始給予白藜蘆醇治療〔25 mg/(kg·d)，白藜蘆醇溶解于2 ml 0.5 g/L羧甲基纖維素鈉〕灌胃，連續進行4 w。

1.2.2有氧運動干預模式 運動組大鼠借鑒Bedford等〔10〕運動方案和最大攝氧量(VO2max)百分數強度標準進行改良，坡度為10°、速度為16 m/min(約為65%VO2max強度)的動物跑臺持續訓練8 w，1次/d，60 min/次，6 d/w。

1.2.3神經行為學評定 采用中國醫學科學院研制的Morris水迷宮測定系統記錄大鼠定點巡航和空間探索能力，攝像頭自動記錄大鼠運動軌跡、計算機輔助系統分析其游泳距離、平臺潛伏期，并計算不同象限中的游泳時間比例、距離比例等。

1.2.4海馬組織取材 最后一次運動訓練結束后，所有實驗大鼠禁食過夜，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，每組隨機篩選6只進行腦在體固定，即嚴格按照開胸，自心尖處將灌注針插入主動脈后，先用4℃生理鹽水快速沖洗，再用4℃的預冷的4%多聚甲醛灌注，待大鼠前肢及頸背部僵硬，肝組織等臟器變白而硬后，灌注結束；冰上固定后自枕骨大孔處橫斷，斜向插入剪刀剪開頂骨，止血鉗掰斷兩邊頂骨，剝離整個頂層顱骨，暴露整個腦組織，眼科剪分離顱底組織，將整塊腦組織翹起，置于4%多聚甲醛4℃保存48 h及以上。每組其余6只大鼠麻醉后，俯臥位固定，用上述方法剝離顱骨，暴露腦組織，眼科鑷翻開大腦皮層，玻璃分針剝離海馬周邊組織，取下海馬組織，濾紙吸干組織液稱重后，正中分開，左側海馬組織用于檢測蛋白成分，右側海馬組織保存于Trizol溶液中，-80℃凍存，用于核酸提取。

1.2.5大鼠海馬組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活性檢測 冰上稱重后的海馬組織加入預冷的生理鹽水，玻璃勻漿器冰水浴中勻漿海馬組織，定量Biorad蛋白。嚴格按照MDA、SOD和GSH試劑盒說明書，硫代巴比妥酸法測定MDA、氮藍四唑(NBT)法檢測SOD活性、考馬斯亮藍法測定GSH蛋白含量。

1.2.6大鼠海馬組織免疫組化檢測 固定完成的大鼠腦組織，脫水，冠狀面超前包埋、切片；常規脫蠟、復水，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，蒸餾水浸泡，PBS沖洗3次，滴加抗原修復液，PBS洗滌3次，滴加過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育30 min，滴加Nrf2多克隆抗體(1∶50，美國Santa Cruz)，4℃過夜；次日PBS洗滌，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液，室溫孵育30 min；二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，二甲苯透明，滴加中性樹膠封片。每只大鼠相同視野下隨機取5張切片(×400)，應用Image Pro Plus-6圖像分析軟件分析每組切片積分吸光度IA值。

1.2.7海馬組織總RNA提取 采用Total RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA。于超低溫冰箱取出存有海馬組織的Trizol試管，置于玻璃勻漿機中，冰中充分研磨，室溫裂解3 min，加入0.2體積的三氯甲烷，充分振蕩，12 000 r/min，15 min離心，取上清加入同體積的異丙醇，-20℃靜置20 min。12 000 r/min，15 min離心，棄上清，在沉淀中加入1 ml RNase-Free配制的75%乙醇，振蕩器振蕩。12 000 r/min，15 min離心，棄上清，無菌空氣中干燥10 min。加入50 μl RAase-Free水溶解沉淀。完全溶解后，紫外分光光度計檢測OD260 nm與OD280 nm值，判定其濃度和純度。

1.2.8RT-PCR檢測海馬組織Nrf2、SOD表達水平 提取的海馬組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物由上海生物工程有限公司合成。引物合成序列：Nrf2：上游引物：5′-TTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA-3′、下游引物：5′-ATCAGTCATGGCCGTCTCCAG-3′，215 bp；SOD-1：上游引物：5′-AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGA-3′、下游引物：5′-GCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTA-3′，375 bp；HO-1：上游引物：5′-AGGTGCACATCCGTGCAGAG-3′、下游引物：5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′，339 bp；GAPDH：上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′、下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，452 bp。RT-PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，共40個循環，每個循環延伸末收集熒光信號，繪制擴增曲線，并對Nrf2、血紅素氧合酶(HO)-1、SOD等目的基因相對定量進行分析，2-ΔΔCt計算其相對表達量〔11〕。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1有氧運動聯合白藜蘆醇干預VD大鼠空間學習記憶能力測試結果 與C組相比，VD組、VE組、RV組和RE組第1周訓練的平均平臺潛伏期時間和上臺前游泳距離顯著升高(P<0.05)，但四組間無顯著差異(P>0.05)，第5周VE、RV與RE組的平均平臺潛伏期時間和上臺前游泳距離均顯著低于VD組(P<0.01，P<0.05)；第8周的測試結果顯示，與VD組比較，VE、RV與RE組平均平臺潛伏期時間和上臺前游泳距離均顯著降低(P<0.01)，且以RE組改善趨勢最大，見表1。

空間探索實驗結果也顯示，與VD組相比，VE與RV組大鼠在平臺撤去后所在象限中的潛伏期比例和游泳距離比例明顯增加(P<0.05)；RE組大鼠呈非常顯著性增加(P<0.01)，見表1。

2.2免疫組化檢測結果與分析 免疫組化染色顯示，C組大鼠海馬神經細胞中Nrf2核表達較少，而VD組大鼠海馬神經細胞可見大量Nrf2核著色的陽性細胞；與C組(6.63±1.32)相比，VD組IA顯著增加(23.77±6.61，P<0.01)，與VD組相比，RV組(17.96±6.33)、VE組(13.29±4.74)、RE組海馬神經細胞NRf2核著色的IA表達(8.45±3.50)顯著減少(P<0.05,P<0.01)，且明顯接近于R組(7.90±2.55)和CE組(5.47±2.09)。見圖1。

表1 白藜蘆醇聯合有氧運動干預VD大鼠定位巡航、空間探索的效果比較

圖1 各組大鼠海馬神經細胞Nrf2表達水平(免疫組化染色，×400)

2.3MDA、SOD和GSH活性比較 VD組大鼠海馬組織內MDA活性較C組明顯升高，但SOD與GSH活性明顯低于對照組(均P<0.01)；與VD組比較，RV與VE、RE組MDA活性明顯降低，SOD與GSH活性顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 白藜蘆醇聯合有氧運動干預VD大鼠海馬組織 MDA、SOD與GSH活性的效果

2.4白藜蘆醇聯合有氧運動干預VD大鼠海馬組織Nrf2、HO及SOD檢測結果與分析 RT-PCR檢測結果顯示，VD組大鼠海馬組織內Nrf2 mRNA的表達較C組顯著上調(P<0.05)；CE組Nrf2、HO-1、SOD mRNA較C組顯著上調(P<0.01)；與VD組相比，VE、RV、RE組大鼠海馬組織的Nrf2、HO-1、SOD mRNA均呈顯著上調(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 白藜蘆醇聯合有氧運動干預VD大鼠 海馬組織基因表達檢測結果

3 討 論

本研究結果提示有氧運動聯合白藜蘆醇能夠有效改善VD大鼠空間學習記憶能力和空間探索能力。

氧化應激損傷與VD發病具有高度的相關性，這可能與因氧化應激導致體內OFR沉積，進而誘導海馬組織損傷，誘發VD，尤其是表現在氧化還原產物MDA、GSH與SOD在機體內所反映的氧化還原狀態呈密切相關〔12〕。作為體內氧自由基水平的標志產物，MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產物，含量高低直接反應機體氧化損傷程度〔13〕。SOD可通過水化而歧化O2-，在清除機體氧自由基的過程中發揮了重要作用，切斷自由基連鎖效應，保護細胞免受氧化損傷，其活性與機體清除自由基的能力相關〔14〕。GSH廣泛存在于機體內，其可通過特異性催化穩定細胞膜結構，確保細胞的正常生理功能〔15〕。本研究結果說明，有氧運動雖然可以提高VD大鼠海馬組織抗氧化能力，但效果不如白藜蘆醇。

作為氧化應激感受器的Nrf2〔16〕，是堿性亮氨酸拉鏈家族中調節抗氧化應激反應活性最強的轉錄因子〔17,18〕。Nrf2/ARE是近年來最重要的內源性抗氧化應激信號通路，該通路可調節細胞的抗氧化應激能力，保護細胞組織氧化應激損傷〔19〕。ARE負責調控多種抗氧化酶基因的額表達，以抵抗各種內外源性氧化刺激誘導的氧化應激性損傷，促進氧自由基的平衡恢復〔20,21〕。本研究結果提示，白藜蘆醇和有氧運動均可降低Nrf2免疫組化切片積分吸光度IA值，且聯合干預組的影響最大。有氧運動可通過減少機體氧自由基的產生，增加其代謝，提高機體抗氧化能力，延緩大腦衰老，對VD有積極的防治作用〔22,23〕，但針對有氧運動防治VD的氧化應激性損傷是否通過Nrf2/ARE信號通路發揮關鍵調控作用，鮮有報道。本研究進一步證實，白藜蘆醇聯合有氧運動可增加Nrf2及其下游抗氧化酶的表達，降低海馬組織MDA水平，增加SOD、GSH含量，減輕氧化應激損傷，逆轉由VD誘導的氧化應激性海馬神經細胞損傷。