壬二酸對阿霉素誘導的心肌細胞損傷的保護作用及其機制

高遠真 原陽 葉婷, 李夢嬌, 張鈺坤, 邢東明,3

(1 青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071； 2 青島大學附屬醫院腫瘤研究所，青島腫瘤研究院； 3 清華大學生命科學學院)

目前，包括阿霉素(DOX)在內的蒽環類化療藥物是乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤等腫瘤的最為有效的化療藥物[1]，由于其不良反應如不可逆的急性或慢性心臟毒性發生率較高[2-3]，限制了其臨床應用[4]，因此，尋找一種安全有效的藥物以治療DOX心臟毒性具有重要臨床意義。壬二酸(AzA)廣泛存在于小麥、黑麥以及高粱等谷物中[5]，具有抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等藥理作用[6-8]，被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于皮膚疾病治療，具有較好的安全性和有效性[9]。研究顯示，AzA可保護高脂飲食誘導的C57BL/6J小鼠心臟功能損傷[10]。然而，目前尚未有AzA對DOX所致心肌損傷是否有保護作用的相關研究報道。基于此，本研究通過建立體內外DOX損傷模型，探討AzA對DOX誘導的心肌細胞損傷的保護作用及其機制，為AzA治療DOX所致心臟毒性提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

H9c2大鼠心肌細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級8周齡雌性C57BL/6J小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。AzA購買于西安恩肽元生物科技有限公司；DOX購買于湖北威得利化學科技有限公司；CCK-8試劑盒、DCEF-DA探針購買于大連美侖生物技術有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、線粒體膜電位(ΔΨm)檢測試劑盒購買于北京索萊寶公司；三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒購買于上海碧云天生物技術有限公司；B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(Bad)、泛素結合蛋白(P62)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3)抗體購買于武漢ABclonal公司。Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)抗體購買于美國Santa Cruz公司。

1.2 研究方法

1.2.1H9c2心肌細胞的復蘇及培養 將凍存的H9c2心肌細胞于37 ℃水浴中解凍并迅速復蘇后，與4 mL完全培養基(含體積分數為0.10的胎牛血清、體積分數為0.01青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基)混合，1 000 r/min 離心5 min后，取5 mL細胞懸液移入細胞培養瓶，置于37 ℃，含體積分數為0.05 CO2培養箱中培養。待細胞融合度約達到80%時進行后續實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 取細胞融合度達到80%的H9c2細胞胰酶消化后接種于96孔板中，每孔2 000個細胞，待細胞融合度再次達到80%后，分別加入濃度為0、1、2、5、10、20 μmol/L的DOX，每種濃度設置6個復孔，處理24 h后，每孔中加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養3 h，采用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度，并計算細胞存活率，確定DOX的后續實驗濃度。取細胞融合度達到80%的H9c2細胞胰酶消化后接種于96孔板中，每孔2 000個細胞，待細胞融合度再次達到80%后，分別加入10、20、30、40 μmol/L AzA與5 μmol/L DOX的混合溶液，每組設置6個復孔，處理24 h后，每孔中加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養3 h。采用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度，并計算細胞存活率，確定AzA的后續實驗濃度。

1.2.3H9c2心肌細胞的分組與處理 取細胞融合度達到80%的細胞胰酶消化后接種于6孔板或共聚焦皿中，待細胞融合度再次達到80%時分為正常組、模型組和AzA組，正常組以高糖DMEM培養基培養24 h，模型組以5 μmol/L DOX處理24 h，AzA 組以10 μmol/L AzA和5 μmol/L DOX共處理24 h。

1.2.4H9c2心肌細胞各項指標的檢測 取處理24 h后的3組細胞上清液，按照LDH檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度值，根據公式計算各組H9c2心肌細胞LDH漏出量。按照ATP試劑盒說明書操作，檢測各組細胞內ATP含量。取處理24 h后的3組細胞，加入含10 μmol/L DCFH-DA探針的無血清高糖培養基，37 ℃下暗室培養30 min，熒光顯微鏡下觀察各組熒光強度，采用Image J軟件處理DCFH-DA綠色熒光強度，分析3組細胞活性氧(ROS)的水平。按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書裝載JC-1熒光探針，激光共聚焦顯微鏡下拍照并觀察紅、綠熒光，使用Image J軟件分析和處理熒光圖像。取處理24 h后的3組細胞，按照文獻[11]中的操作步驟，對細胞進行包埋、切片、染色，透射電子顯微鏡下觀察分析3組細胞中的自噬體存在情況。從細胞培養箱中取出共聚焦皿，按照文獻[12]中的操作步驟，依次對細胞進行固定、透膜、封閉、一抗二抗孵育、染色，防淬滅封片劑封片，4 ℃下避光保存，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，采用Image J軟件處理圖片，分析3組細胞中BNIP3與Mitotrac-ker共定位情況。上述實驗均重復3次，結果取3次實驗的均值。

1.2.5Western blot實驗檢測H9c2心肌細胞中微管相關蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62、Bad、BNIP3蛋白表達水平 取處理24 h后的3組細胞，收集并裂解細胞，通過BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，置于150 g/L的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳以分離蛋白，之后將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，以含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1～2 h，分別加入LC3B、P62、Bad、BNIP3一抗(前兩組蛋白濃度為1∶1 000，后兩組蛋白濃度為1∶400)，4 ℃水平搖床孵育過夜。次日以TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min。二抗(1∶10 000)用含50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次10 min。以凝膠成像儀顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次，結果取均值。

1.3 小鼠的處理和相關指標檢測

1.3.1小鼠的分組和處理C57BL/6J小鼠隨機分為正常組、模型組和AzA組，每組8只小鼠。模型組和AzA組小鼠僅在第1天腹腔注射10 mg/kg的DOX，AzA組同時灌胃20 mg/kg的AzA，每日1次，連續7 d；正常組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續7 d。

1.3.2小鼠心臟功能檢測和心臟組織Masson染色各組小鼠于實驗完成后第2天，使用含體積分數0.015異氟烷進行麻醉，采用飛依諾科研專用彩超儀V6測試小鼠心臟射血分數(EF%)和左室短軸縮短率(FS%)。心超檢查結束后，各組小鼠再分別注射10 g/L戊巴比妥鈉10 μL/g麻醉小鼠，提取心臟組織，以40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟切片脫蠟，按照Masson染色試劑說明進行操作，Regaud蘇木精染液、Masson麗春紅酸性復紅液依次染色，浸洗、脫水、封固后，置于奧林巴斯熒光倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 AzA和DOX實驗濃度的確定

H9c2心肌細胞經過0、1、2、5、10、20 μmol/L的DOX溶液處理24 h以后，細胞的存活率分別為(100.00±9.09)%、(56.19±7.29)%、(47.45±6.32)%、(30.81±12.21)%、(18.92±11.40)%、(10.35±2.61)%。隨著DOX濃度的增加，細胞活力顯著下降，差異具有統計學意義(F=81.568，P<0.05)。根據本實驗結果，同時參考相關文獻[13]，確定本研究DOX的濃度為5 μmol/L。H9c2心肌細胞經過10、20、30、40 μmol/L的AzA與5 μmol/L DOX混合溶液處理24 h后，細胞存活率分別為(89.34±14.47)%、(53.47±4.96)%、(40.82±5.40)%、(32.45±7.87)%，各組間比較差異有統計學意義(F=60.985，P<0.05)，其中經過10 μmol/L AzA和5 μmol/L DOX混合溶液處理的細胞存活率最高，依據該結果確定的后續實驗的AzA濃度為10 μmol/L。

2.2 AzA對DOX誘導的H9c2細胞中各項指標的影響

單因素方差分析顯示，各組H9c2細胞中ROS水平、LDH漏出量、ATP水平、ΔΨm、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及Bad、BNIP3、P62蛋白表達水平比較，差異均有顯著性(F=10.472～151.501，P<0.05)，兩組細胞的LDH漏出量、ROS水平、ATP含量、ΔΨm、自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Bad、BNIP3、P62蛋白表達水平與模型組細胞比較，差異均具有顯著性(t=2.54～17.37，P<0.05)。見表1。透射電鏡下觀察結果顯示，模型組的細胞存在大量的自噬體，而在正常組、AzA組的細胞中存在少量的自噬體(圖1)。

表1 三組H9c2細胞各項指標的比較

2.3 AzA對DOX誘導的細胞中BNIP3與Mitotracker共定位的影響

結果顯示，正常組、模型組、AzA組細胞BNIP3與Mitotracker的Pearson系數分別為0.19±0.05、0.53±0.04、0.41±0.06，各組間比較差異具有顯著性(F=61.642，P<0.05)，模型組、AzA組細胞BNIP3與Mitotracker的Pearson系數與模型組細胞比較，差異均具有顯著意義(t=11.00、4.00，P<0.05)。

2.4 AzA對DOX損傷小鼠心臟收縮功能的影響

心臟超聲檢測結果顯示，正常組、模型組、AzA組小鼠EF%分別為84.22±2.94、43.37±6.83、74.03±11.09，FS%分別為48.68±4.71、18.57±3.60、39.07±11.29，3組小鼠EF%、FS%比較差異具有顯著性(F=22.815、13.078，P<0.05)，進一步兩兩比較，正常組、壬二酸組小鼠與模型組小鼠比較，EF%、FS%差異均具有顯著性(t=3.41～6.49，P<0.05)。

2.5 AzA對小鼠心肌組織纖維化的影響

模型組小鼠與正常組比較，心肌纖維排列紊亂、心肌間質膠原纖維明顯增加，而AzA組小鼠與模型組比較，心肌纖維排列紊亂明顯改善，心肌間質膠原纖維明顯減少(圖2)。

上排放大倍數8 000倍，右下角bar代表1 μm，下排為上排部分區域的局部放大(20 000倍)，右下角bar代表500 nm，黑色箭頭所指為自噬體

圖2 各組小鼠心肌組織纖維化情況比較(200倍)

3 討 論

DOX導致的心肌損傷機制并不明確，是目前研究熱點之一。既往研究表明機體產生的過量ROS所致氧化應激反應是DOX誘發心肌損傷的原因之一[14-15]。線粒體是產生ROS的主要細胞器，也是真核細胞生物ATP產生的主要場所，心肌組織能量代謝活躍，線粒體富集，過量ROS產生及細胞能量代謝紊亂導致線粒體受損或功能障礙，進而激活線粒體自噬的發生[16]。線粒體內膜上存在大量的心磷脂，而DOX對其具有很高的親和力，可與其形成藥物-脂質復合物，導致ΔΨm降低，從而抑制電子傳遞鏈中氧化磷酸化反應的進行，產生更多的ROS[17]。研究顯示線粒體自噬可能是DOX誘導心肌損傷的重要機制[18]。

含有LC3相互作用基序(LIR)的BNIP3蛋白屬于Bcl-2家族，其作用包括促進線粒體分裂但抑制其融合，同時可促進LC3的表達，獨立影響線粒體自噬，調節線粒體更新及細胞凋亡途徑，參與細胞內線粒體自噬以及細胞死亡過程[19]。研究表明在DOX誘導的心肌毒性模型中，BNIP3通過向線粒體轉移，促進了細胞的通透性和去極化，進而啟動線粒體自噬[20]。自噬開始后，自噬相關蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，即LC3-Ⅰ蛋白含量減少，LC3-Ⅱ蛋白含量增加[21]。因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的變化可間接判斷細胞自噬變化趨勢。P62蛋白與自噬效應蛋白LC3相互作用，并可作為底物通過自噬-溶酶體途徑被降解[22]。因此，P62蛋白含量的增加提示自噬流被阻斷。

本研究通過建立DOX誘導的體內外損傷模型，探討了AzA對DOX所致心肌損傷的保護作用。早期研究發現，安體舒通和依普利酮可通過改善EF%和FS%，減少心肌組織纖維化降低DOX誘導的心肌毒性[23-24]。本研究在心肌超微結構上發現模型組心肌細胞的細胞質發生破裂，心肌纖維排列出現紊亂，藍色膠原纖維增加，表明DOX可引起心肌纖維化，而AzA組H9c2心肌細胞較模型組更完整，心肌纖維排列整齊有序，藍色膠原纖維減少，提示AzA可以改善DOX誘導的心肌纖維化。此外，模型組小鼠與正常組相比較，心臟功能收縮性指標(EF%、FS%)出現顯著差異，心臟收縮功能明顯下降，提示經AzA治療后改善了小鼠心臟收縮功能。H9c2心肌細胞暴露于DOX 24 h以后，細胞活力明顯下降，細胞培養的上清液中LDH含量及細胞內ROS水平均明顯升高。心肌細胞膜受損或破裂可釋放LDH，從而造成細胞外LDH含量的增加。因此細胞外LDH含量能夠在一定水平上反映出心肌細胞損傷程度。ROS水平升高，可進一步導致線粒體膜通透性增加，引起ΔΨm降低，加重線粒體損傷，同時受損嚴重的線粒體又可釋放更多的ROS到細胞中，最終導致了線粒體自噬以及細胞凋亡的發生[25]。本研究中CCK-8實驗結果顯示AzA濃度為10 μmol/L時可顯著提高DOX誘導的H9c2心肌細胞活力，提示高濃度AzA時對細胞不再具有保護作用。先前也有研究顯示，高濃度AzA因干擾線粒體氧化還原酶的功能而產生細胞毒性，從而失去對細胞的保護作用[26]，因此根據本研究和相關研究的結果，本研究最后確定后續實驗中AzA的濃度為10 μmol/L。本研究結果顯示，AzA可以顯著抑制DOX誘導的H9c2心肌細胞活力的下降，并顯著抑制DOX所致細胞LDH漏出量和細胞內ROS水平的增加，提示AzA具有保護H9c2心肌細胞免受DOX所致心肌毒性作用。線粒體途徑凋亡蛋白Bad表達水平增加與線粒體自噬過度激活有關，而線粒體自噬過度激活可加重DOX誘導的H9c2心肌細胞損害，進而促進心肌細胞凋亡。為了研究AzA保護DOX誘導的H9c2心肌細胞是否與調控線粒體自噬減輕細胞凋亡有關,本研究檢測了H9c2心肌細胞內ATP水平、ΔΨm變化、凋亡相關蛋白Bad及自噬相關蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達水平,結果顯示DOX降低了心肌細胞中ATP含量、ΔΨm和P62蛋白表達水平，升高了自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。而AzA有升高DOX損傷心肌細胞內ATP含量、升高ΔΨm、降低Bad蛋白表達、升高P62蛋白表達水平的作用。推測AzA是通過抑制線粒體自噬從而發揮保護DOX誘導的H9c2心肌細胞作用的。本研究對AzA是否調控BNIP3介導的線粒體自噬進行了進一步的探討，Western blot檢測結果顯示，模型組BNIP3蛋白表達水平較正常組顯著升高，說明可能與BNIP3介導的線粒體自噬有關；與模型組比較，AzA組BNIP3蛋白表達顯著降低，推測AzA保護DOX致H9c2心肌細胞損傷的機制，可能是通過抑制BNIP3介導的線粒體自噬參與的。

綜上所述，AzA通過抑制BNIP3介導的線粒體自噬、抑制H9c2心肌細胞凋亡、增強細胞活力、減輕心肌纖維化，最終改善心功能以抵抗DOX心肌毒性。