泛素連接酶三基序蛋白21對(duì)結(jié)直腸癌鞘氨醇激酶2的調(diào)控作用及其機(jī)制

肖明超 孟昭源 趙姣姣 方文碩 藺吉春 馬蕾娜

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。CRC的重要特征之一是細(xì)胞中鞘脂代謝的失調(diào)[2]。已有研究表明鞘氨醇激酶2(SphK2)在CRC細(xì)胞中異常高表達(dá)將打破鞘脂代謝平衡，促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、遷移以及化學(xué)治療耐藥的發(fā)生[3-4]。因此，探討SphK2在CRC中的調(diào)控以及修飾機(jī)制或能為CRC的治療提供更好的策略。盡管SphK2在CRC細(xì)胞中的重要功能已被證實(shí)，但CRC中SphK2高表達(dá)的原因及其上游的調(diào)控蛋白尚未完全闡明。泛素化修飾作為重要的翻譯后修飾方式之一，通過(guò)調(diào)控底物蛋白的穩(wěn)定性、活性或細(xì)胞定位而參與調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞過(guò)程，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-8]。然而，在CRC中SphK2的泛素化修飾機(jī)制并不清楚。三基序蛋白21(TRIM21)是細(xì)胞中的一種泛素連接酶，在泛素化修飾過(guò)程中起關(guān)鍵的催化作用，能直接決定泛素化修飾的特異性及底物蛋白命運(yùn)，可能是結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。因此，本研究旨在探討CRC中泛素連接酶TRIM21對(duì)SphK2的調(diào)控作用及其機(jī)制，為CRC的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

HEK-293T細(xì)胞系、PLC/RPF/5細(xì)胞系、RKO細(xì)胞系均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。CCK-8試劑盒(大連美侖生物技術(shù)公司)，體外泛素化檢測(cè)試劑盒(優(yōu)碧生物公司)，SphK2抗體(武漢Proteintech公司)，Ubquitin抗體、β-Actin抗體(美國(guó)CST公司)，TRIM21抗體(武漢愛(ài)博泰克公司)，Vinculin抗體、瓊脂糖珠(美國(guó)Sigma公司)，谷胱甘肽瓊脂糖珠(美國(guó)GE Healthcare公司)，HA-TRIM21質(zhì)粒、Flag-SK2質(zhì)粒、His-TRIM21質(zhì)粒(本課題組實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)、GST-SphK2質(zhì)粒，psPAX2質(zhì)粒、PMD2.G質(zhì)粒、sgTRIM21質(zhì)粒均購(gòu)自于Addgene: Homepage網(wǎng)站。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)以及處理 將HEK-293T細(xì)胞、PLC/RPF/5細(xì)胞、RKO細(xì)胞均接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS、體積分?jǐn)?shù)0.01的青霉素-鏈霉素混合液的細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用胰酶消化傳代或參照聚乙烯亞胺說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2采用質(zhì)譜與免疫共沉淀方法鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況 將轉(zhuǎn)染Flag-SphK2后的PLC/RPF/5細(xì)胞分為a、b、c、d、e組，分別采用表皮生長(zhǎng)因子刺激、葡萄糖饑餓處理、過(guò)氧化氫刺激、缺氧處理、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β刺激。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞裂解并行SDS-PAGE電泳，切取SphK2所在的蛋白凝膠作為質(zhì)譜樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。另外將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞分為f、g組，分別轉(zhuǎn)染Flag-SphK2、Flag-SphK2+HA-TRIM21質(zhì)粒。當(dāng)轉(zhuǎn)染36 h后，加入10 μmol/L MG132處理細(xì)胞12 h。制備細(xì)胞裂解液，向裂解液中分別加入HA、Flag抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM21與SphK2的相互作用情況。

1.2.3采用體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)鑒定TRIM21介導(dǎo)的SphK2泛素化 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK-293T細(xì)胞分為h、i、j、k組，分別轉(zhuǎn)染Flag-SphK2、Flag-SphK2+His-Ubquitin、Flag-SphK2+His-Ubquitin+1 μg HA-TRIM21質(zhì)粒以及Flag-SphK2+His-Ubquitin+4 μg HA-TRIM21質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染36 h后，加入10 μmol/L MG132處理12 h，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[10]進(jìn)行His-Ubquitin pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SphK2的泛素化水平。

1.2.4采用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況 將His-TRIM21、GST-SphK2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)大腸桿菌，參照蛋白質(zhì)純化手冊(cè)制備純化的His-TRIM21、GST-SphK2蛋白。之后將兩蛋白混合，將混合液分為p、q組，分別加入瓊脂糖珠以及谷胱甘肽瓊脂糖珠，參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11]來(lái)進(jìn)行蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM21與SphK2蛋白相互作用的情況。

1.2.5采用體外泛素化實(shí)驗(yàn)鑒定TRIM21介導(dǎo)的SphK2泛素化 將EP管分為r、s、t三組，每組分別加入GST-SphK2+E1/E2/Ub、GST-SphK2+His-TRIM21、GST-SphK2+His-TRIM21+E1/E2/Ub蛋白。參照體外泛素化試劑盒說(shuō)明書(shū)制備免疫印跡(Western-blot)樣品，檢測(cè)TRIM21對(duì)SphK2泛素化水平的影響。

1.2.6TRIM21敲除對(duì)RKO細(xì)胞中SphK2蛋白水平以及蛋白半衰期的影響 參照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法[12]生產(chǎn)并收集慢病毒。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RKO細(xì)胞分為u、v、w、x四組，分別感染慢病毒LV-sgTRIM21-1、LV-sgTRIM21-2、LV-sgTRIM21-3以及LV-sgControl，以獲得TRIM21敲除的RKO細(xì)胞系。通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)u～x組細(xì)胞中SphK2蛋白水平的變化。之后向u～x組的細(xì)胞中分別加入終濃度為20 mg/L的放線菌酮CHX，在加藥后的0、12、24 h收集細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，以用于檢測(cè)TRIM21敲除對(duì)細(xì)胞中SphK2半衰期的影響。

1.2.7TRIM21過(guò)表達(dá)對(duì)HEK-293T細(xì)胞SphK2蛋白水平的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞分為l、m、n、o組，分別轉(zhuǎn)染HA-TRIM21質(zhì)粒0、0.3、0.6、0.9 μg，進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM21外源過(guò)表達(dá)對(duì)SphK2蛋白水平的影響。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計(jì)算，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.2.8TRIM21對(duì)RKO細(xì)胞5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的u～x組RKO細(xì)胞消化接種于96孔板中，設(shè)置7個(gè)濃度梯度組，待細(xì)胞貼壁后每孔中加入含不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)5-FU的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48、72、96 h后，向各孔中分別加入10 μL的CCK-8檢測(cè)液，并在37 ℃下孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SphK2與TRIM21蛋白相互作用情況

圖1A、B分別為質(zhì)譜樣品的考馬斯亮藍(lán)染色、Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，其結(jié)果顯示TRIM21、HECTD2、RBBP6、BRE1B、LNX1、HuWE1、DTX3、RNF113A在內(nèi)的8種泛素連接酶和2種去泛素酶USP15、OTU1均可能與SphK2存在著相互作用。其中，除TRIM21檢測(cè)到的肽段數(shù)值為17以外，其他7種泛素連接酶的肽段數(shù)值均為1，該值越高代表蛋白質(zhì)的可信度越高。因此進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫共沉淀、蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRIM21與SphK2間存在相互作用。其中，蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖1C、D所示，與f組相比，g組能夠檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的SphK2及TRIM21條帶，證明SphK2與TRIM21之間可以發(fā)生相互作用。蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1E所示，與p組相比較，q組能檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的TRIM21條帶，也進(jìn)一步證實(shí)TRIM21與SphK2存在相互作用。

A和B：質(zhì)譜鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況，C和D：驗(yàn)證SphK2與TRIM21蛋白在體內(nèi)的相互作用情況，E:驗(yàn)證GST-SphK2與His-TRIM21蛋白在體外的相互作用情況

2.2 TRIM21對(duì)SphK2泛素化水平的調(diào)控作用

體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A所示，與h、i組相比，j、k組HEK-293T細(xì)胞中SphK2泛素化水平隨TRIM21轉(zhuǎn)染量的增加而提高，證明TRIM21可以介導(dǎo)SphK2發(fā)生泛素化。體外泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，與r、s組相比，t組檢測(cè)到了SphK2泛素化條帶，進(jìn)一步證實(shí)TRIM21能夠介導(dǎo)SphK2的泛素化修飾。

2.3 TRIM21對(duì)SphK2蛋白表達(dá)水平的影響

TRIM21外源過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，l～o組細(xì)胞中SphK2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.02、0.84±0.08、1.56±0.12、1.72±0.10，與l組比較，m～o組SphK2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(F=196.22，P<0.05)?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示，x、u、v組細(xì)胞中SphK2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.44±0.14、0.37±0.18、0.45±0.19，與x組比較，u、v組細(xì)胞中SphK2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(F=37.30，P<0.05)。半衰期實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C所示，u組SphK2蛋白降解速率高于x組。

A、B分別為體內(nèi)、體外泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TRIM21對(duì)SphK2泛素化水平的調(diào)控作用

A為HEK-293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIM21對(duì)SphK2蛋白表達(dá)水平的影響，B、C分別為RKO細(xì)胞中敲除TRIM21對(duì)SphK2蛋白表達(dá)水平、蛋白半衰期的影響

2.4 5-Fu不同作用時(shí)間對(duì)敲除TRIM21的RKO細(xì)胞存活率的影響

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間與組別交互作用對(duì)細(xì)胞存活率均有明顯的影響(F組別=365.67，F(xiàn)時(shí)間=251.95，F(xiàn)時(shí)間*組別=16.73，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在5-Fu處理細(xì)胞48、72、96 h后，與x組相比，u～w組細(xì)胞的存活率明顯降低(F=24.83～890.51，P<0.05)；并且隨著5-Fu作用時(shí)間的增長(zhǎng)，u～x四組細(xì)胞的存活率顯著降低(F=30.42～92.13，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5-Fu不同作用時(shí)間對(duì)敲除TRIM21的RKO細(xì)胞存活率的影響

3 討 論

在世界范圍內(nèi)，CRC患者的發(fā)病率和死亡率均居前列[13]。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布，我國(guó)2020年CRC新發(fā)病例56萬(wàn)，排名超過(guò)胃癌躍居第2位[14]。且隨著生活水平的提高和人口老齡化的加劇，CRC的發(fā)病率還將不斷提高。CRC患者迫切需要高效的治療方案。盡管手術(shù)、放化療是長(zhǎng)期以來(lái)結(jié)直腸癌治療的常用策略，但療效并不理想，有待進(jìn)一步完善。

隨著脂質(zhì)代謝組學(xué)研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到CRC的特征之一是鞘脂代謝的失調(diào)[2,15]。鞘脂代謝的產(chǎn)物主要包括神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，它們均可以作為信號(hào)分子參與級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵過(guò)程。其中，Cer和Sph可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,然而與之相反的是S1P可以促進(jìn)細(xì)胞存活以及增殖[16-18]。正常情況下，這3種信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)處于復(fù)雜的動(dòng)態(tài)平衡中：Cer可以被水解生成Sph，而Sph則可以通過(guò)鞘氨醇激酶SphK磷酸化生成S1P[19-21]。它們之間的轉(zhuǎn)化決定著細(xì)胞的命運(yùn)是走向凋亡還是走向增殖。Sphk是這個(gè)過(guò)程最關(guān)鍵的調(diào)控酶之一，它包含兩種亞型：SphK1和SphK2。雖然兩種酶高度同源且催化相同的反應(yīng)，但是它們?cè)趤喖?xì)胞定位、組織分布等方面并不相同。其中，SphK2在結(jié)直腸癌中起到重要的作用，具體表現(xiàn)為：一方面，SphK2在CRC中表現(xiàn)為異常的高表達(dá)，這種高表達(dá)促進(jìn)了CRC細(xì)胞的增殖、遷移[3]；另一方面，SphK2的高表達(dá)可以降低多種CRC化療藥物的抗癌作用[22]，包括全反式維甲酸(ATRA)、丁酸鈉(SB)及一線化療藥物5-Fu，而下調(diào)SphK2的表達(dá)水平可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)這些化療藥物的敏感性[4,19-20]，提示SphK2可能是CRC治療的靶點(diǎn)。盡管結(jié)直腸癌中SphK2的重要功能已被證實(shí)，但結(jié)直腸癌中SphK2高表達(dá)的原因及其上游的調(diào)控蛋白尚未完全闡明。

本研究首先通過(guò)質(zhì)譜分析、免疫共沉淀及蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了泛素連接酶TRIM21與SphK2蛋白間的相互作用。為探究這種相互作用的具體機(jī)制，本研究進(jìn)行了體內(nèi)及體外泛素化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)TRIM21可以介導(dǎo)SphK2的泛素化修飾。隨后，為探索TRIM21介導(dǎo)的SphK2泛素化修飾對(duì)SphK2蛋白水平的影響，本研究構(gòu)建了TRIM21敲除的RKO細(xì)胞系，通過(guò)Western-blot和半衰期實(shí)驗(yàn)，證明了TRIM21介導(dǎo)的SphK2泛素化修飾能夠穩(wěn)定SphK2蛋白水平?？紤]到有文獻(xiàn)報(bào)道SphK2的高表達(dá)能提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性，所以我們推測(cè)，敲除TRIM21或許能夠逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥。本研究通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)這一猜想進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在5-Fu處理的情況下，TRIM21敲除的RKO細(xì)胞存活率顯著低于x組細(xì)胞，即TRIM21的敲除提高了RKO細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。

本研究不僅是對(duì)SphK2修飾機(jī)制在理論上的完善，還對(duì)于臨床治療具有參考意義：①提示抑制TRIM21或許能夠作為CRC治療的新策略。由于SphK2對(duì)一些腫瘤具有致癌的效應(yīng)[23-26]，目前已有SphK2抑制劑相關(guān)的研究，然而SphK2抑制劑效價(jià)低、特異性低，限制了其在臨床治療的應(yīng)用[22,27]。而本研究發(fā)現(xiàn)TRIM21能穩(wěn)定SphK2蛋白水平，提示可以去開(kāi)發(fā)TRIM21的抑制劑用于CRC單獨(dú)治療，或聯(lián)合SphK2抑制劑進(jìn)行CRC的治療。②提示可以通過(guò)抑制TRIM21解決由SphK2高表達(dá)導(dǎo)致的5-Fu、ATRA、SB的耐藥問(wèn)題。耐藥的產(chǎn)生是化療的主要障礙之一，通過(guò)抑制TRIM21解決這些藥物的耐藥是一種全新的策略。③提示在CRC中TRIM21可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的一項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，本研究證實(shí)了CRC中TRIM21通過(guò)與SphK2發(fā)生相互作用，催化SphK2發(fā)生泛素化，這種泛素化穩(wěn)定了SphK2蛋白性能。而敲除TRIM21的CRC細(xì)胞的SphK2蛋白水平顯著下降，并且對(duì)5-FU敏感性也增加。本研究揭示了TRIM21在CRC細(xì)胞中對(duì)SphK2的調(diào)控作用，并提出了一種解決CRC細(xì)胞5-FU耐藥的潛在方案，為CRC治療策略的完善提供了新的支持。