環狀RNA在缺氧/復氧誘導的大鼠H9c2細胞焦亡中的作用及其機制

陳鑫哲 王飛 王凱 王曼

(青島大學轉化醫學研究院，山東 青島 266021)

據統計，自2010年以來，心血管系統疾病已經成為中國居民死亡率最高的疾病，每5例死亡者中就有2例死于心血管系統疾病[1]。心肌梗死作為心血管系統疾病的死亡原因之首，值得引起重視并需要進行深入研究。因此，有效的早期診斷和治療對于提高心肌梗死患者的生存質量以及降低死亡率至關重要[2]。環狀RNA(circRNA)是一類不含5′端帽和3′端Poly A尾首尾結合的共價閉合環狀非編碼RNA[3]。研究顯示，circRNA廣泛存在于真核生物中，其表達有組織或細胞特異性，而且circRNA結構相對穩定，具有成為生物標記物的潛力。近期研究顯示，circRNA與心血管系統疾病的發生發展密切相關。例如，自噬相關circRNA(ACR)通過調控PlNKl/FAM65B信號通路，以減輕小鼠心肌缺血再灌注(I/R)損傷[4]；circ_00023通過吸附miR-26b-5p，促進小鼠心臟成纖維細胞的纖維化[5]。因此，circRNA在診斷和治療心血管系統疾病方面具有較大潛力，但其具體的調控機制仍不明確。

2001年COOKSON等[6]發現半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)引起的促炎性細胞死亡方式，并首次提出了細胞焦亡(pyroptosis)的概念。細胞焦亡，又被稱為細胞炎性壞死，是一種由炎癥小體介導的細胞程序性死亡，主要表現為細胞不斷腫脹膨大直至細胞破裂，致使細胞內容物釋放，從而觸發強烈的炎癥反應。研究顯示，caspase-1抑制劑VX-765能夠抑制細胞焦亡通路，減少I/R損傷大鼠模型的心肌梗死面積[7]，表明細胞焦亡與心血管系統疾病的發生密切相關。circRNA-NNT通過靶向miR-33a-5p調節泛素特異性蛋白酶46(USP46)，促進心肌細胞焦亡和心肌I/R損傷[8]。同時circRNA可能參與心肌I/R損傷的發病機制；然而，目前仍缺乏關于circRNA對心肌I/R損傷調控機制的深入研究?；诒緦嶒炇仪捌诘母咄繙y序分析結果，發現在缺氧/復氧(H/R)處理的H9c2細胞中mmu_circ_0000723的表達水平顯著降低。在circBase數據庫查詢結果顯示，mmu_circ_0000723位于17號染色體上的內含子區域，其序列由環化點間的所有堿基構成，序列全長1 946個堿基，是一類內含子circRNA。盡管mmu_circ_0000723已被circBase數據庫所收錄，但是尚未見關于mmu_circ_0000723的研究報道，并且mmu_circ_0000723在H/R誘導心肌細胞焦亡中的作用機制仍不清楚。本研究通過敲低H9c2細胞中mmu_circ_0000723的表達水平及檢測H9c2細胞焦亡活性，進一步探討mmu_circ_0000723在H/R誘導H9c2細胞焦亡中的作用及其分子機制，為心肌I/R損傷的治療提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠心肌細胞H9c2由本實驗室保存，反轉錄試劑盒AG11705、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒AG11701購自于湖南艾科瑞生物工程有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒A020-2(南京建成生物科技有限公司)，焦亡素D蛋白C端肽段(GSDMD-C)抗體AF4012(美國AffinitY公司)，mmu_circ_0000723特異性siRNA(siRNA-mmu_circ_0000723)以及陰性對照siRNA(NC)均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 細胞培養

將大鼠H9c2細胞置于含體積分數0.10 FBS和體積分數0.01雙抗混合液(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM高糖培養基中，于含體積分數0.05 CO2的37 ℃濕潤的培養箱中進行培養，每隔48 h換培養液一次，待細胞處于對數生長期并且生長良好的情況下傳代，將對數生長期的細胞懸液接種于直徑6 cm的培養皿中培養12 h，用于后續實驗。

1.3 研究方法

1.3.1H/R處理的H9c2細胞焦亡活性檢測及最佳缺氧時間的確定 取對數生長期的H9c2細胞，以每孔約5×104個細胞接種于6孔板中，待細胞密度約達80%時，分別進行缺氧0 h(A組)、1 h(B組)、3 h(C組)、6 h(D組)、12 h(E組)、24 h(F組)處理后，再進行6 h復氧。并嚴格按照LDH試劑盒的操作方法檢測各組細胞上清液中LDH活性。采用Western blot方法檢測各組細胞中焦亡相關蛋白GSDMD-C、IL-1β和caspase-1的表達水平。各實驗均重復3次，結果取均值。根據各組H9c2細胞上清液中LDH活性和焦亡相關蛋白的表達水平，確定誘導細胞焦亡的最佳缺氧時間，后續實驗均采用該時間點進行細胞缺氧處理。

1.3.2H/R處理的H9c2細胞中circRNA表達水平的檢測 取對數生長期的H9c2細胞，以每孔約5×104個細胞接種于6孔板中，待細胞密度約達80%時進行實驗。將置于細胞培養箱正常培養12 h的H9c2細胞作為對照組，H/R處理的H9c2細胞作為實驗組。通過Trizol法提取兩組細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，隨后嚴格按照RT-qPCR方法進行操作，以GAPDH作為內參照，檢測circRNA的相對表達水平。實驗重復3次，結果取均值。引物名稱及其序列見表1。

1.3.3siRNA-mmu_circ_0000723敲低目標基因效果驗證 取對數生長期的H9c2細胞，以每孔約5×104個細胞接種于6孔板中，待細胞密度約達60%時進行轉染。根據不同的處理方法將細胞分為G～I組。G組置于細胞培養箱中正常培養12 h，H組轉染NC，I組轉染siRNA-mmu_circ_0000723，并于轉染24 h后收集細胞。采用Trizol法提取G～I組細胞的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，并嚴格按照RT-qPCR試劑盒說明進行實驗操作，以GAPDH作為內參照，檢測mmu_circ_0000723的相對表達水平。實驗重復3次，結果取均值。引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.3.4敲低mmu_circ_0000723對H9c2細胞焦亡的影響 取對數生長期的H9c2細胞，以每孔約5×104個細胞接種于6孔板中，根據不同的處理方法將細胞分為J～M組。J組置于細胞培養箱中正常培養12 h，K組置于厭氧培養箱進行H/R處理；H9c2細胞密度約達60%時，L和M組分別轉染對照NC和siRNA-mmu_circ_0000723，并于轉染24 h后進行H/R處理。嚴格按照LDH試劑盒進行操作，分別檢測J～M組H9c2細胞上清液中LDH活性，采用Western blot方法檢測J～M組H9c2細胞中焦亡相關蛋白表達水平。實驗重復3次，結果取均值。

將10 mm×10 mm蓋玻片鋪入24孔板中，取對數生長期的H9c2細胞，以每孔約2×104個細胞接種于24孔板中的蓋玻片上，按照上述J～M組分組方式進行處理。嚴格按照碘化丙啶(PI)染色法對J～M組細胞進行染色，檢測H9c2細胞死亡情況；采用抗熒光淬滅的封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算PI陽性細胞比率。PI陽性細胞比率(%)=死亡細胞數/總細胞數。實驗重復3次，結果取均值。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 H/R處理后H9c2細胞焦亡活性檢測及最佳缺氧時間的確定

經H/R處理后，A～F組H9c2細胞上清液中LDH活性及GSDMD-C、IL-1β和caspase-1蛋白表達水平差異均具有顯著性(F=24.86～2 153.00，P<0.05)；與A組相比，D組細胞中上述4個指標顯著升高(t=4.14～62.88，P<0.05)。缺氧處理6 h的H9c2細胞(D組)中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β的蛋白表達水平最高，因此，后續細胞缺氧時間均采用6 h。見圖1及表2。

A～F代表A～F組

表2 A～F組中焦亡相關蛋白的表達水平及LDH活性比較

2.2 對照組和實驗組H9c2細胞中circRNA的表達水平比較

RT-qPCR結果顯示，對照組和實驗組H9c2細胞當中mmu_circ_0000723的相對表達水平分別為1.00±0.01、0.56±0.01。與對照組相比，實驗組中mmu_circ_0000723的表達水平明顯降低(t=9.78，P<0.05)；對照組和實驗組中circRNA_010的相對表達水平分別為1.00±0.01、0.92±0.01，兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 siRNA-mmu_circ_0000723敲低目標基因效果驗證

RT-qPCR結果顯示，G～I組中mmu_circ_0000723的表達水平分別為1.00±0.01、0.99±0.02和0.57±0.03，組間比較差異有顯著性(F=348.20，P<0.05)；I組mmu_circ_0000723的相對表達水平與G組相比顯著降低(t=22.88，P<0.05)；H組中mmu_circ_0000723的相對表達水平與G組相比差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 敲低mmu_circ_0000723對H9c2細胞焦亡的影響

J～M組H9c2細胞上清液中LDH活性、PI陽性細胞比例以及GSDMD-C、IL-1β和caspase-1蛋白相對表達水平比較，差異有顯著性(F=34.39～8 528.00，P<0.05)。與K組相比較，M組細胞中上述5個指標均明顯升高(t=4.99～54.00，P<0.05)，而L組細胞中上述5個指標差異均無顯著性(P>0.05)。見圖2、3及表3。

J～M代表J～M組

表3 J～M組細胞焦亡相關蛋白表達水平和LDH活性比較

J～M代表J～M組，PI染色，200倍

3 討 論

心血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一，患者死亡率逐年增高[1]。既往研究表明，炎癥參與多種心血管疾病病變過程。細胞焦亡是近年來發現并證實的一種促炎性的細胞程序性死亡方式，與多種疾病的發生和發展有著高度相關性。焦亡的細胞主要表現為細胞膜腫脹失去完整性，但細胞核卻保持完整，DNA片段化、染色質高度凝集、細胞纖維結構被破壞，并伴有明顯的炎癥反應，會加速細胞的死亡進程[9]。作為促炎性的程序性細胞死亡方式，細胞焦亡參與了心血管系統疾病的發生發展整個過程[10-13]。研究顯示，GSDMD是細胞焦亡通路中的主要執行蛋白[14-16]，GSDMD本身沒有活性，而活化的caspase-1能夠將GSDMD切割為N端(GSDMD-N)和C端(GSDMD-C)兩個相互獨立的結構域，GSDMD-N通過轉移至細胞質膜附近，與磷脂結合并多聚化，在細胞膜上形成孔洞，導致細胞膨脹破裂，最終引發焦亡[17]。為了闡明細胞焦亡在心肌I/R損傷中作用機制，本研究通過H/R處理H9c2細胞，模擬心肌I/R損傷，分別采用LDH試劑盒以及Western blot方法檢測H/R誘導H9c2細胞上清液中LDH活性以及細胞中焦亡相關蛋白的表達水平。H9c2細胞進行缺氧0、1、3、6、12、24 h，復氧6 h處理后，收集細胞裂解液行Western blot檢測。結果顯示，缺氧6 h處理后，H9c2細胞中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白的表達水平最高。隨著缺氧時間不斷增加，細胞上清液中LDH活性不斷升高。以上結果表明，H/R處理能夠促進H9c2細胞中焦亡通路蛋白表達和LDH釋放，誘導細胞焦亡。

研究顯示，circRNA能夠作為分子海綿，有結合小分子RNA(microRNA)和蛋白的活性，廣泛參與多種細胞信號通路[18-20]。已有研究證實了circRNA在骨骼肌缺血性損傷、糖尿病心肌病、糖尿病腎病和急性胰腺炎等疾病中的作用[21-24]。另外，circRNA與心血管系統疾病的發生和發展也有密切關系[25]。WANG等[26]研究發現circRNAMFACR可以通過與miR-652-3p的相互作用，調控線粒體蛋白18(MTP18)基因的表達，介導H/R誘發的小鼠心肌細胞凋亡和心肌梗死。然而，circRNA在心肌細胞焦亡中的作用機制仍不清楚。因此，尋找心臟中特異表達且參與調控心肌細胞焦亡的circRNA至關重要。在本實驗的前期研究中，對H/R處理H9c2細胞的高通量測序結果顯示，mmu_circ_0000723在H/R處理的H9c2細胞中表達水平較低。以此為基礎，本研究以mmu_circ_0000723為研究對象，通過RT-qPCR方法證實mmu_circ_0000723在H/R處理的H9c2細胞當中的表達水平顯著下調，提示mmu_circ_0000723可能在H/R誘導的H9c2細胞焦亡中發揮重要作用。為了進一步探討mmu_circ_0000723的生物學功能，本研究采用siRNA敲低H9c2細胞中mmu_circ_0000723的表達并分析其對H/R誘導的心肌細胞焦亡的調控作用。本研究實驗結果顯示，與對照H9c2細胞相比，H/R處理組PI陽性細胞比例和LDH活性增高，且H/R處理的H9c2細胞中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白表達水平升高。因此，H/R能夠誘導H9c2細胞焦亡。與僅進行H/R處理的H9c2細胞相比，敲低mmu_circ_0000723后進行H/R處理組的PI陽性細胞比例、LDH活性以及caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白的表達水平均明顯升高。以上結果表明，敲低mmu_circ_0000723能夠促進H/R誘導的H9c2細胞焦亡。

綜上所述，本研究的結果顯示，在H/R處理的H9c2細胞中mmu_circ_0000723的表達水平明顯降低。敲低mmu_circ_0000723能夠促進H/R誘導的caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白表達，加劇H9c2細胞焦亡。因此，mmu_circ_0000723作為潛在的治療靶標，在心血管疾病診斷和治療方面有巨大的價值。本研究成果為心血管疾病診斷標志物的篩選和治療藥物的研發提供了一定的理論基礎。