血清剝奪反應因子(Sdpr)敲除及轉基因小鼠的建立與表型分析

李欣悅石桂英雷雪裴黃藝瀅李珂雅侯麗雅王凱瑜湯家鳴白 琳

(國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021)

胞膜窖(caveolae)是細胞表面內陷的結構,陷窩由脂質筏形成并通過小窩蛋白(caveolin)聚合,在細胞內吞、細胞膜組裝、細胞內運輸、膽固醇穩態調節、信號傳導及腫瘤生成等生物學活動中具有重要作用[1-2]。

Cavin 家族是調節胞膜窖形成和功能的家族[3-4],包括了Cavin-1、Cavin-2、Cavin-3、Cavin-4 4個成員[5]。 其中Cavin-2 也稱血清剝奪反應因子(serum deprivation-response protein,SDPR),為胞膜窖調節蛋白家族成員,位于人2 號染色體的q32-q33位,由418 個氨基酸組成,在不同物種中具有高度的同源性。 SDPR 是最初人血小板中純化為磷脂酰絲氨酸(PS)結合蛋白[6],并在體外被證明是蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)異構體的底物[7],被發現在血清饑餓的細胞中高表達[8]。 近年來對其功能的研究發現,SDPR 直接參與胞膜窖生物發生和形態,是形成胞膜窖時膜內陷所必需的,且其功能可能一部分獨立于胞膜窖[9],另一方面可以調節胞膜窖的形態,誘導微管形成的動力學過程[10]。 近幾年來對SDPR 的研究主要集中在腫瘤學的研究,已發現在多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌和腎癌中Sdpr基因表達下調,提示Sdpr可能為作為抑癌基因影響腫瘤的發生發展[11-13]。Sdpr可通過阻斷轉化生長因子-β 信號通路抑制乳腺癌的進展[14],也通過促進細胞凋亡作為乳腺癌轉移的抑制因子,降低腫瘤遷移和內侵/外滲能力[15]。

現有對Sdpr基因的研究中大多利用細胞系或腫瘤患者組織樣本,為深入研究Sdpr基因的相關功能及其相關胞膜窖蛋白在不同組織器官中的作用機理,本研究中我們利用CRISPR/Cas9 技術和過表達載體建立了Sdpr基因敲除小鼠和Sdpr轉基因小鼠模型,為該基因生物學功能的研究及在多種疾病致病機制及不同疾病進程發展的體內研究中提供有效動物模型。 同時,通過對該模型的初步檢測分析中發現Sdpr基因對小鼠免疫系統具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所需動物為SPF 級C57BL/6J 小鼠(雌性,15 只,3~4 周齡,體重7~12 g;雄性,30 只,6~8 周齡,體重18~25 g)及ICR 小鼠(雌性,4 只,8~10周,體重27~30 g;雄性,2 只,10 周齡,體重35~38 g),購入于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],長期飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所[SYXK(京)2019-0014]SPF 級動物屏障環境動物設施。 飼養環境:溫度20℃~26℃,濕度40%~70%,光照周期明暗比12 h/12 h。 飼養期間動物可自由進食飲水,飼料、水瓶、墊料、鼠盒均經過高溫高壓滅菌處理。 實驗中涉及動物的操作程序已通過本所實驗動物使用與管理委員會審批(BL17001),遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

MEGAshortscriptTMT7 轉錄試劑盒(Invitrogen,Am1354); 鼠尾直接 PCR 試劑盒( Bimake,B45012 ); DL2000 DNA Marker ( TaKaRa );PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)TB Green ?Premix Ex TaqTM(TaKaRa);RIPA 裂解液(Beyotime,P0013B);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime,P0009);PAGE 凝膠快速制備試劑盒(10%)(雅酶,PG112 ); 一 抗: SDPR Polyclonal Antibody(proteintech, 12339-1-AP ), β-actin ( Bioss, bs-0061R);二抗:山羊抗兔(中杉金橋, ZB-5301);紅細胞裂解液(BD, 555899);流式抗體CD3、CD4、CD8、B220、CD11b、NK1.1(Invitrogen)。

PCR 儀(Hema);StepOnePlusTM實 時 熒 光 定 量PCR 儀(applied biosystems,美國);多樣品研磨珠均質儀(OMNI, Bead Ruptor 24 Elite);垂直電泳儀(Bio-Rad,美國);組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(Leica,德國);流式細胞儀(BD FACSAria,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1Sdpr基因敲除小鼠制備

利用CRISPR/Cas9 技術進行Sdpr基因敲除小鼠的建立。 小鼠Sdpr基因(Gene ID: 20324)位于第一號染色體的1 C1.1 區段(ENSMUSG00000045954)。 針對Sdpr基因選擇兩個 sgRNA 靶點(靶點 1:GGCCATCCGAGACAACTCGCAGG 及靶點2: GGTA CTTGGAGAGCTTGGTGAGG),合成兩對寡聚核苷酸鏈(Mice-Sdpr-1-gRNA up: TAGGCCATCCGAGACAACT CGC 和Mice-Sdpr-1-gRNA down: AAACGCGAGTTGTC TCGGATGG;Mice-Sdpr-2-gRNA up: TAGGTACTTGGAG AGCTTGGTG 和Mice-Sdpr-2-gRNA down: AAACCACC AAGCTCTCCAAGTA)。 將合成的sgRNA 單鏈通過退火復性結合成小片段,插入經Bsa Ⅰ酶切線性化的pUC57-sgRNA 表達載體,并將構建完成的sgRNA 載體通過MEGAshortscriptTMT7 轉錄試劑盒體外轉錄成為可注射的sgRNA。

將3~4 周齡C57BL/6 雌鼠注射PMSG 和HCG激素進行超數排卵,與成年C57BL/6 小鼠交配后獲得受精卵用于注射。 Cas9 載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA (30 ng/μL), 與轉錄后的sgRNA(10 ng/μL)混合后注射到小鼠受精卵中。 采用8~10 周齡ICR 雌鼠與結扎的雄鼠交配后選取見栓的雌鼠作為受體鼠,將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部,等待小鼠出生后鑒定基因型。

1.3.2Sdpr基因轉基因小鼠制備

用PCR 擴增的小鼠Sdpr(Gene ID:20324)基因全長克隆至pUBC-SBase 表達載體,將擴增片段插入 pUBC 載 體 的 UBC 啟 動 子 下 游, 由 PvuI(TaKaRa)對載體線性化后獲得轉基因DNA 片段,經過Sephedex G50 柱純化并調整濃度為5 ng/μL,通過顯微注射技術將線性化的轉基因載體注射到SPF 級C57BL/6J 小鼠受精卵中,將注射后的受精卵移植至假孕受體ICR 小鼠體內,等待小鼠出生后鑒定基因型。

1.3.3 基因型鑒定

小鼠出生后編號并剪取尾尖,利用鼠尾直接PCR 試劑盒裂解鼠尾提取基因組DNA。 根據序列信息設計設計檢測引物(上海英濰捷基)。 敲除檢測 引 物 為: Mice-SdprKO-F: 5’-GCTCACTTCAG ACCAACCAGCC-3 ’ 和 Mice-SdprKO-R: 5 ’-GGACTGAGCTCAAGTAGGTGGAGG-3’ (野 生 條 帶為612 bp,敲除條帶為451 bp);轉基因檢測引物為:Sdpr-F1: 5’-ATCCAGAACGACCTCACCAAG-3’和Sdpr-R1: 5’-TATCGACTTTCTTGAGGCTGGAT-3’(條帶為445 bp)PCR 反應體系為20 μL。 反應程序為95℃5 min;(95℃30 s,60℃30 s,72℃45 s)×30個循環;72℃10 min。 采用濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并成像。

1.3.4 qRT-PCR 檢測SdprmRNA 表達情況

Sdpr敲除小鼠及同窩野生型小鼠各3 只,Sdpr轉基因小鼠及同窩野生型小鼠各3 只。 脫頸處理后,TRIzol 法提取肝、脾、胸腺總RNA,利用反轉錄試劑盒獲得cDNA。 根據Sdpr序列信息設計檢測引物 ( 上 海 英 濰 捷 基)Sdpr-sense: 5 ’-CATCCAGAACGACCTCACCAA-3 ’ 和Sdpr-antisense: 5’-GGGAACTGGCTCCTTCACAA-3’。 以βactin為參照基因合成引物β-actin-sense:TGCTGTCCCTGTATGCCTCT 和β-actin-anti-sense:TTGATGTCACGCACGATTTC。 采用SYBR Green 法對不同樣本中的Sdpr基因表達進行分析,計算Ct值,利用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.3.5 Western blot 檢測各組織中SDPR 蛋白表達

取后續繁育的6 月齡雄性Sdpr基因敲除小鼠(Sdpr-/-)及其同窩野生型小鼠(Sdpr+/+)各3 只;6月齡雄性Sdpr基因轉基因小鼠(Sdpr-Tg)及其同窩野生型小鼠(WT)各3 只。 安樂死后取小鼠心、肝、脾、肺、胸腺組織置于含研磨珠的研磨管中,加入RIPA 裂解液,使用OMNI 均質儀研磨后,冰上裂解30 min,12000 r/min 4℃離心20 min 后取上清為組織總蛋白,經BCA 試劑盒濃度測定后調整蛋白濃度。 制備10% PAGE 凝膠,上樣量為每孔30 μg。一抗:SDPR(1 ∶1000)、β-actin(1 ∶2000),4℃孵育過夜。 二抗:山羊抗兔(1 ∶5000),室溫孵育1 h。TBST 洗膜后使用ECL 發光液顯影。

1.3.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色

取6 月齡的Sdpr基因敲除小鼠和其同窩野生型小鼠,Sdpr轉基因小鼠和其同窩野生型小鼠。 取材固定:脫頸后取心、肝、脾、肺、腎等新鮮組織置于10%福爾馬林中固定48 h 以上。 經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片貼片后,進行常規HE染色,封片后于光學顯微鏡下進行組織病理學變化觀察。

1.3.7 免疫細胞流式分析

小鼠眼眶靜脈叢采集外周血100 μL,加入紅細胞裂解液混勻后室溫靜置5 min,離心后加入PBS緩沖液重懸細胞備用。 小鼠脫頸椎法處死,取胸腺、脾置于預冷的PBS 緩沖液中。 用載玻片磨砂端沾取PBS 后將胸腺、脾研磨成細胞懸液備用;取小鼠雙側后肢骨,使用研缽將骨髓壓出,分兩次加入6 mL預冷PBS 緩沖液反復吹打直至骨組織發白。將細胞懸液經300 目尼龍膜過濾后,1500 r/min離心5 min。 加入PBS 重懸細胞,調整細胞濃度后取106個細胞熒光抗體標記。

免疫細胞分析采用如下抗體標記:FITC CD4、PE CD45、 PerCP-cy5.5 CD3、 PE-Cy7 B220、 APC CD8、APC-Cy7 CD11b。 細胞懸液離心后,加入PBS稀釋(1 ∶200)的熒光抗體標記,4℃避光染色30 min,PBS 洗1 次,2500 r/min 離心5 min,200 μL PBS 重懸細胞,經300 目尼龍膜過濾后上機。FlowJo 計算標記陽性細胞比率。

1.4 統計學方法

數據采用GraphPad Prism 8.4.0 和IBM SPSS Statistics 26 進行統計分析,實驗中所有數據均以平均數±標準差(±s)表示。 各組間數據分析采用獨立樣本t檢驗,P<0.05 認為有統計學差異。

2 結果

2.1 Sdpr 基因敲除小鼠和轉基因小鼠的構建

我們利用CRISPR/Cas9 的技術構建了Sdpr基因敲除小鼠,針對Sdpr基因設計了兩個sgRNA 作用靶點,sgRNA 表達載體經線性化形成粘性末端,退火后與pUC57-sgRNA 鏈接(圖1A),測序驗證序列結果正確(圖1B)。 sgRNA 使Cas9 可在sgRNA 作用下識別含有PAM 的序列,實現DNA 雙鏈斷裂。將成功構建的sgRNA 表達載體和Cas9 表達質粒經T7 RNA 聚合酶體外轉錄為可注射的sgRNA 和Cas9 mRNA,混合后注射到小鼠受精卵中,移植入假孕受體ICR 小鼠中,待小鼠出生后與野生型小鼠交配繁殖。 在后續繁育中剪取小鼠尾尖提取DNA 進行基因型鑒定,經PCR 擴增野生條帶為612 bp,敲除條帶為451 bp。 同時在612 bp、451 bp 處有兩條帶,為雜合子小鼠(圖2A)。

注:A:利用CRISPR/Cas9 建立Sdpr 敲除小鼠構建示意圖,在第一外顯子處設計作用靶點,藍色為sgRNA 對應的兩靶點,紅色為PAM 基序,Cas9/sgRNA 介導的基因打靶產生移碼突變,產生Sdpr 缺失的表達載體;B:Sdpr 敲除片段測序結果;C:pUBC-Sdpr 表達載體構建。圖1 Sdpr 敲除及轉基因小鼠建立方案Note. A, Schematic diagram of Sdpr knockout mice with CRISPR/Cas9 technology. The target was designed on the first exon, the blue was the two targets corresponding to sgRNA, whereas the red was the PAM motif. The Cas9/sgRNAmediated gene targeting generates frame-shift mutation resulting in Sdpr-deficient expression vector was established. B,Chromatographs from Sdpr knockout sequences of truncated PCR products. C, Construct of pUBC-Sdpr expression vector.Figure 1 Establishment of Sdpr knockout mice and transgenic mice

同時將Sdpr基因插入過表達質粒UBC 啟動子下游,構建得到Sdpr轉基因過表達載體pUBC-Sdpr(圖1C)。 利用顯微注射將線性化的載體注射到C57BL/6J 小鼠受精卵,移植入假孕受體ICR 小鼠中,待小鼠出生后與野生型小鼠交配獲得Sdpr全身過表達的轉基因小鼠,后續可穩定傳代。 轉基因陽性小鼠DNA 擴增片段經電泳后在445 bp 處可見條帶,野生型C57BL/6J 小鼠在445 bp 處無條帶(圖2B)。

注:A:PCR 鑒定Sdpr 敲除小鼠的基因型;B:PCR 鑒定Sdpr 轉基因小鼠的基因型;M:Marker DL2000(TaKaRa);H2O:水;+/+:野生型對照;+/-:Sdpr 雜合子小鼠對照; -/-:Sdpr 敲除純合小鼠;+:陽性小鼠;WT:野生型小鼠。圖2 Sdpr 敲除及轉基因小鼠的鑒定Note. A, Identify the genotype of Sdpr knockout mice by PCR. B, Identify the genotype of Sdpr transgenic mice by PCR. M, DNA molecular weight marker DL2000 (TaKaRa). H2O,Water. +/+,Wild-type mice. +/-,Sdpr heterozygous mice. -/ -,Sdpr knockout homozygous mice. +,Positive mice.WT, Wild type.Figure 2 Identification of Sdpr knockout mice and transgenic mice

2.2 Sdpr 基因敲除和轉基因小鼠各組織中的表達

通過qRT-PCR 和Western blot 檢測Sdpr在基因敲除小鼠和轉基因小鼠各組織中mRNA 表達水平和蛋白表達水平。結果顯示在肝、胸腺和脾組織中Sdpr基因敲除小鼠mRNA 表達水平顯著低于野生型小鼠(圖3A),在肝、肺、胸腺、脾組織中SDPR 蛋白表達顯著低于野生型小鼠(圖4A、4C);Sdpr轉基因小鼠的肝、胸腺、脾組織的mRNA 相對表達水平高于野生型小鼠(圖3B),在轉基因小鼠的心、肝、胸腺、脾組織中SDPR 蛋白的表達均明顯高于野生型小鼠(圖4B、4D)。

2.3 組織病理學變化

在小鼠飼養繁殖過程中發現Sdpr敲除小鼠和轉基因小鼠在壽命、生殖能力等方面與野生型小鼠沒有明顯差異。

通過在光學顯微鏡下對6 月齡的小鼠進行組織的病理學觀察,發現與野生型小鼠相比,Sdpr敲除小鼠肝細胞出現脂肪變性,多處可見肉芽腫形成,中央靜脈周圍可見明顯髓外造血;肺局部血管周圍炎性細胞浸潤,肺泡間隔增寬;脾紅髓出現髓外造血;骨髓中細胞形態出現變化,淋巴細胞比例減少,粒細胞比例增加;脂肪存在多處炎性細胞浸潤;心臟、腎、胸腺病理未發現異常。

Sdpr轉基因小鼠肝有輕微脂肪變性;小鼠肺中肺泡間隔輕微增寬;脾動脈淋巴鞘周圍淋巴細胞增生,紅髓細胞增多;骨髓中淋巴細胞比例增多,粒細胞比例減少;心臟、腎、胸腺、脂肪未發現病理變化(圖5)。

圖5 Sdpr 敲除及轉基因小鼠主要臟器組織HE 染色Figure 5 Histology of the major organs of Sdpr knockout and transgenic mice(HE staining)

2.4 Sdpr 對免疫細胞的影響

為了解Sdpr對小鼠免疫細胞的影響,我們選取了Sdpr基因敲除小鼠、Sdpr轉基因小鼠與野生型小鼠每組各9 只,分別取外周血、骨髓、脾及胸腺中的免疫細胞進行熒光抗體染色標記后利用流式細胞儀進行分析,檢測免疫細胞的比例。結果顯示與野生型小鼠對照相比,在外周血中Sdpr轉基因小鼠的B 細胞(B220+)比例明顯增加,粒細胞(CD11b+)和T 細胞(CD3+)比例降低(圖6A);在骨髓中Sdpr基因敲除小鼠T 細胞比例降低(圖6B);在脾中Sdpr敲除小鼠、Sdpr轉基因小鼠免疫細胞均沒有明顯變化(圖6C);T 細胞在胸腺中經歷幾個階段發育成熟,結果分析發現在Sdpr基因敲除小鼠胸腺中CD4-CD8-雙陰性細胞增多,CD4+CD8+雙陽性細胞減少。Sdpr轉基因小鼠胸腺CD4+T 細胞顯著增多,CD4+CD8+雙A 陽性細胞減少(圖6D)。 上述結果表明Sdpr基因對小鼠免疫系統有著重要的影響。

3 討論

SDPR 在多種組織細胞中廣泛表達[8],在胞膜窖形成中發揮重要作用[9]。 胞膜窖是脂肪細胞表面大量存在結構域,參與胰島素信號傳導、膜運輸和脂質穩態[16-18]。 因此,caveolin 蛋白和Cavin 蛋白家族的轉錄控制機制對脂肪細胞生物學具有重要意義[4],該領域的研究可能有助于深入了解胰島素抵抗和糖尿病。 在脂代謝的研究中發現,在脂肪生成的過程中,CEBPα(CEBPA)和PPARγ(PPARG)是兩個關鍵轉錄因子,通過相互誘導表達并共同靶向脂肪生成中的關鍵基因[19-20],而Sdpr可在脂肪細胞分化過程中與CEBPα 和PPARγ 平行上調,并且CEBPα 和PPARγ 的激活可誘導原代脂肪細胞及其前體中的SDPR 表達,可能表明了脂肪細胞中CEBPα/PPARγ 介導的Sdpr的重要轉錄控制機制[21]。 近期一項研究利用Cavin-2 KO 小鼠和Cavin-2 敲低的3T3-L1 細胞發現,SDPR 通過結合胰島素受體(IRβ)增強其穩定性并調節胰島素信號傳導,該結果強調了Sdpr在脂肪生成和脂質代謝中的關鍵作用,有助于開發治療病理性肥胖和脂肪生成疾病的新療法[22]。

注:A:基因敲除小鼠肝、胸腺、脾組織中mRNA 相對表達水平;Sdpr+/+:基因敲除野生型小鼠;Sdpr-/-:敲除小鼠;B:轉基因小鼠肝、胸腺、脾組織中mRNA 相對表達水平;WT:轉基因野生型小鼠;Sdpr-Tg:轉基因小鼠。 與基因敲除野生型小鼠相比,?P<0.05,???P<0.001;與轉基因野生型小鼠相比,?P<0.05,??P<0.01。圖3 Real-time PCR 檢測Sdpr 敲除及轉基因小鼠組織中mRNA 表達水平Note. A, Relative level of mRNA expression in liver, thymus and spleen of knockout mice. Sdpr+/+, Knockout wild-type mice. Sdpr-/-, Knockout mice.B, Relative level of mRNA expression in liver, thymus and spleen of transgenic mice. WT, Transgenic wild-type mice. Sdpr-Tg, Transgenic mice.Compared with Sdpr+/+, ?P<0.05,???P<0.001. Compared with WT, ?P<0.05, ??P<0.01.Figure 3 Sdpr mRNA expression level of knockout mice and transgenic mice in different tissues detected by Real-time PCR

注:A:Western blot 檢測SDPR 蛋白在基因敲除小鼠肝、肺、胸腺、脾中的表達;Sdpr+/+:基因敲除野生型小鼠;Sdpr-/-:Sdpr 基因敲除純合小鼠,β-actin 為內參;B:Western blot 檢測SDPR 蛋白在轉基因小鼠心、肝、胸腺、脾中的表達;Sdpr-Tg:Sdpr 轉基因小鼠;WT:轉基因野生型小鼠,β-actin 為內參;C:敲除小鼠各組織蛋白表達灰度分析;D:在轉基因小鼠各組織蛋白表達灰度分析。 與基因敲除野生型小鼠相比,??P<0.01,???P<0.001;與轉基因野生型小鼠相比,???P<0.001。圖4 SDPR 蛋白在敲除及轉基因小鼠各臟器中的蛋白表達Note. A, Expression level of SDPR protein in liver,lung,thymus and spleen of knockout mice detected by Western blot. Sdpr+/+,Knockout wildtype mice. Sdpr-/-, Sdpr knockout homozygous mice, β-actin as internal reference. B, Expression level of SDPR protein in the heart, liver,thymus and spleen of transgenic mice detected by Western blot. WT, Transgenic wild-type mice. Sdpr-Tg, Sdpr transgenic mice, β-actin as internal reference. C, Normalization of protein expression levels in tissues of knockout mice. D, Normalization of protein expression levels in tissues of transgenic mice. Compared with Sdpr+/+, ??P<0.01, ???P<0.001. Compared with WT, ???P<0.001.Figure 4 The SDPR protein expression level of knockout mice and transgenic mice in different tissues

在腫瘤的研究中發現,Sdpr在前列腺癌、乳腺癌和腎癌中表達均是降低的[23]。Sdpr已成為肝癌和胃癌等癌癥的潛在診斷指標[24-26]。 比較基因組分析顯示在PC3 細胞中加入促進細胞存活的細胞因子IL-6、IGF-1 和TGFβ1 后Sdpr的mRNA 水平表達降低,說明Sdpr參與了IL-6、IGF-1 和TGFβ-1 誘導激活的下游信號通路[27]。 在肺癌的研究中發現Sdpr在肺腺癌細胞和組織中的表達下調,且低表達Sdpr與免疫系統抑制之間存在相關性,對其調控機制的研究發現Sdpr與免疫檢查點分子(PD-L1、TNFRSF18、TNFRSF9 和TDO2)之間存在負相關,有可能成為肺癌尤其是非小細胞肺癌(NSCLC)和KRAS 突變肺癌治療及預后的潛在靶點[28]。

本研究通過CRISPR/Cas9 技術和pUBC 過表達質粒及顯微注射技術構建了Sdpr基因敲除小鼠和轉基因小鼠全身過表達小鼠模型,該模型與野生型小鼠在壽命、生殖能力等方面無明顯差異,且可以穩定傳代。 通過在DNA、mRNA、蛋白水平上對該模型進行鑒定,并在組織病理學和免疫細胞比例變化上與野生型C57BL/6J 小鼠進行了比較。

注:A:外周血中B 細胞、粒細胞、T 細胞的比例;B:骨髓中B 細胞、粒細胞、T 細胞的比例;C:脾中B 細胞、粒細胞、T 細胞的比例;D:胸腺中CD4+、CD8+、CD4-CD8-及CD4+CD8+T 細胞的比例。 與基因敲除野生型小鼠相比,?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001。圖6 外周血、骨髓、脾及胸腺中免疫細胞的比例Note. A, Proportion of B(a), myeloid(b) and T cells(c) in peripheral blood. B, Proportion of B(a), myeloid(b) and T cells(c) in bone marrow.C, Proportion of B(a), myeloid(b) and T cells(c) in spleen. D, Proportion of CD4+, CD8+, CD4-CD8- and CD4+CD8+T cells in thymus.Compared with Sdpr+/+, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001.Figure 6 Percentages of immune cells in the peripheral blood, bone marrow, spleen and thymus

研究結果發現,Sdpr基因的缺失導致小鼠長期處于炎癥狀態,在敲除小鼠的肺局部血管周圍及脂肪組織多處出現炎性細胞浸潤,骨髓中細胞形態與比例出現變化,肝、脾可見髓外造血,流式結果顯示敲除小鼠骨髓中T 細胞比例降低;在轉基因小鼠肝細胞有輕微脂肪變性,脾有淋巴細胞增生,紅髓細胞增多;骨髓中淋巴細胞比例增多,粒細胞比例減少,流式結果顯示粒細胞和T 細胞比例降低,B 細胞比例增加,與HE 染色結果一致。 胸腺是小鼠T 細胞發育成熟的場所當來自胎肝或骨髓的T 細胞進入胸腺后,可經歷不同的發育階段。 通過對胸腺組織中免疫細胞進行CD4/CD8 抗體標記,流式分析發現敲除小鼠胸腺中CD4-CD8-雙陰性細胞增多,CD4+CD8+雙陽性細胞減少,證明Sdpr缺失影響胸腺中T 細胞成熟,使T 細胞的發育大量停留在早期;Sdpr轉基因小鼠胸腺CD4+T 細胞增多,CD4+CD8+雙陽性細胞減少,可推斷Sdpr促使雙陽性T 細胞經正負選擇更多分化發育為具有免疫功能的成熟CD4+T 細胞。 因此可推斷Sdpr基因對小鼠免疫系統及胸腺發育過程有著重要的影響。

免疫細胞的調控與造血系統中造血干/祖細胞的發育密不可分,造血干細胞的增殖、分化等過程直接影響到機體免疫系統的調控。 且在研究結果中發現,缺失Sdpr基因的小鼠出現髓外造血的現象,可推測Sdpr基因對血液細胞發育可能存在影響,因此Sdpr基因對造血系統發育的調控仍需進一步研究。 通過本研究建立了血清剝奪反應因子Sdpr基因敲除小鼠和轉基因小鼠模型,為Sdpr在生物學過程中的功能、作用機制的研究提供基礎,同時為胞膜窖及胞膜窖調節蛋白相互作用的研究提供了模型支持。