Apbb1 基因對心肌細胞增殖影響的探究

劉 俊孫 佳劉維靜郝琰琰廉 虹?王玉瑤?

(1.山西醫科大學基礎醫學院 生物化學與分子生物學教研室,太原 030000;2.河北燕達陸道培醫院檢驗科,河北 廊坊 065201;3.中國醫學科學院,北京協和醫學院,國家心血管疾病中心,動物實驗中心, 心血管植入材料臨床前研究評價北京市重點實驗室,北京 102300)

目前,缺血性心臟病是導致人類死亡的首要病因,而心肌梗死是缺血性心臟病產生的主要原因之一[1]。 心肌梗死會導致大量的心肌細胞丟失,丟失的心肌細胞由于心肌細胞本身絕大部分都處于終末分化時期,不能通過剩余的心肌細胞增殖補充[2]。 因此,如何誘導已處于終末分化的心肌細胞增殖對于缺血性心臟病的治療異常重要。

H9c2 心肌細胞是一種大鼠胚胎心臟來源的心肌細胞系,由于其具有與心肌細胞相似的特性,并且經濟易得,所以研究人員經常用其作為研究心臟與心肌細胞相關通路的研究對象。 相較于H9c2 細胞,從小鼠與大鼠體內分離的原代心肌細胞雖然更能代表體內心肌細胞的狀態,但原代心肌細胞分離過程不僅復雜,而且分離后的狀態很難保證。 利用狀態不佳的原代心肌細胞進行研究很有可能會得出不正確的結果與結論。 因此,可以將H9c2 心肌細胞作為心肌細胞增殖研究的實驗對象,用于解析心肌細胞增殖涉及的具體機制。

β 淀粉樣蛋白前體蛋白結合蛋白B-1(APBB1)是一種銜接蛋白,其主要在神經性疾病如阿爾茲海默癥中被研究[3]。 然而,Mahmoud 等[4]發現,在顯著促進心肌細胞增殖的Meis1 敲除小鼠心臟中,Apbb1 mRNA 表達水平顯著降低。 此外,Apbb1 被視為心臟肥大的早期標志物[5],而心臟肥大與心肌細胞肥大相關,心肌細胞肥大相關因子可能參與調控心肌細胞增殖[6]。 但是,Apbb1 是否在心肌細胞增殖過程中發揮一定的生物學功能,從而影響心肌細胞的增殖,目前無相關文獻報道。

因此,本研究通過siRNA 敲低技術與質粒過表達的方式改變了H9c2 心肌細胞中Apbb1 基因的表達量,探究了Apbb1 基因對H9c2 心肌細胞增殖的影響,并利用在線數據庫String 分析了APBB1 蛋白的互作蛋白,發現其互作蛋白KAT5 的轉錄水平與Apbb1 的調控趨勢變化一致。 這可能為解析心肌細胞增殖的機制,促進對心臟再生的理解,以及治療缺血性心臟病提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞

大鼠胚胎心臟來源的H9c2 心肌細胞系購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

Gibico 澳洲胎牛血清與DMEM 高糖基礎培養基均購自美國Gibico 公司,澳洲胎牛血清貨號為10099-141C;lipo3000 轉染試劑、Opotimem-Medium與TRIzol 均購自美國Invitrogen 公司;逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司;CCK8 增殖檢測試劑盒購自博士德生物公司;qPCR 試劑盒購自北京聚合美生物公司;Aurora B 一抗購自Abcam 公司,貨號為Ab239837;PH3 一抗購自美國Millipore 公司,貨號為3377;熒光二抗Alexa Fluor 488 購自美國Invitrogen 公司,貨號為A1108;敲低組使用的非特異性小干擾RNA(NC)與特異性的si-Apbb1 均購自漢恒生物科技(上海)有限公司;過表達組使用的pcDNA3.1+空質粒與攜帶Apbb1 基因的pcDNA3.1+質粒均購自通用生物系統(安徽)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

用含10%血清與含1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養基培養H9c2 心肌細胞,將細胞置于培養條件為37℃,5% CO2的細胞培養箱中進行培養。

1.3.2 siRNA 轉染及分組

取處于對數生長期的H9c2 細胞105個,接種至六孔板中,待其生長至70%左右,準備轉染。 轉染方案確定前,利用帶熒光的FAM siRNA 進行最佳siRNA 轉染濃度的摸索。 具體摸索過程按照siRNA轉染說明書所描述的進行, 固定 lipo3000 與opotimen-Medium 的用量,對說明書推薦的20、50 與100 nmol/L 3 個濃度的siRNA 進行轉染。 最終根據轉染后細胞熒光強弱以及細胞狀態,確定50 nmol/L為最佳siRNA 轉染濃度,50 nmol/L 在六孔板中對應的體積為6.5 μL。 正式轉染時,先分別配置轉染復合物與敲低復合物。 通過6.5 μL lipo3000 與125 μL Opotimem-Medium 培養基配置轉染復合物;6.5 μL siRNA 與125 μL Opotimem-Medium 培養基配置敲低復合物。 兩種混合物配置完成之后,室溫靜置5 min。 靜置完成之后,將兩種混合物混勻,室溫再次靜置10 min,然后再加入培養孔內,開始轉染。 由于lipo3000 對細胞生物毒性較小,可以將轉染處理時長延長至12 h,再將其傳入6 cm 皿中培養36 h,最后利用qPCR 實驗檢測細胞轉染效率。 分組上,將轉染的組別按照所轉染的siRNA 不同分別設為Si-NC組、1Si-Apbb1 組、2Si-Apbb1 組和3Si-Apbb1 組。 Si-NC 組表示為轉染非特異性小干擾RNA 的對照組,1Si-Apbb1 與2Si-Apbb1 以及3Si-Apbb1 組代表轉染從公司購買的3 組特異性針對Apbb1 基因的siRNA序列的組。 上述用到的siRNA 具體序列如下(5’-3’), si-NC 正 向: UUCUCCGAACGAACGUGUC ACGUTT,反向:ACGUGACACGUUCGGAGAATT;1si-Apbb1 正向:CCUACGUAGCUCGAGAUAATT,反向:UUAUCUCGAGCUACGUAGGTT; 2si-Apbb1 正 向:GCUCAAGUGCCACGUGUUUTT,反向:AAACACGUG GCACUUGAGCTT; 3si-Apbb1 正 向: CCCAGCACC AAAGAAUGAATTT,反向:UUCAUUCUUUGGUGCU GGGTT; FAM siRNA 正 向: UUCUCCGAACGUGU CACGUTT,反向:ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

1.3.3 pcDNA3.1+質粒轉染及分組

取處于對數生長期的H9c2 細胞105個,接種至六孔板中,待其生長至70%左右,準備轉染。 轉染時,首先配置轉染復合物與過表達復合物。 配置轉染復合物需要加入2 μL lipo3000 與125 μL Opotimem-Medium 培養基。 配置過表達復合物需要加入1 μg pcDNA3.1+的質粒與2 μL P3000 以及125 μL Opotimem-Medium。 配置完成之后,先分別混勻室溫靜置5 min,然后再將兩種混合物混合在一起,室溫靜置10 min。 最后將混勻好的混合物分別加入相應的培養孔中,開始轉染。 后續轉染過程同siRNA 轉染過程,最終利用qPCR 實驗檢測細胞轉染效率。 根據轉染的質粒不同,將轉染的組別分別設為OE-NC 組與OE-Apbb1 組,OE-NC 組代表轉染pcDNA3.1+空質粒的組,OE-Apbb1 組代表轉染攜帶Apbb1 基因的pcDNA3.1+質粒的組。

1.3.4 利用qPCR 法檢測Apbb1 轉染效率與細胞增殖

轉染完成之后,首先利用TRIzol 提取出RNA,再將RNA 逆轉錄為cDNA,最后完成qPCR 反應。TRIzol 提取RNA 過程按照提取細胞RNA 的方式進行提取,逆轉錄以及qPCR 反應的具體操作、具體條件以及具體參數均按照所用試劑對應的說明書指示進行。 數據統計時,以Gapdh為內參,利用ΔΔCT法定量分析Apbb1 轉染效率與細胞增殖相關基因的表達水平。 上述實驗所用相關引物序列如下(5’-3’):Gapdh正向:CGCCTGGAGAAACCTGCC,反向:GTAGGCCATGAGGTCCACCAC;Apbb1 正向:ACCTA CTACTGGCACATCCC, 反 向: TCCTTCCTCAAAGC CTTCT;Ccnb1 正向:TCCCACACGGAGGAATCTCT,反 向: TCTGCAGACGAGGTAGTCCA;Ki67 正 向:GCAAGAGGCAAATCATCCGAACCC,反向:GAGAAC CTTGCCACTCTTCTGCCC;PCNA正向:GCTGACAT GGGACACTTA,反向:CTCAGGTACAAACTTGGTG;Ccnd1 正向:GAGGAGCAGAAGTGCGAAGA,反向:GGCGGATAGAGTTGTCAGTGTAG;Ccna2 正向:AG CAGGAAGACCAGGAGAAT,反向:GGTGAAGGCAG GCTGTTTA;Kat5 正向: CCTATAGCGCACTCAGCT CC,反向:CGATTATCTCCCCCACCTCC;App正向:CCAACCGTGGCATCCTTTTG, 反 向: GCGTCGACA GGCTCAACTTC;Lrp1 正向:GCGGTGTGACAACGA CAA,反向:AACTGGGTACTGGAGCAGGA。

1.3.5 利用細胞免疫熒光法檢測細胞增殖

取轉染完成后的細胞按照相應組別以每孔5×104個細胞均勻鋪入含爬片的12 孔板孔中,待細胞長至60%~70%左右,利用細胞增殖標志物Aurora B 與PH3 的免疫熒光抗體對細胞進行細胞免疫熒光實驗,以檢測細胞增殖。 實驗具體過程如下:首先利用PBS 清洗細胞3 次,清洗后棄去廢液,再用4%多聚甲醛對細胞進行固定20 min。 固定后,利用含1%的Triton 對細胞進行通透5 min,通透后再利用5% BSA 封閉1 h,封閉后利用一抗進行孵育,4℃過夜。 孵育后利用PBS 清洗3 次洗去多余一抗,接著利用二抗室溫孵育1 h,注意熒光二抗操作時需要避光。 孵育完二抗后,利用PBS 洗3 次洗去多余二抗,然后加入DAPI 染液對細胞核進行染色,染5~10 min。 染核后,用PBS 洗3 次洗去多余DAPI 染液,最后利用防熒光淬滅劑與蓋玻片進行封片。

1.3.6 利用CCK8 法檢測細胞增殖

取轉染完成后的細胞按照相應組別以每孔3×103個細胞每孔均勻鋪入96 孔板中。 鋪的孔數取決于組別與檢測的時間點以及復孔數。 組別主要包括Si-NC、Si-Apbb1、OE-NC 與OE-Apbb1 4 個組別,檢測的時間點主要包括24、48 與72 h 3 個時間點,每個組別的每個時間點設置6 個復孔。 具體實驗過程如下:鋪完細胞后,每隔24 h 往孔中加入無血清DMEM 高糖培養基稀釋的CCK8 試劑,稀釋比例為10 ∶1,每孔加入100 μL。 加完CCK8 試劑后,在培養箱中培養2 h,然后在酶標儀中檢測其在OD450的吸光度值。 數據統計上為避免偏差,對于6個復孔吸光度值的處理方式是去掉一個最高值與一個最低值,然后利用歸一化方法按照組別與時間點進行統計分析。

1.3.7 蛋白互作網絡分析

進入在線數據庫String(https:/ /cn.string-db.org/),輸入目的蛋白與種屬,得到目的蛋白的互作蛋白網絡。 為獲得可信度較高的互作蛋白,將其互作得分設置為最高的可信度0.9。

1.4 統計學方法

采用Graphpad prism 8.02 對結果進行統計分析。 實驗數據采用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用未配對的student’st檢驗與單因素方差分析,P<0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA 最佳轉染濃度確定

為了探究siRNA 最佳轉染濃度,我們分別用20、50 和100 nmol/L 3 個濃度進行H9c2 細胞的轉染,鏡下觀察結果顯示,siRNA 最佳轉染濃度為50 nmol/L,具體見圖1。

注:A:20 nmol/L siRNA 轉染熒光圖;B:50 nmol/L siRNA 轉染轉染熒光圖;C:100 nmol/L siRNA 轉染熒光圖。圖1 siRNA 最佳轉染濃度的篩選Note. A,Fluorescence plot of 20 nmol/L siRNA transfection. B,Fluorescence plot of 50 nmol/L siRNA transfection. C,Fluorescence plot of 100 nmol/L siRNA transfection.Figure 1 Screening for optimal transfection concentration of siRNA

2.2 敲低效率最佳的si-Apbb1 篩選

對從公司獲得的3 組特異性si-Apbb1 進行轉染,篩選敲低效率最佳的si-Apbb1。 qPCR 結果顯示,相較于Si-NC 組,2Si-Apbb1 組的敲低效率最高,Apbb1 mRNA 水平的敲低效率可以達到51%(Si-NC組:(1.01±0.21);2Si-Apbb1 組:(0.49±0.03),P<0.05,n=3)(見圖2),因此,敲低實驗最終選用2si-Apbb1,文章后續提到的Si-Apbb1 組均指利用2si-Apbb1 進行轉染。

注:A:1Si-Apbb1 組的敲低效率;B:2Si-Apbb1 組的敲低效率;C:3Si-Apbb1 組的敲低效率。 與Si-NC 組相比,?P<0.05。圖2 篩選敲低效率最佳的si-Apbb1Note. A,Knockdown efficiency of 1Si-Apbb1 group. B,Knockdown efficiency of 2Si-Apbb1 group. C,Knockdown efficiency of 3Si-Apbb1 group. Compared with Si-NC group,?P<0.05.Figure 2 Screening for Si-Apbb1 with the best knockdown efficiency

2.3 CCK8 實驗檢測Apbb1 對H9c2 心肌細胞增殖的影響

CCK8 細胞增殖實驗中,相較于Si-NC 組,Si-Apbb1 組H9c2 心肌細胞雖然在48 h 時增殖顯著下降0.44 倍(Si-NC 組:(3.06±0.12);Si-Apbb1 組:(2.62±0.16),P<0.01,n=3),但是在72 h 時增殖顯著增加0.86 倍(Si-NC 組:(5.30±0.13);Si-Apbb1 組:(6.16±0.36),P<0.0001,n= 3),見圖3A。 相較于OE-NC 組,OE-Apbb1 組H9c2 心肌細胞在48 h 與72 h 增殖分別降低1.23 倍(OE-NC組:(4.4±0.14);OE-Apbb1 組:(3.17±0.53),P<0.0001,n=3)和1.04 倍(OE-NC 組:(6.04±0.22);OE-Apbb1 組:(5.00±0.27),P<0.0001,n=3),增殖明顯受到抑制,見圖3B。

注:A:利用CCK8 法檢測Si-NC 組與Si-Apbb1 組的增殖情況;B:利用CCK8 法檢測OE-NC 組與OE-Apbb1 組的增殖情況。 與各自的NC 組相比,??P<0.01,????P<0.0001。圖3 CCK8 實驗檢測H9C2 心肌細胞增殖結果Note. A,Proliferation of Si-NC group and Si-Apbb1 group was detected by CCK8 assay. B,Proliferation of Si-NC group and Si-Apbb1 group was detected by CCK8 assay. Compared with their respective NC group,??P<0.01,????P<0.0001.Figure 3 Determination of proliferation of H9C2 cardiomyocytes by CCK8 assay

2.4 qPCR 實驗檢測Apbb1 對細胞增殖的影響

相較于Si-NC 組,Si-Apbb1 組敲低效率達到52%(Si-NC 組:(1.00±0.12);Si-Apbb1 組:(0.48±0.03),P<0.01,n=3);Si-Apbb1 組典型的細胞增殖標志分子Ki67 與PCNAmRNA 表達水平雖然具有升高趨勢,但不具有顯著差異性,然而細胞周期標志分子Ccnb1 與Ccna2 表達顯著增加,Ccnb1 和Ccna2 分別增加80%(Si-NC 組:(1.00±0.05);Si-Apbb1 組:(1.81±0.09),P<0.001,n=3)和76%(Si-NC 組:(1.01 ± 0.22);Si-Apbb1 組:(1.76 ±0.30),P<0.001,P<0.05,n=3),具體見圖4A 與圖4B。 相較于OE-NC 組,OE-Apbb1 組過表達效率達到119 倍(OE-NC 組:(1.00±0.10);OE-Apbb1 組:(119.33±2.64),P<0.001,n=3);OE-Apbb1 組細胞增殖標志分子Ki67 與細胞周期標志分子Ccnb1 與Ccna2 均發生顯著下調,Ki67、Ccnb1 和Ccna2 分別下調25%(OE-NC 組:(1.00±0.03);OE-Apbb1 組:(0.75±0.02),P<0.01,n= 3)、72%(OE-NC 組:(1.00±0.09);OE-Apbb1 組:(0.28±0.03),P<0.001,n=3)和38%(OE-NC 組:(1.00±0.01);OEApbb1 組:(0.62±0.08),P<0.001,n=3),其中另一個增殖標志分子PCNA也呈現下調趨勢,但無統計學意義,具體見圖4C 與圖4D。

注:A:Si-Apbb1 組的敲低效率;B:Si-Apbb1 組的細胞增殖標志物與細胞周期標志物的表達變化;C:OE-Apbb1 組的過表達效率;D:OEApbb1 組細胞增殖標志物與細胞周期標志物的表達變化。 與各自的NC 組相比,??P<0.01,????P<0.0001。圖4 qPCR 實驗檢測Apbb1 對H9C2 心肌細胞增殖標志物與細胞周期標志物表達的影響Note. A, Knockdown efficiency of Si-Apbb1group. B, Expression changes of cell proliferation markers and cell cycle markers in OE-Apbb1 group. C,Overexpression efficiency of OE-Apbb1 group. D, Expression changes of cell proliferation markers and cell cycle markers in OE-Apbb1 group.Compared with their respective NC group,??P<0.01,????P<0.0001.Figure 4 qPCR assay was used to detect the effects of Apbb1 on the expression of proliferation and cell cycle markers in H9C2 cardiomyocytes

2.5 細胞免疫熒光法檢測Apbb1 對細胞增殖的影響

為了進一步確定Apbb1 對H9c2 心肌細胞增殖的影響,我們采用細胞免疫熒光實驗檢測了心肌細胞增殖的標志物Aurora B 與PH3。 相較于Si-NC組,Si-Apbb1 組PH3 與Aurora B 陽性細胞增加4.33%(Si-NC 組:(12.00±1.00)%;Si-Apbb1 組:(16.33±1.52)%,P<0.001,n=3)和4.67%(Si-NC組: (14.67 ± 1.53)%; Si-Apbb1 組: (19.33 ±1.53)%,P<0.001,n=3)(圖5A~5D)。 相較于OENC 組,PH3 與Aurora B 陽性細胞分別降低3.7%(OE-NC 組:(13.00±1.02)%;OE-Apbb1 組:(9.33±0.58)%,P<0.01,n= 3)和4.36%(OE-NC 組:(14.33±1.15)%;OE-Apbb1 組:(9.67±1.52)%,P<0.05,n=3)(圖5E~5H)。

2.6 APBB1 可能通過與KAT5 蛋白互作影響心肌細胞增殖

為了進一步確定Apbb1 調控心肌細胞增殖的機制,我們利用在線數據庫String 分析了與大鼠APBB1 蛋白相互作用的蛋白,發現賴氨酸乙酰轉移酶5(KAT5)、淀粉樣前體蛋白(APP)與淀粉前體樣蛋白(Aplp2)等蛋白可能是APBB1 蛋白的互作蛋白,其中KAT5 與APP 蛋白相互作用最強,具體見圖6。 KAT5 是一種組蛋白乙酰轉移酶,下調KAT5影響前列腺癌細胞、乳腺癌細胞與肝癌等癌細胞增殖[7-9]。 在心肌細胞中,單敲KAT5 能激活心肌細胞細胞周期進而影響心肌細胞增殖[10]。 KAT5 作為APBB1 最為顯著的互作蛋白,APBB1 蛋白可能通過與KAT5 蛋白互作抑制心肌細胞增殖。

2.7 qPCR 實驗探究與細胞增殖相關的APBB1 互作蛋白的mRNA 表達變化

在APBB1 蛋白的5 個互作蛋白中,APP 能夠調控肺腺癌細胞與卵巢癌細胞增殖[11-12];LRP1 能夠調控成纖維細胞與內皮細胞增殖[13-14];KAT5 能夠調控肝癌細胞與甲狀腺癌細胞增殖,并影響心肌細胞周期[10,15-16]。 為了進一步探究APBB1 蛋白能否夠通過與其互作蛋白互作進而影響心肌細胞增殖,我們檢測了敲低與過表達Apbb1 基因對Kat5、App和Lrp1 的mRNA 表達變化的影響。 相較于Si-NC組,Si-Apbb1 組Kat5 mRNA 表達水平顯著降低0.34倍(Si-NC 組:(1.00±0.14);Si-Apbb1 組:(0.66±0.04),P<0.05,n=3),AppmRNA 表達水平顯著上調0.18 倍(Si-NC 組:(1.00±0.02);Si-Apbb1 組:(1.17±0.02),P<0.05,n=3),Lrp1 mRNA 表達水平沒有發生顯著變化,具體見圖7A。 相較于OE-NC組,OE-Apbb1 組Kat5 mRNA 表達水平顯著升高0.72 倍(OE-NC 組:(1.00±0.13);OE-Apbb1 組:(1.72±0.20),P<0.01,n=3),AppmRNA 表達水平顯著下調0.24 倍(OE-NC 組:(1.00±0.10);OEApbb1 組:(0.76 ± 0.05),P< 0.01,n= 3),Lrp1 mRNA 表達水平沒有發生顯著變化,具體見圖7B。Kat5 mRNA 變化趨勢與Apbb1 mRNA 的變化趨勢一致,APBB1 蛋白可能通過與KAT5 蛋白互作抑制心肌細胞增殖。

注:A:Si-Apbb1 組與Si-NC 組的Kat5、App 與Lrp1 的表達情況;B:OE-Apbb1 組與OE-NC 組Kat5、App 與Lrp1 的表達情況。與各自的NC 組相比,?P<0.05,??P<0.01。圖7 qPCR 實驗檢測與細胞增殖相關的APBB1 互作蛋白的mRNA 表達變化Note. A, Expression of Kat5,App and Lrp1 in Si-Apbb1 group and Si-NC group. B,Expression of Kat5,App and Lrp1 in OE-Apbb1 group and OE-NC group. Compared with their respective NC group,?P<0.05, ??P<0.01.Figure 7 qPCR assay was used to detect the mRNA expression of APBB1 interacting protein associated with cell proliferation

3 討論

APBB1 蛋白是一種銜接蛋白,目前主要在神經領域被研究[3]。 基于Apbb1 在再生心臟中發生顯著降低以及其可作為心臟肥大前期的標志物[5-6],我們試圖探究Apbb1 與心肌細胞增殖之間的關系。我們的研究結果表明Apbb1 能夠影響H9c2 心肌細胞增殖,敲低Apbb1 基因促進H9c2 心肌細胞增殖,過表達Apbb1 基因抑制H9c2 心肌細胞增殖。 為了進一步了解Apbb1 如何在機制上調控心肌細胞增殖,我們利用在線數據庫String 分析了APBB1 的互作蛋白,探究APBB1 能否通過互作蛋白影響心肌細胞增殖。 此外,我們還以細胞增殖這個表型入手,查閱了目前Apbb1 與細胞增殖的相關研究,試圖通過了解Apbb1 調控細胞增殖的機制進而明確Apbb1調控H9c2 心肌細胞增殖的具體機制。

目前,關于APBB1 調控細胞增殖的方式主要有3 種可能:第1 種可能是通過調節淀粉樣前體蛋白(APP),APP 是APBB1 的經典下游,在阿爾茨海默癥的發病中發揮關鍵作用[17]。 有研究表明APBB1能通過調節APP 進而影響T-47D 和ZR-75-1 乳腺癌細胞增殖[18]。 第2 種可能是通過調節Notch 信號,Kim 等[19]研究表明APBB1 能夠對Notch 信號進行雙向調控,而Notch 信號是調節脊椎動物與無脊椎動物細胞增殖的關鍵調節器,大量的研究表明Notch 能夠調控心肌細胞增殖[20-23]。 最后一種可能是通過與互作蛋白互作進而影響細胞增殖,Schr?tter 等[24]研究表明APBB1 與BLM 和MCM 蛋白的相互作用可能有助于在受阿爾茨海默病影響的大腦中的神經元細胞重新進入細胞周期。 我們的APBB1 互作蛋白網絡分析結果表明KAT5、APP與APLP2 等蛋白是APBB1 的互作蛋白,在這些互作蛋白中有研究表明KAT5 蛋白能影響心肌細胞增殖[10]。 我們的qPCR 實驗結果表明,App與Apbb1的變化趨勢相反,兩者之間可能存在負反饋調節。在敲低Apbb1 基因誘導心肌細胞增殖時,Kat5 mRNA 表達顯著下調;在過表達Apbb1 基因抑制心肌細胞增殖時,Kat5 mRNA 表達顯著上升。 因此,APBB1 有可能通過與KAT5 互作進而影響心肌細胞增殖。 心肌細胞增殖受Notch 信號與APBB1 蛋白互作蛋白KAT5 調控,那么APBB1 能否通過調控Notch 信號或者與KAT5 互作進而影響心肌細胞增殖呢? 這值得我們下一步進行實驗探究。

對于某些因素對細胞系增殖影響的實驗驗證,CCK8 實驗是目前常用的驗證方式之一。 我們的CCK8 實驗結果表明過表達Apbb1 基因能夠顯著抑制H9c2 心肌細胞增殖,而敲低Apbb1 基因雖然在第48 h 不能表現出促進H9c2 心肌細胞增殖的趨勢,但是在第72 h 能顯著誘導H9c2 心肌細胞增殖。 這表明siRNA 敲低Apbb1 基因后,可能需要經歷較長的時間才能影響H9c2 心肌細胞增殖。

qPCR 實驗中,敲低Apbb1 基因能夠顯著提升Ccnb1 與Ccna2 的表達水平,同時誘導Ki67 與PCNA不顯著升高;而過表達Apbb1 基因能夠誘導Ki67、Ccnb1 與Ccna2 顯著下降,同時誘導PCNA不顯著下降。Ki67 與PCNA作為細胞增殖的典型標志分子,為什么敲低Apbb1 基因能夠誘導H9c2 心肌細胞增殖卻不能誘導這兩個分子同時發生顯著變化呢? 這可能與這兩種標記分子在細胞增殖周期中發揮的作用以及Apbb1 在細胞周期中發揮的作用有關。 一個完整的細胞增殖周期包括G0 期、G1 期、S期、G2 期、M 期。 Ki67 是一種增殖細胞相關的核抗原,其功能與有絲分裂密切相關,主要在有絲分裂期即M 期發揮作用。 PCNA 是一種DNA 聚合酶δ的輔助蛋白,與DNA 合成顯著相關,其表達量與DNA 合成一致,在G0/G1 期細胞中表達無明顯變化,G1 晚期表達大幅度增加,S 期達到高峰,G2/M期明顯下降。 Ccnb1 代表的是G2/M 期轉變的周期蛋白,CCNA2 代表的是控制細胞周期G1/S 和G2/M 過渡階段的周期蛋白。Ki67 與PCNA的表達沒有在敲低Apbb1 基因組與過表達Apbb1 基因組同時發生顯著變化的原因可能在于Apbb1 主要在H9c2心肌細胞的G2/M 期發揮作用,所以PCNA 無論是在敲低與過表達Apbb1 基因組,變化趨勢均不明顯;Ki67 在敲低時可能基于Apbb1 本身的表達水平不高沒有非常顯著的變化,但是過表達119 倍發生顯著變化,顯著影響H9c2 細胞完成G2/M 期的過渡。

總之,本研究證明敲低Apbb1 基因促進心肌細胞增殖,過表達Apbb1 基因抑制心肌細胞增殖,此結論開拓了Apbb1 基因在心臟領域的功能研究,提示Apbb1 有可能成為誘導心肌細胞增殖的潛在靶點。此外,本研究還利用在線網絡數據庫String 預測了APBB1 的互作蛋白,qPCR 探究了其互作蛋白隨Apbb1 干預的變化,推測APBB1 可能通過與KAT5蛋白互作進而影響心肌細胞增殖,為進一步了解Apbb1 基因調控心肌細胞增殖的機制提供了思路。