豨薟通栓膠囊減輕慢性腦缺血大鼠認知功能損傷的機制研究

閆 峰田 悅黃語悠鐘麗媛羅玉敏?

(1.首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究室,北京 100052;2.廣州中醫藥大學科技創新中心,廣州 510405)

缺血性腦血管病已成為威脅我國人民健康的頭號殺手,隨著人口老齡化社會的進入,我國腦血管病的發病率在近幾年快速增長[1]。 其中慢性腦缺血作為一種常見的病理狀態,伴發于血管性癡呆、老年性癡呆等多種神經系統疾病的進程中。 因慢性腦缺血導致的運動、認知、行為能力以及學習記憶等功能障礙的患者人群越來越多,給患者和家人帶來了嚴重的危害,給社會造成了嚴重的負擔。與急性腦缺血相比,慢性腦缺血的治療時間窗更長,早期干預,可以改善臨床預后。 但目前治療慢性腦缺血的藥物較少,亟待開發。

慢性腦缺血發病機制復雜,最新研究表明,血腦屏障(blood brain barriar, BBB)損傷,參與了慢性腦缺血的發生發展[2-3]。 豨薟通栓(xi-xian-tongshuan,XXTS)膠囊由豨薟草等13 味君臣佐使的中藥藥物組方,能夠活血祛瘀、祛風化痰、舒筋通絡、醒腦開竅。 用于缺血性中風風痰痹阻脈絡證引起的半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜,語言蹇澀。 在慢性腦缺血的治療中是否能發揮神經保護作用報道較少。 因此,本研究應用慢性腦缺血大鼠模型研究豨薟通栓膠囊對大鼠慢性腦缺血的作用及對BBB的影響,為后續藥物的適應癥開發提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠(270~300 g,8~10 周齡)21 只,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010],飼養于中國疾病預防控制中心SPF 級動物實驗室[SCXK(京)2019-0050]。 所有動物實驗均遵守3R 原則及首都醫科大學宣武醫院動物倫理委員會相關要求(xw20211117-1)。

1.2 主要試劑與儀器

豨薟通栓膠囊(山西晉新雙鶴藥業有限責任公司,國藥準字z20040065);異氟烷(河北一品制藥股份有限公司,國藥準字H19980141);IgG 熒光抗體(Alexa Flour 488,Life,1 ∶500);一抗(occludin,1 ∶250,Abcam,ab31721;claudin-5,1 ∶500, Santa,sc-28670);二抗(1 ∶2000,中杉金橋);基質金屬蛋白酶ELISA 試劑盒(MMP-9,江蘇酶免實業有限公司,MM-20918R2); 緊密連接蛋白 ELISA 試劑盒(occludin,江蘇酶免實業有限公司MM-70051R2;claudin-5,江蘇酶免實業有限公司,MM-61504R2)。顯微鏡(Nikon,941176);水迷宮(上海科欣電子科技有限公司);酶標儀(Labsystems Multiskan MS,芬蘭)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Sprague-Dawley(SD)大鼠CCH 模型及分組

術前12 h 禁食水。 CCH 模型組制作:5%異氟烷吸入誘導麻醉后取仰臥位固定,2%異氟烷維持麻醉狀態。 頸部備皮后碘伏消毒,沿頸部正中線切開皮膚,鈍性分離筋膜、肌肉組織,充分暴露頸總動脈并小心分離,注意避免損傷迷走神經,用6-0 線結扎右側頸總動脈,縫合傷口。 30 min 后同樣步驟結扎左側頸總動脈。 假手術組找到雙側頸總動脈并與周圍肌肉組織分離而不結扎。 SD 大鼠隨機分組:假手術組(Sham,n=7)、模型組(CCH,n=7)、模型+豨薟通栓膠囊組(CCH+XXTS,n=7)。

1.3.2 給藥方法

大鼠術后第2 天開始灌胃給藥,豨薟通栓膠囊組大鼠給藥劑量為500 mg/(kg·d),假手術組與模型組給予相同體積的蒸餾水,所有大鼠術后持續灌胃42 d。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗

采取Morris 水迷宮方法對大鼠的認知、記憶功能進行評價。 Morris 水迷宮是用來評價大鼠腦缺血后空間學習記憶特征。 本研究在大鼠手術后第37~42 天進行學習訓練,第42 天進行記憶檢測并記錄(具體流程見圖1)。

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental sequence

1.3.4 取材與組織標本留存

所有組織與血液均在第42 天完成水迷宮實驗后當天取得。 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后下腔靜脈采集靜脈血液4 mL,EDTA 抗凝。 離心(3000 r/min,10 min)后,取上清血漿并分裝,-80℃冷藏待后續檢測。 大鼠心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛后取腦組織進行石蠟包埋及切片。

1.3.5 尼氏染色

石蠟切片常規脫蠟后放入1%焦油紫染液中于37℃烤箱中染色30 min,后用蒸餾水小心沖洗腦組織表面染液。 將切片放于95%乙醇溶液中分色后放入新的95%乙醇溶液中脫水2 min。 將切片放入二甲苯溶液中浸泡10 min 后用中性樹脂封片。 顯微鏡下觀察海馬組織神經元變化并選取代表性位置拍照。

1.3.6 IgG 法檢測血腦屏障通透性

大鼠腦組織石蠟切片常規脫蠟后,使用5%BSA+驢血清封閉4℃過夜。 第2 天使用1 ∶200 大鼠IgG 熒光抗體避光孵育24 h。 后使用PBS 常規清洗并用含DAPI 的樹脂封片劑封片。 熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.7 ELISA 檢測血腦屏障相關因子

根據ELISA 說明書操作步驟,檢測血漿中基質金屬蛋白酶和緊密連接蛋白的含量。

1.3.8 Western blot 檢測血腦屏障相關蛋白表達

取大鼠海馬組織放入裂解液中用超聲破碎勻漿后取上清,分光光度計測量蛋白濃度并定量變性后,取20 μg 蛋白上樣電泳、電轉。 將PVDF 膜用5%牛奶封閉1 h 后,加入一抗,4℃冰箱孵育過夜。次日常規洗膜后二抗室溫孵育1 h,常規洗膜后加發光液曝光。

1.4 統計學方法

采用GaphPad Prism8 對實驗數據進行統計學分析。 實驗數據采用平均數±標準誤差(ˉ±sˉx)表示。 實驗數據采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)統計,利用Tukey 進行檢驗分析。P<0.05代表組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠學習記憶能力

由于慢性腦缺血常導致認知功能損傷,因此我們使用Morris 水迷宮對不同處理組大鼠的學習記憶能力進行了檢測。結果顯示,各組大鼠在5 d 的訓練中找到平臺的潛伏期均隨學習次數的增加而下降。 訓練第4 天及第5 天后,Sham 組和CCH+XXTS組找到平臺的潛伏期均顯著低于CCH 組(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001, 圖2A)。 以上結果表明給予豨薟通栓膠囊治療可以明顯改善大鼠慢性腦缺血后學習能力下降的現象。 在撤平臺后對大鼠記憶能力的檢測中發現,CCH 組大鼠的穿越平臺次數、目標象限距離、目標象限時間,較Sham 組均出現明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.001,圖2B)。 給予豨薟通栓治療后,大鼠記憶力改善,CCH+XXTS 組大鼠在目標象限停留時間顯著高于CCH 組。 (P<0.01, 圖2B)。

2.2 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠海馬區神經元損傷

尼氏染色結果顯示,正常對照組大鼠海馬CA1、CA3 區神經元染色可見深藍色尼氏小體,神經元數目較多;慢性腦缺血后大鼠海馬區神經元尼氏小體染色變淡,排列散亂,數量明顯減少,胞體縮小。 給予豨薟通栓膠囊治療后,大鼠海馬區神經元,尼氏小體染色較CCH 組明顯加深,數量增多,海馬CA1、CA3 區神經元損傷得到改善(P<0.05,P<0.01,P<0.01,圖3)。

2.3 豨薟通栓膠囊減少慢性腦缺血后大鼠腦組織IgG 滲出

IgG 分子量較大,在正常情況下其只存在于血管中。 當血腦屏障被破壞后,血管中的IgG 會滲漏到腦組織中。 為了觀察豨薟通栓膠囊對慢性腦缺血大鼠BBB 通透性的影響,我們對腦組織切片IgG 滲漏情況進行了檢測。結果顯示,與對照組相比,慢性腦缺血損傷大鼠腦組織IgG 漏出量明顯增多,給予豨薟通栓膠囊治療后,可以顯著減少大鼠腦組織中IgG 的漏出量(P<0. 05,P<0. 01,圖4)。

注:與Sham 組相比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001;與CCH 組相比,##P<0.01。圖2 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠學習記憶能力(n=7)Note. Compared with Sham group, ?P<0.05, ??P<0.01, ???P<0.001. Compared with CCH group, ##P<0.01.Figure 2 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the learning and memory abilities of CCH rats

注:與Sham 組相比,??P<0.01;與CCH 組相比,#P<0.05,##P<0.01。圖3 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠海馬區神經元損傷(n=3)Note. Compared with Sham group, ??P<0.01. Compared with CCH group,#P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 Xi-xian-tong-shuan capsules reduce the number of Nissl body in hippocampus

2.4 豨薟通栓膠囊減少慢性腦低灌注大鼠血漿MMP-9、occludin、claudin-5 濃度

我們應用ELISA 的方法檢測了Sham 組、CCH 組、CCH+XXTS 組血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 的蛋白濃度。結果顯示與假手術相比,CCH 組血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 濃度顯著高于Sham 組,給予豨薟通栓膠囊可顯著降低慢性腦缺血損傷后血漿中MMP-9、occludin、claudin-5 濃度(P<0. 01,P<0. 001,P<0. 0001,P<0. 0001,圖5)。

2.5 豨薟通栓膠囊增加慢性腦低灌注大鼠腦組織中緊密連接相關蛋白表達的影響

我們應用Western blot 的方法檢測了Sham 組、CCH 組、CCH+XXTS 組腦組織中緊密連接相關蛋白occludin 和claudin-5 的表達情況。結果顯示與Sham 組相比,CCH 組中occludin 和claudin-5 的表達顯著減少,給予豨薟通栓膠囊治療可顯著上調上述緊密連接蛋白的表達(P<0.05,P<0.05,圖6)。

注:與Sham 組相比,???P<0.0001,????P<0.0001;與CCH 組相比,##P<0.01,####P<0.0001。圖5 豨薟通栓膠囊減少慢性腦缺血大鼠血漿MMP-9、occludin、claudin-5 水平(n=7)Note. Compared with Sham group, ???P<0.0001, ????P<0.0001. Compared with CCH group, ##P<0.01, ####P<0.0001.Figure 5 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of MMP-9, occluding and claudin-5 in plasma

注:與Sham 組相比,?P<0.05;與CCH 組相比,#P<0.05。圖6 豨薟通栓膠囊改善慢性腦缺血大鼠腦組織中occludin、claudin-5 水平(n=3)Note. Compared with Sham group, ?P<0.05. Compared with CCH group, #P<0.05.Figure 6 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of occludin and claudin-5 in brain

3 討論

慢性腦血管病與動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病等常見病息息相關,目前的研究發現慢性腦血管病的損傷機制主要包括腦白質損傷、神經炎癥、細胞新生、神經細胞凋亡壞死等,血腦屏障作為中樞神經系統與外周的屏障,其在慢性腦血管病中的作用越來越受到重視[4-6]。 長期腦血管低灌注會導致BBB 受損,通透性增加,腦微血管中水分和血漿蛋白的滲出,進而造成細胞間隙水分的增加,形成血管源性水腫。 我們應用大鼠雙側頸總動脈結扎慢性腦缺血模型,觀察腦慢性缺血后給予豨薟通栓膠囊42 d 后,觀察大鼠學習記憶能力和血腦屏障等情況。 我們發現豨薟通栓膠囊可以明顯改善慢性腦缺血造成的大鼠學習記憶能力下降的現象。 在水迷宮實驗中我們發現,給予豨薟通栓膠囊治療組大鼠在撤平臺后其穿臺次數及目標象限時間均較模型組有明顯改善。 說明了豨薟通栓膠囊對于改善慢性腦缺血后認知記憶功能下降方面的作用。 雖然在目標象限距離指標中豨薟通栓治療組與模型組沒有統計學差異,但由于目標象限時間和游速決定的,部分豨薟通栓治療組組動物在到達其記憶的平臺位置漂浮在水中不再移動,因而產生了此種結果。 在血腦屏障功能檢測中我們發現慢性腦低灌注損傷后大鼠血腦屏障破壞,而豨薟通栓膠囊治療后可顯著改善此情況。 我們通過實驗證實腦組織BBB 破壞后引起毛細血管的通透性增加,可以使正常情況下只存在于血管中的大分子IgG 通過破壞的BBB 進入腦組織,因此測定腦組織中IgG 滲出量可以反映BBB 開放程度[7]。 我們通過對大鼠腦組織中IgG 的熒光染色發現,豨薟通栓膠囊治療可以顯著減少慢性腦低灌注損傷后可腦組織中IgG 的含量。 以上結果提示我們,豨薟通栓膠囊治療可以改善慢性腦低灌注損傷后BBB 的損傷、降低其通透性。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是含有Zn2+的蛋白水解酶家族。 一方面,MMPs 可以降解細胞外基質(ECM),進而使得腦毛細血管的通透性增加,引起水分和血漿蛋白的滲出,形成水腫。 另一方面,MMPs 對基底膜和內皮細胞間的緊密連接的破壞直接導致BBB 損傷,參與多種病理情況下的BBB 的開放[8-11]。 緊密連接相關蛋白在維持BBB 完整性的過程中發揮關鍵的作用,其結構和功能的破壞將引起BBB 通透性增加,甚至腦水腫。 其中claudin-5 和occludin 蛋白是細胞與細胞之間緊密連接完整性最關鍵的成分[12-13]。 研究發現,缺血損傷可以上調腦組織中MMP-9 的表達,與缺血損傷后腦水腫和BBB 開放密切相關,其機制可能與MMP-9 直接降解緊密連接蛋白有關[14]。 因此為了進一步證實豨薟通栓膠囊對慢性腦低灌注損傷后BBB 的保護作用,我們對血液中的MMP-9以及血液和腦組織中的緊密連接相關蛋白的表達進行了測定。 我們發現血液中的claudin-5 和occludin 含量明顯升高,這與臨床研究發現腦血管病人血清中其二者的變化結果相一致[15],且MMP-9的表達量明顯上調。 在腦組織中的緊密連接相關蛋白表達檢測中我們發現緊密連接相關蛋白表達明顯減少。 并且豨薟通栓治療后能夠明顯改善以上結果。 這些研究結果均提示,豨薟通栓膠囊可能通過抑制MMP-9 的表達,減少腦組織中緊密連接相關蛋白claudin-5 和occludin 的降解,最終發揮對BBB 的保護作用。

綜上所述,豨薟通栓膠囊可能通過保護血腦屏障的功能發揮神經保護作用,改善慢性腦缺血后大鼠的認知功能。