內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-線粒體自噬通路在大鼠肺動脈高壓中的作用觀察

武 云閆倩芝王 捷張敏芳王 瑞王世超

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科,烏魯木齊 830054;2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部,烏魯木齊 830054;3.新疆醫(yī)科大學電鏡室,烏魯木齊 830054)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導管測得的肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥25 mmHg 的一組臨床常見病癥,肺血管重構(gòu)是其重要的病理生理過程。 這類患者因長期缺氧導致行動緩慢,稍有活動便呼吸急促,日常生活嚴重受限,病死率高,預后極差。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在肺血管重構(gòu)所致的肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。 本研究前期證實,通過抑制ERS 可以降低PAH 大鼠肺動脈壓力,減輕肺血管重構(gòu)[3]。

ERS 與線粒體自噬的相互作用是引起細胞增殖的機制之一[4-5]。 研究發(fā)現(xiàn),肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖是導致PAH 肺血管重構(gòu)的重要因素之一,線粒體自噬在其中發(fā)揮關鍵性作用[6-7]。 但是,ERS 是否通過線粒體自噬途徑在其中發(fā)揮作用,目前研究較少。 因此,本研究在前期實驗基礎上,利用ERS 抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)干預野百合堿誘導的PAH 大鼠,采用病理染色、電鏡、分子生物學方法觀察肺血管重構(gòu)、PASMCs 細胞線粒體形態(tài)及ERS-線粒體自噬通路相關因子的mRNA水平,為PAH 防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

采用6~8 周健康雄性SPF 級SD 大鼠45 只,體重180~200 g,動物購于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院研究中心實驗動物科學研究部[SCXK(新)2018-0002]),置于新疆醫(yī)科大學鯉魚山校區(qū)實驗動物中心飼養(yǎng)[SYXK(新)2018-0003]。 統(tǒng)一在溫度22℃~25℃,濕度50%~70%,晝夜各半循環(huán)照明飼養(yǎng)4 周后用于研究。 本實驗嚴格遵循美國國立衛(wèi)生研究院所指定的《實驗動物實驗指南》,并嚴格按照3R 原則[8],研究方案通過新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批(IACUC20190416-01)。

1.2 主要試劑與儀器

野百合堿(P19J8F40161,上海源葉生物科技有限公司);4-苯基丁酸鈉鹽(P10083,北京謹明生物科技有限公司);TRIzol 總RNA 提取試劑(UN 7E262I8,美國Invitrogen 公司生產(chǎn));實時熒光定量PCR( quantitative real time PCR,qPCR) 引物合成,primer express 2.0 軟件設計,上海生工生物技術有限公司合成;qPCR 試劑盒(P200601,上海凱杰企業(yè)管理有限公司(Qiagen))。

BL-420F 生物信息采集系統(tǒng)(成都泰盟);病理分析軟件Image J、JSM-6390LV 掃描電鏡(日本電子株式會社);QL-902 渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); Centrifuge 5415D 離心機(Eppendorf);NANODROP 2000 分光光度計(Therno scientific); ABI7500 熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組

將SD 大鼠隨機分為3 組,每組n=15:(1)NC組為正常對照組;(2)PAH 組為野百合堿誘導的PAH 模型組;(3)4-PBA 組為4-PBA 藥物干預組。本研究按照以往實驗采用一次性腹腔注射野百合堿誘導的方法建立PAH 模型[3]。 4-PBA 組為PAH建模同時按照500 mg/(kg·d)劑量給大鼠灌服4-PBA 混懸液,持續(xù)4 周。 NC 組及PAH 組接受同等劑量0.9%氯化鈉溶液灌服,持續(xù)4 周。

1.3.2 血流動力學指標測定

測定方法與前期實驗相同[3]。 測定并記錄平均右心室壓力(mean right ventricular pressure,mRVP)、平均肺動脈壓力(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)。

1.3.3 大鼠肺血管重構(gòu)指標測定

實驗大鼠處死后,從右肺門橫斷面取材,取肺組織2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm 大小,立即置入10%甲醛溶液中進行固定。 后期行HE 染色,用Image J分析軟件測定肺血管重構(gòu)相關病理指標,如肺細小動脈中膜厚度(medial wall thickness,MWT)、血管外徑(external diameter,ED)、管腔面積(vascular lumen area,VA)、管壁面積(vascular wall area,WA)、管總面積(total vascular area,TA),計算肺細小動脈中膜厚度百分比MWT%(MWT%=2×WT/ED),管壁面積/管總面積比例WA%(WA%=WA/TA),管腔面積/管總面積比例VA%(VA%=VA/TA)作為肺小動脈重塑的指標。

1.3.4 大鼠PASMCs 電鏡觀察

實驗大鼠處死后,切取0.5 mm3肺組織,立即投入到0.1 mol/L(pH=7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛中固定2 h(4℃冰箱中)。 采用0.1 mol/L(pH=7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液洗脫后,再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中固定2 h(4℃),脫水后切片,并電鏡下觀察。

1.3.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-線粒體通路關鍵因子mRNA測定

按照參考文獻的方法[9],采用TRIzol 總RNA提取試劑進行樣本RNA 提取,以GAPDH為內(nèi)參。根據(jù)Real-time PCR 反應體系配制反應液。 在PCR反應管中分別加入ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA 模板,并充分混勻。 擴增程序為:95℃10 min,(95℃10 s,58℃30 s, 72℃10 s) ×40 個循環(huán)。 采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析,計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果,目的基因引物合成見表1。

表1 目的基因引物列表Table 1 Primers used in quantitative real-time PCR assays

1.4 統(tǒng)計學方法

血流動力學指標和ESR-線粒體自噬關鍵因子測定中的計量資料以平均數(shù)±標準誤差(±sˉx)表示,肺血管重構(gòu)指標中的計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計處理,統(tǒng)計檢測均基于雙尾。 多組比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗,以α=0.05 為檢驗水準,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血流動力學測定結(jié)果:

均顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(見表2)。

表2 各組大鼠血流動力學指標測定Table 2 Hemodynamic indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠肺血管重構(gòu)病理指標測定結(jié)果

采用野百合堿誘導方法建立大鼠PAH 模型后,肺組織HE 染色可見大鼠肺小動脈管壁增厚、管腔狹窄,血管平滑肌細胞排列紊亂,肺間質(zhì)充血,炎癥細胞浸潤明顯。 經(jīng)過4-PBA 干預后,大鼠肺小動脈管壁變薄,肺間質(zhì)充血減輕(見圖1)。 采用在Image J 軟件測量各組肺血管重塑相關指標,與NC 組相比,PAH 組大鼠MWT%、WA%增高,VA%減少,提示PAH 組大鼠肺動脈管壁增厚、管腔狹窄,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4-PBA 干預后,與PAH組相比,藥物干預組大鼠上述肺血管重塑指標改善,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。 病理檢測指標提示,采用ERS 抑制劑4-PBA 后,PAH 大鼠肺組織肺血管重塑指標得到改善。

圖1 各組大鼠肺組織HE 染色Figure 1 Lung histology examples of rats were stained by hematoxylin-eosin

實驗4 周后,應用生物信息采集系統(tǒng)測定各組大鼠的mPAP 和mRVP。 與NC 組相比,野百合堿誘導的PAH 組大鼠mPAP、mRVP 均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 采用4-PBA 干預后,與PAH 組相比,藥物干預組大鼠mPAP、mRVP

注:與PAH 組相比,?P<0.05。圖2 各組大鼠肺血管重塑指標測定Note. Compared with PAH group, ?P<0.05.Figure 2 Measurement of pulmonary vascular remodeling indexes of rats in each group

2.3 電鏡下各組大鼠PASMCs 線粒體表現(xiàn)

與NC 組相比,野百合堿誘導的PAH 組大鼠PASMCs 線粒體腫脹、線粒體嵴結(jié)構(gòu)破壞,溶解消失,可見線粒體自噬現(xiàn)象增多。 經(jīng)過4-PBA 干預的大鼠PASMCs 中線粒體結(jié)構(gòu)改善,線粒體自噬減少(見圖3)。

2.4 各組大鼠肺組織ERS-線粒體通路關鍵因子mRNA 測定結(jié)果

野百合堿誘導的PAH 組大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關因子PERK、ATF4、Bcl-2、CHOP 的mRNA 表達水平上調(diào)(P<0.001),線粒體融合因子Mfn2 的mRNA 表達水平下調(diào),線粒體分裂因子Drp1 的mRNA 表達上調(diào)(P<0.001),線粒體自噬相關因子Atg12、LC3、p62 的mRNA 表達上調(diào)(P<0.001)。 經(jīng)過4-PBA 干預后,與PAH 組相比,藥物干預組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關因子PERK、ATF4、Bcl-2、CHOP 的mRNA 表達水平下降(P<0.001),線粒體融合因子Mfn2 的mRNA 表達上調(diào),提示線粒體融合增加(P<0.001),線粒體分裂關鍵因子Drp1 的mRNA 減少(P<0.001),線粒體自噬因子Atg12、LC3、p62 的mRNA 表達水平降低(P<0.01)(見圖4)。

注:與PAH 組相比,??P<0.01,???P<0.001。圖4 各組大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-線粒體通路關鍵因子mRNA 測定Note. Compared with PAH group, ??P<0.01,???P<0.001.Figure 4 mRNA determination of key factors of ERS-mitochondrial pathway in lung tissue of rats in each group

注:黃色箭頭:線粒體腫脹、嵴結(jié)構(gòu)紊亂、消失;紅色箭頭:線粒體自噬現(xiàn)象。圖3 各組大鼠PASMCs 線粒體超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)Note. Yellow arrow, Mitochondria are swollen, cristae are disorganized and disappeared. Red arrow, Mitochondrial autophagy.Figure 3 Mitochondrial ultrastructure of pulmonary vascular smooth muscle cells of rats in each group

3 討論

多項研究表明,ERS 是PAH 發(fā)生發(fā)展中的重要病理機制[9-12]。 本研究前期已證實,野百合堿誘導的PAH 大鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵通路PERK、ATF6、IRE1 關鍵因子的的mRNA 及蛋白表達水平均上調(diào),而ERA 抑制劑4-PBA 可有效抑制ERS 關鍵因子,抑制肺血管重構(gòu),降低肺動脈壓力[3],但其具體調(diào)控機制有待進一步研究。

近年來,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體功能紊亂導致肺血管重構(gòu)的機制研究已經(jīng)成為肺動脈高壓領域的研究熱點之一。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間由線粒體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)相連,它是一種對細胞生理環(huán)境高度敏感的動態(tài)結(jié)構(gòu),主要參與調(diào)控ERS、氧化應激、細胞凋亡、細胞自噬、線粒體動態(tài)變化和炎癥等[13]。 研究發(fā)現(xiàn),抑制ERS 可以影響線粒體融合與分裂,從而導致線粒體結(jié)構(gòu)紊亂[14-15]。 線粒體融合蛋白2(mitofusin-2,Mfn2)是一種具有三磷酸鳥苷活性的動力蛋白相關蛋白,其物理結(jié)構(gòu)位于MAM一端,錨定于線粒體外膜,可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Mfn2結(jié)合形成二聚體,連接線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng),主要功能是調(diào)控線粒體外膜融合,但是也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中蛋白激酶 R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶抗原( PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)偶聯(lián)負向調(diào)節(jié)ERS[16]。 McLelland 等[17]發(fā)現(xiàn),通過催化Mfn2 泛素化,可引起線粒體外結(jié)合膜上Mfn2/p97 復合物分離,從而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體結(jié)合膜的破壞及線粒體自噬發(fā)生。 動力蛋白相關蛋白 1 (dynaminrelatedprotein 1, Drp1)是調(diào)節(jié)線粒體分裂的關鍵蛋白,Drp1 可通過形成螺旋寡聚體,包裹線粒體外膜并將其分裂[18]。 Shirakabe 等[19]發(fā)現(xiàn),敲除Drp1,可使線粒體自噬減少。 本研究發(fā)現(xiàn),在PAH 大鼠肺組織Mfn2 的mRNA 表達下調(diào),Drp1 的mRNA 表達上調(diào),采用ERS 抑制劑4-PBA 后,Mfn2 的mRNA 表達上調(diào),Drp1 的mRNA 表達上調(diào),提示線粒體融合增加,分裂減少。 因此,我們推測ERS 與線粒體融合分裂之間的相互作用可能在PAH 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn), 線粒體自噬在增加PASMCs 增殖、抑制細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。在一項低氧PASMCs 模型研究中發(fā)現(xiàn),低氧可激活線粒體自噬引起PASMCs 增殖,其過程與ERS 密切相關[20]。 本研究在電鏡下觀察PAH 大鼠肺組織PASMCs 線粒體形態(tài)變化的時發(fā)現(xiàn),線粒體自噬現(xiàn)象增加,且采用ERS 抑制劑4-PBA 干預后這一現(xiàn)象明顯減少。 進一步檢測線粒體自噬相關因子LC3、Atg12、p62 的mRNA 表達水平,發(fā)現(xiàn)這些信號分子的mRNA 表達均減低。 研究發(fā)現(xiàn),LC3 是參與自噬的重要蛋白。 在自噬中以LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式存在,LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以反映自噬水平的高低。 在自噬發(fā)生過程中,LC3Ⅰ與磷酯酰乙醇胺結(jié)合后形成LC3Ⅱ。 選擇性自噬受體p62 蛋白通過與LC3Ⅱ特異性結(jié)合將泛素化的蛋白聚集體或者其它細胞組分募集到自噬小體中,然后在自噬溶酶體內(nèi)降解,在低氧或炎癥誘導的動物肺動脈高壓模型中發(fā)揮作用[21]。 Atg12 是一種泛素樣蛋白,在自噬通路中起著關鍵作用,是自噬小體形成必不可少的因子[22]。 基于此,我們推測4-PBA 抑制ERS 可能通過干擾線粒體融合與分裂,減少線粒體自噬從而達到保護PASMCs、抑制肺血管重構(gòu)的作用(見圖5)。

圖5 4-PBA 抑制PASMC 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-線粒體自噬的信號通路和作用的假設模型Figure 5 A hypothetical model for the signaling pathway and the role of 4-PBA-inhibited ERS-mitochondrial in PASMC

本研究在ERS-線粒體自噬通路在PAH 發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用方面僅僅做了初步的探索,存在一定的局限性。 首先,p62、Atg12、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ等線粒體自噬相關信號分子在蛋白和mRNA 水平的表達與調(diào)控分子機制仍有待進一步驗證和研究。 其次,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體作為細胞中重要的兩個細胞器,兩者間的相互作用對PASMCs 過度增殖導致肺動脈狹窄誘發(fā)PAH 的具體機制仍有待探索。 此外,需要開展深入的分子生物學研究和大規(guī)模的臨床驗證研究來進一步探索和驗證ERS-線粒體自噬通路中的關鍵因子,以期開發(fā)出以抑制PASMCs 過度增殖為治療靶點的新型靶向治療藥物。