人臍帶間充質干細胞治療小鼠急性肺損傷的安全性及有效性研究

陳千晴別亞男陳柏羽許佳歡歐寶芳謝水林吳少瑜?

(1.南方醫科大學藥學院,廣州 510515;2.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院,廣州 511436;3.華南理工大學生物科學與工程學院,廣州 510006)

新型冠狀病毒(COVID-19)感染引起的全球疫情使急性肺損傷(acute lung injury, ALI)再次受到大眾的關注[1]。 ALI 發病急驟、病死率高,死亡率在在34.9%~46.1%之間[2]。 多種原因可引起急性肺損傷,如吸入性肺炎[3]、肺挫傷、多次輸血、膿毒血癥等[4]。 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可誘導炎癥反應,模擬膿毒血癥引起的ALI[5]。 ALI 發病機制較為復雜,免疫調節反應是最為關鍵的因素[6]。

間充質干細胞是一種具有自我更新、多向分化、免疫調控等特點的多潛能組織干細胞[7],可通過強大的抗炎[8]和免疫調節[9]功能減少肺部炎細胞浸潤[10],抑制炎癥因子分泌,從而減輕肺損傷。干細胞主要通過旁分泌功能(包括細胞因子、生長因子以及外泌體等)與巨噬細胞、T 細胞、NK 細胞等接觸發揮免疫調控作用。 研究表明,干細胞條件培養基霧化給藥可治療小鼠肺炎[11],為ALI 提供了新的治療選擇。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級成年健康新西蘭兔1 只,雄性,6 月齡,體重2.5~2.7 kg,由南方醫科大學實驗動物中心提供[SCXK(粵)2021-0041]。 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠82 只,6 ~ 8 周齡,體重18 ~ 22 g。 SPF 級BALB/c-nu 雌性小鼠27 只,15~21 d,體重18~20 g。 均購自珠海百試通生物科技有限公司[SCXK(粵)2020-0051]。 實驗動物均飼養于廣州華騰生物醫藥科技有限公司[SYXK(粵)2020-0237],小鼠飼養條件符合SPF 級要求。 環境溫度維持在20℃~24℃,濕度維持在40%~70%,明暗比為12 h/12 h,動物可自由飲水及攝食。 實驗及研究過程給予動物人道主義關懷,遵循“3R 原則”,研究方案經廣州華騰生物醫藥科技有限公司實驗動物倫理委員會(HTSW210211、HTSW210516)審查通過。

1.1.2 細胞

人臍帶間充質干細胞購自廣州塞萊拉干細胞科技股份有限公司,編號為Y2023QD01141;Hela 細胞購自廣州輝園苑醫藥科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(L861706, 麥克林); DMEM/F-12(Gibco,C11330500BT);EDTA(Gibco,25200-056);

氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司);蘇木素(美國Sigma 公司);伊紅染液(天津光復精細化工有限公司);瑞氏-姬姆薩復合染液(索萊寶,G1020)。 生物顯微鏡(舜宇光學科技(集團)有限公司);組織切片機(RM2245,德國徠卡Leica 公司);霧化儀(魚躍,M104 網式霧化器);電子精密天平(倍爾BEL)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HUC-MSCs 的準備

HUC-MSCs 培養于含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養基中,隔天換液,2~3 d 傳代1 次。 待細胞傳代至P6 代,培養48 h 后收集貼壁細胞上清液,在4℃條件下以3000 r/min 離心15 min 去除細胞碎片。 收集離心后上清用于霧化治療組。 使用0.05%含EDTA 胰酶消化收集細胞,用于尾靜脈注射治療組。

1.3.2 HUC-MSCs 致瘤性實驗

27 只BALB/c-nu 雌性小鼠隨機分成3 組:陰性對照組(等體積生理鹽水)、陽性對照組(1×106個Hela 細胞)、HUC-MSCs 組(1×107個HUC-MSCs 細胞[12]),每組9 只,各組均采用皮下注射給藥。 每周觀察2 次體重、瘤體大小、是否成瘤,持續觀察1 個月。 按照公式V=π×ab2/6(V:體積,a:腫瘤長徑,b:腫瘤短徑)計算腫瘤體積。

1.3.3 體外溶血實驗

將實驗分為3 組:陰性對照組、陽性對照組、HUC-MSCs 組,每組設置3 個平行對照。 取新鮮兔血脫纖處理,分別加入2.5 mL 生理鹽水、純凈水、HUC-MSCs(1×106cells)。 混勻每組血液樣本后靜置于37℃水浴鍋中,3 h 后觀察血樣樣本是否有溶血和凝集現象。

1.3.4 HUC-MSCs 的急性毒性實驗

(1)40 只C57BL/6 雄性小鼠隨機分為4 組:3 個不同劑量的受試細胞組、對照組,每組10 只小鼠。 (2)給藥方案:受試細胞組分別尾靜脈注射4×105、8×105、1×106個人臍帶間充質干細胞,對照組尾靜脈注射滅菌生理鹽水,各組給藥總體積0.2 mL。 (3)觀察:注射后4 h 觀察小鼠毒性反應,包括小鼠攝食量、體重變化等指標,記錄小鼠死亡情況,此后連續觀察記錄28 d。

1.3.5 急性肺損傷(ALI)模型構建及評分

12 只C57BL/6 雄性小鼠隨機分為3 組:對照組、滴鼻組、腹腔注射組,每組4 只,分別使用LPS(10 mg/kg)緩慢滴鼻或腹腔注射構建模型。

各組肺組織HE 染色后采用McGuigan 評分法[13]判定急性肺損傷程度,評分根據:(1)肺泡壁增厚或透明膜形成;(2)肺泡充血;(3)血管壁或肺泡腔炎性細胞浸潤;(4)出血。 每組隨機抽取5 個視野對以上4 個評分根據進行急性肺損傷半定量檢測評分分析。

1.3.6 HUC-MSCs 治療小鼠急性肺損傷

30 只C57BL/6 雄性小鼠隨機分為5 組:對照組、模型組、尾靜脈注射治療組、霧化對照組、霧化治療組,每組6 只。 小鼠選用LPS(10 mg/kg)腹腔注射造模,6 h 后給予HUC-MSCs 尾靜脈注射治療(MSCs-IOCV,5×107cells/kg)。 實驗收集HUCMSCs 條件培養基用于霧化治療組(CM-atomization,2 mL)給藥,霧化對照組小鼠使用同劑量空白培養基霧化給藥。

1.3.7 BALF 炎癥細胞分類計數

LPS 造模后96 h,分離暴露支氣管,注射器吸取1 mL PBS 插入右主支氣管灌洗肺部,重復3 次,回收率80%以上。 將肺泡灌洗液在4℃條件下以1500 r/min 離心10 min,去除上清,加入100 μL PBS 重懸。 取10 μL 重懸液于載玻片上涂抹展開,風干5~10 min,固定15 min,使用瑞氏-姬姆薩染色法染色。鏡下選取3 個視野進行炎癥細胞分類計數。

1.4 統計學方法

應用IBM SPSS 25.0 進行實驗數據分析,使用GraphPad Prism 9 軟件作圖。 計量資料用平均數±標準差(±s)表示,使用重復測量方差分析、單因素方差分析進行組間差異分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗。 以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種給藥方式導致的急性肺損傷程度比較

肺組織HE 染色顯示滴鼻組小鼠肺泡壁厚度均勻,肺泡未見炎性滲出物,血管附近有少量炎性細胞浸潤。 腹腔注射組小鼠肺泡壁增厚,伴炎性細胞浸潤,多處支氣管及血管周圍淋巴細胞灶性浸潤,并見淋巴小結形成,偶見支氣管內出血(圖1A)。

McGuigan 評分結果顯示,腹腔注射組評分與對照組相比顯著升高(P<0.01),肺損傷程度對比滴鼻組明顯加重(P<0.05)(圖1B)。

2.2 人臍帶間充質干細胞致瘤性實驗

小鼠皮下注射HUC-MSCs 后持續觀察28 d,注射部位未見腫瘤形成,與陰性對照組結果一致,無致瘤性(圖2A)。 陽性對照組小鼠皮下注射Hela 細胞后10 d 觀察到腫瘤形成,并逐漸增大(圖2B),成瘤率100%,小鼠腫瘤平均直徑不超過20 mm,生長不超過原體重10%。

2.3 致瘤性實驗小鼠組織病理切片

觀察期結束后,解剖各組小鼠臟器并進行HE染色(圖3A)。 HUC-MSCs 組、陰性對照組各臟器病理學檢查均未發現異常。 陽性對照組小鼠脾白髓數量減少,淋巴細胞減少,紅髓大量髓外造血細胞增生,伴有多量中性粒細胞浸潤;肺泡壁增厚,伴有較多中性粒細胞浸潤。 腫瘤細胞密集排列,胞核異型性低,核質比大,胞漿呈嗜堿性,多見核分裂像(圖3B)。

2.4 人臍帶間充質干細胞的急性毒性實驗

各組小鼠尾靜脈注射給藥后均未出現死亡,記錄給藥后28 d 小鼠體重及攝食。 各組小鼠體重均正常增長(圖4A),攝食正常(圖4B),差異無統計學意義。

對各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎進行病理學檢查,HE 染色結果顯示各臟器組織未見壞死或炎癥反應(圖4C)。 以上結果顯示,尾靜脈注射人臍帶間充質干細胞(4×105~1×106cells)不會引起急性毒性反應。

2.5 人臍帶間充質干細胞的體外溶血實驗

在3 h 內陽性對照組有明顯溶血現象,HUCMSCs 組、陰性對照組上層澄清透明,下層細胞沉淀較多,無溶血現象發生(圖5A)。 各組血液樣本重懸后于顯微鏡下觀察,陽性對照組紅細胞破裂,紅細胞數明顯減少,HUC-MSCs 組、陰性對照組無溶血和致紅細胞凝集作用(圖5B)。

2.6 人臍帶間充質干細胞治療急性肺損傷的有效性評價

各治療組肺組織HE 染色結果顯示,HUC-MSCs尾靜脈注射治療后可見炎癥緩解,肺泡壁無增厚(圖6A),肺損傷評分明顯下降(圖6C)。 HUCMSCs 條件培養基霧化治療后小鼠肺泡壁仍可見少量炎性細胞散在浸潤,肺泡壁未見明顯增厚,損傷評分介于模型組和尾靜脈注射治療組(MSCs-IOCV組)之間(圖6C)。 霧化對照組肺組織可見彌漫性肺間質增厚,肺泡腔縮小。

采用瑞氏-姬姆薩染色法觀察各組BALF(圖6B)的炎性細胞總數和分類計數,尾靜脈注射治療組巨噬細胞數明顯高于模型組(圖6D),霧化治療組巨噬細胞數介于兩組之間。

注:A:肺組織HE 染色;B:肺損傷McGuigan 評分。 與同期相應組別比,?P<0.05,??P<0.01,nsP>0.05。圖1 脂多糖誘導的肺病理改變及McGuigan 評分結果(n=5)Note. A, HE staining of lung tissue. B, McGuigan score for lung injury. Compared with corresponding groups in the same period, ?P<0.05, ??P<0.01, nsP>0.05.Figure 1 Lipopolysaccharide induced lung pathological changes and McGuigan score results

注:A:接種28 d 后腫瘤的大體圖;B:平均腫瘤體積。 與同期相應組別比,???P<0.001。圖2 人臍帶間充質干細胞體內致瘤性研究Note. A, Macroscopic images of tumor 28 days post-inoculation. B,Average tumor volume. Compared with corresponding groups in the same period, ???P<0.001.Figure 2 Tumorigenicity of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vivo

注:A:致瘤性實驗小鼠各臟器HE 染色;B:陽性對照組小鼠腫瘤HE 染色。圖3 致瘤性實驗小鼠組織HE 染色Note. A, HE staining of organs in tumorigenic experimental mice. B, HE staining of tumors in mice in the positive control group.Figure 3 HE staining of tumorigenic experimental mouse tissues

注:A:小鼠體重-時間曲線;B:小鼠攝食-時間曲線;C:小鼠各臟器HE 染色。 與同期相應組別比,nsP>0.05。圖4 人臍帶間充質干細胞尾靜脈注射的急性毒性實驗Note. A, Body weight of mice were measured once per week. B,Total amount of food intake were measured once per week.C, HE staining of various organs in mice. Compared with corresponding groups in the same period, nsP>0.05.Figure 4 Acute toxicity of HUC-MSCs injected into tail vein of mice

注:A:體外溶血實驗肉眼觀察;B:體外溶血實驗光鏡觀察結果。圖5 人臍帶間充質干細胞體外溶血實驗Note. A, Visualizing of hemolysis experiment in vitro. B, Observation results of hemolysis test in vitro under light microscope.Figure 5 Hemolysis experiment of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro

注:A:肺組織HE 染色;B:BALF 瑞氏-姬姆薩染色;C:肺損傷McGuigan 評分(n=5);D:BALF 巨噬細胞數(n=3)。 與同期相應組別比,?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001,nsP>0.05。圖6 人臍帶間充質干細胞治療急性肺損傷的有效性評價Note. A, HE staining of lung tissue. B, BALF Wright-Giemsa staining. C, McGuigan score for lung injury (n=5). D, Number of BALF macrophages (n=3). Compared with corresponding groups in the same period, ?P<0.05,??P<0.01,???P<0.001,nsP>0.05.Figure 6 Efficacy of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of acute lung injury

3 討論

急性肺損傷(ALI)是呼吸系統常見的危重癥之一[14],其發展與炎癥相關,關鍵因素是抗炎因子/促炎因子水平失衡,伴隨著促炎因子的大量釋放[15],進一步發展可引發急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress, ARDS)甚至死亡[16]。 臨床上可選擇的治療方法較為局限,仍停留在支持治療的層面。

本研究采用滴鼻[17]或腹腔注射LPS[18]給藥法構建急性肺損傷模型,通過肺組織病理McGuigan 評分對比兩種造模方式的優劣。 病理結果顯示,兩種造模方法均出現一定程度的肺損傷,滴鼻給藥模型損傷部位主要集中在主支氣管,肺內分布不均,組內差異較大,重復性較差。 且造成的肺損傷程度較輕,偶見血管周圍少量炎細胞浸潤;腹腔注射給藥實驗結果與Nie 等[19]一致,LPS 均勻分布于小鼠肺部,肺泡壁明顯增厚,伴大量炎細胞浸潤,肺損傷程度更嚴重,重復性好。

隨后我們評估HUC-MSCs 治療ALI 的安全性[20]及有效性[21]。 安全性實驗結果顯示:HUCMSCs 對兔紅細胞無溶血反應;裸鼠皮下注射HUCMSCs 無致瘤性;臨床安全劑量下[22](4×105~1×106cells/kg)尾靜脈注射HUC-MSCs 28 d 后不會引起急性毒性反應,無動物死亡;且病理結果顯示HUCMSCs 靜脈注射后多臟器未見明顯異常。 這提示通過標準化的質檢評估,本批次獲得的HUC-MSCs 應用于動物治療有較高的安全性。 有效性結果顯示:尾靜脈單次注射5×107cells/kg HUC-MSCs 后ALI小鼠的肺泡損傷減輕,McGuigan 評分降低,肺組織炎細胞明顯減少。 這表明間充質干細胞是ALI 的一種有效的治療方法。 研究表明,間充質干細胞可通過外泌體誘導肺泡Ⅱ型細胞再生[23]、防止肺毛細血管內皮細胞凋亡、抑制免疫細胞的浸潤[24],促進空氣-肺泡屏障修復、抑制細菌生長,從而降低ARDS的嚴重程度,避免發展成ARDS[25]。

為了進一步評估HUC-MSCs 旁分泌功能[26]在ALI 中的治療作用,本研究采用HUC-MSCs 條件培養基霧化給藥[27]方式替代干細胞治療。結果表明:使用HUC-MSCs 條件培養基單次霧化治療ALI 小鼠能緩解小鼠肺部炎癥反應。 但由于HUC-MSCs 條件培養基中外泌體含量較少,霧化治療組McGuigan評分介于模型組與尾靜脈注射治療組之間。 進一步分析各組肺泡灌洗液炎癥細胞群,發現兩個治療組中巨噬細胞數明顯增加,這表明巨噬細胞在MSCs治療急性肺損傷的進程中發揮關鍵作用。

綜上,腹腔注射LPS 構建的急性肺損傷模型操作簡單穩定,重復性高,造成的肺損傷效果較好。兩種治療方式均能緩解小鼠肺部炎癥,其中尾靜脈注射組效果明顯優于霧化治療組,可有效降低急性肺損傷小鼠McGuigan 評分。