蛋白酶抑制因子對大鼠帕金森病造模條件探討

胡玉英韋曉蕓宋 曦鐘 潔劉永輝羅榮卿

(1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,南寧 530022;2.廣西中醫藥大學,南寧 530007)

帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)是一種緩慢進展的神經退行性疾病,病理變化集中表現為黑質致密部(compacta of the substantianigra,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神經元變性,其導致黑質紋狀體通路缺失和紋狀體內DA 水平降低。 動物模型的建立為研究PD 的病因以及發病機制提供了新的思路,因此人們根據PD 的病理特點制作了不同的動物模型。關于遺傳性和散發性疾病泛素-蛋白酶體系統的最新研究結果表明[1],蛋白酶抑制劑是誘導PD 的候選毒素。 其中蛋白酶抑制因子PSI(proteasome inhibitors I,PSI)誘導的動物模型非常接近地概括PD 的關鍵特征[2],可能對研究疾病的發病機制和神經保護治療有價值。 本研究通過對模型大鼠行為學及TH、α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)表達的測定,以期構建一個可用數據評估的慢性PD 模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30 只SPF 級SD 大鼠,鼠齡3~4 月,體重為250~280 g,雌鼠,購自長沙市天勤生物技術有限公司[SCXK(湘)2014-0011]。 飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料(由實驗動物中心提供)及自由飲水,恒定濕度,室溫(23±2)℃。 動物實驗經廣西中醫藥大學倫理委員會審查,符合實驗動物倫理學要求(DW20201011-099),并按規定執行,實驗環境為廣西中醫藥大學動物實驗中心屏障環境動物實驗室[SYXK(桂)2019-0001]。 按照實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

PSI(Z-lle-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al)(生產廠家:美國ApexBio 公司;批號A1900);浸蠟脫蠟透明液(批號:200801)、蘇木精染液(批號:191202)、伊紅染色液(批號:200901)(生產廠家:南昌雨露實驗器材有限公司);anti-α-syn antibody(生產廠家:索萊寶;型號:K101295P)、anti-TH antibody(生產廠家wanleibio;型號:WL01820);HRP 標記山羊抗兔(生產廠家:Servicebio;型號:GB23303)、高效RIPA 組織/細胞裂解液(生產廠家:Solarbio;型號:R0010)、蛋白酶抑制劑混合液(100 ×PIC) (生產廠家:Solarbio;型號:P6730);PBS 緩沖液(生產廠家Servicebio;型號:G0002)。 R0010 型賽默飛世爾脫水機(英國賽默飛公司Excelsior AS);萊卡組織切片機(型號:2235)、萊卡組織攤片機(型號:HI1210)、萊卡組織烤片機(生產廠家:上海萊卡);低溫離心機(生產廠家:Eppendorf 公;型號:5418R);多功能酶標儀(美國MD FilterMax F3);Mini Trans-Blot Cell蛋白轉印模塊(濕轉)(Bio-Rad);凝膠成像系統(生產廠家:上海天能;型號:Tanon 5200);顯微鏡(生產廠家:Nikon;型號:E100)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備

隨機分為對照組10 只,PSI 模型組A 組和模型組B 組各10 只。 參照McNaught 等[3]及劉雨清等[4]皮下注射PSI 制作PD 慢性大鼠模型溶解方法:取PSI 粉劑5 mg,加入100% DMSO 溶液875 μL快速攪拌溶解,最后加入蒸餾水375 μL,配制成PSI溶液(濃度為70%),以75 μL/100 g(3 mg/kg),150 μL/100 g(6 mg/kg)進行頸背部皮下注射。 PSI模型組A、模型組B 大鼠分別給予皮下注入PSI 3 mg/kg、6 mg/kg,對照組給予70% DMSO 3 mg/kg皮下注射,分別于每周一、三、五進行大鼠頸背部皮下注射,連續給藥2 周,共給藥6 次。

1.3.2 行為學實驗

實驗過程中注意觀察大鼠的自主行為變化,包括有無活動遲緩、少食少動、震顫、尾巴僵直、嗅探及易激惹等異常行為。 行為學檢測前對大鼠進行訓練1 周,分別于注射前1 d 及注射后第14、21、28天進行記錄。

(1)爬桿實驗 以大鼠爬竿實驗考察大鼠行為變化,參照Zhang 等[5]的爬桿實驗。 用一直徑為1 cm,長50 cm 的木桿,頂端固定有一直徑2.5 cm的軟木小球,木桿上纏上紗布防滑,傾斜45°放置,大鼠頭向下放置在軟木小球的頂部,使其沿桿自然爬下,觀察大鼠在下行過程中的行為及時間,對其進行評分。 同時觀察爬行過程的行為。 每只測5次,每次隔3 min。 評分標準:0 分,大鼠從桿上一次順利下,爬桿時間<4.00 s;1 分,大鼠停頓數次后能爬下,爬桿時間為4.01~8.00 s;2 分,大鼠緩慢爬行伴輕微震顫,爬桿時間為8.01~12.00 s;3 分,大鼠掉落,頻繁性震顫,四肢僵直或爬桿時間>12.00 s。

(2)懸掛實驗 參照Tao 等[6]設計的爬桿實驗進行改良,1 個直徑為1.5 mm 的不銹鋼棒,水平放置于兩支架間,兩支架底座距離為20 cm,高度為30 cm,在橫桿上方1 cm 處添加玻璃蓋,下方鋪布料防摔傷。 被測大鼠倒置懸掛于不銹鋼棒中點后放開大鼠。 評分標準:0 分,大鼠雙后爪均可抓住不銹鋼棒;1 分,僅有一只后爪可抓住不銹鋼棒;2 分,大鼠跌落,雙后爪均抓不住不銹鋼棒。

1.3.3 組織樣本及切片制備

行為學實驗結束后,將實驗大鼠麻醉后打開胸腔,并經心內快速推注生理鹽水50 mL,每組選取5只大鼠黑質部分,放置-80℃冰箱保存備用,用于后續Western blot 檢測。 剩余各組5 只大鼠在灌注完生理鹽水后,再緩慢推注100 mL 4%多聚甲醛,打開顱骨取材,用4%多聚甲醛進行固定保護24 h,用于進行HE 染色檢測及免疫組化檢測。

1.3.4 組織病理學觀察

腦組織經脫水,經石蠟包埋后進行切片,厚度為3 μm,撈片,65℃烤片過夜,進行常規HE 染色,光鏡觀察。

1.3.5 Western blot 檢測大鼠黑質區TH、DA 能神經元、α-syn 的表達

黑質組織稱取20~40 mg,做好標記,加入裂解液200~400 μL,用移液器吹打裂解,轉至EP 管,可用勻漿機勻漿至無明顯的粘稠狀勻漿,-20℃保存,電泳分離,恒流轉膜90 min,室溫下于封閉液中孵育3 h。 將膜置于一抗稀釋液中,4℃孵育12 h,用TBST 洗膜(3×15 min);加入相應1 ∶4000 比例稀釋的二抗中,37℃孵育1 h,PBS 洗滌(3×5 min),ECL顯色,應用凝膠成像系統進行分析。

1.3.6 免疫組化檢測大鼠黑質區TH、DA 能神經元、α-syn 的陽性表達

石蠟切片,經乙醇梯度脫水,用EDTA(PH=9.0)抗原修復,冷卻后PBS 洗滌(3×5 min);放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,PBS 洗滌(3×5 min);在組化圈內滴加3% BSA 均勻覆蓋組織,室溫封閉30 min;滴加一抗工作液,4℃過夜。 添入二抗工作液,室溫孵育50 min;PBS 洗滌(3×5 min)。DAB 溶液顯色,陽性顯色為棕黃色,自來水終止反應。 在顯微鏡下觀察結果,拍片。 圖像分析軟件采用Image J 1.8.0,每張切片拍攝不同視野3 個,最后計算TH 陽性細胞數目。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20. 0 統計軟件,所有數據均采用平均數±標準差(xˉ±s)表示。 采集3 次測量數據并取平均值進行統計,用t檢驗對組間差異比較分析,P<0.05 為有統計學意義。 使用Image J 1.8.0 軟件對TH 陽性細胞進行數目統計,總數進行分析。

2 結果

2.1 皮下注射PSI 導致大鼠出現PD 樣癥狀

注射PSI 后第14、21、28 天,通過觀察大鼠有無活動遲緩、震顫、抓握、嗅探等異常行為,評估大鼠行為學改變情況。結果顯示:第14 天,PD 模型組兩組大鼠于第2 周皮下注射后均出現間斷性細小的震顫、豎毛、嗅探、弓背;第21 天,PD 模型組兩組大鼠均出現程度各異的震顫,癥狀持續10~20 min 后逐漸輕但仍有反復發作,且有毛發變黃,活動減少,動作變慢等變化;第28 天,PD 模型組兩組大鼠出現步態蹣跚、活動減少、動作遲緩等癥狀,模型組B 大鼠部分出現肢體麻痹,顫抖并且無法站立,與模型組A組相比較,上述行為學癥狀明顯加重;上述行為學于對照組未出現變化。

2.2 爬桿實驗

首次注射PSI 前24 h(即實驗前24 h)監測大鼠爬桿行為并作出評分,而后將模型A、B 組評分與對照組作對比,無明顯統計學差異(P>0.05)。 注射PSI 第14、21、28 天觀察模型組兩組大鼠爬桿行為,其評分明顯升高,與對照組相比,差異顯著(P<0.05)。 實驗第21、28 天模型組B 評分較模型組A顯著升高,兩組差異顯著(P<0.05)。 見表1。

表1 各組爬桿實驗評分比較(±s)Table 1 Pole test scores of each group were compared

表1 各組爬桿實驗評分比較(±s)Table 1 Pole test scores of each group were compared

注:與對照組相比,?P<0.05;與模型組A 相比,#P<0.05。Note. Compared with Control group,?P<0.05. Compared with Model group A,#P<0.05.

組別Groups注射前Before the injection注射后第2 周2 weeks after injection注射后第3 周3 weeks after injection注射后第4 周4 weeks after injection對照組Control group模型組A Model group A模型組B Model group B 6.25±3.55 6.33±2.77 6.31±2.73 6.69±2.17 5.79±1.87 10.37±5.78?15.76±7.13?21.70±7.61?#6.06±0.95 12.17±5.22?21.80±8.05?44.40±8.05?#

2.3 懸掛實驗

對照組大鼠懸掛實驗評分相對穩定,PSI 模型組隨著時間的延長,評分逐漸降低,第14~21 天緩慢降低,第28 天急劇降低(P<0.05),且模型組B 評分較模型組A 顯著降低(P<0.05)。 見表2。

表2 各組懸掛實驗評分比較(±s)Table 2 Traction test scores of each group were compared

表2 各組懸掛實驗評分比較(±s)Table 2 Traction test scores of each group were compared

注:與對照組相比,?P<0.05;與模型組A 相比,#P<0.05。Note. Compared with Control group,?P<0.05. Compared with Model group A,#P<0.05.

組別Groups注射前Before the injection注射后第2 周2 weeks after injection注射后第3 周3 weeks after injection注射后第4 周4 weeks after injection對照組Control group模型組Model group A模型組Model group B 2.53±0.39 2.53±0.42 2.37±0.43 2.33±0.45 2.60±0.47 2.10±0.65?1.93±0.63?1.33±0.38?#2.57±0.45 2.07±0.60?1.37±0.55?0.53±0.53?#

2.4 HE 染色

顯微鏡下觀察HE 染色切片,結果顯示對照組大鼠SNc 神經元數量豐富,胞體較大,多為圓形、橢圓形,胞漿染色較淡,核仁清楚。 與對照組相比,模型組A 細胞形態有改變,部分神經元胞體深染,膠質細胞增生(膠質細胞的細胞形態為核小、深染,呈扁圓形或三角形),說明大鼠神經元損傷;模型組B模型組細胞變形,鏡下觀察核仁不明顯,同時伴隨有深染物增多,與模型組A 比較程度加重。 見圖1。

圖1 各組大鼠黑質區HE 染色Figure 1 HE staining in rat melanoregion of each groups

2.5 Western blot 法檢測大鼠黑質區TH 和α-突觸核蛋白表達

與對照組比較,模型組兩組大鼠黑質區TH 表達減少及α-syn 表達增加(P<0.05),其中模型組B的TH 表達顯著低于模型組A(P<0.05),模型組B的α-syn 表達增加高于模型組A(P<0.05)。 見圖2。

2.6 免疫組化染色檢測大鼠黑質區TH 和α-突觸核蛋白陽性表達

免疫組化染色方法觀察各組TH 陽性細胞數目的變化,研究結果表明:對照組TH 陽性細胞數目為(39.33±17.92)個、模型組A TH 陽性細胞數目為(22.00±2.65)個、模型組B TH 陽性細胞數目為(16.17±3.82)個、與對照組相比,模型組兩組大鼠黑質區TH 表達顯著降低(P<0.05),模型組B 低于模型組A(P<0.05),說明兩組模型組大鼠TH 陽性神經元顯著丟失。 見圖3。

圖3 腦黑質中TH 陽性表達Figure 3 TH positive expression in the substantia nigra

注:與對照組相比,?P<0.05;與模型組A 相比,#P<0.05。圖2 大鼠黑質區TH 和α-突觸核蛋白比較Note. Compared with control group, ?P<0.05. Compared with model group A, #P<0.05.Figure 2 Comparison of TH and α-syn in substantia nigra of mice

3 討論

PD 動物模型制備方法多種多樣,尚未有統一定論,各種動物模型都有各自的優點與不足[7]。 6-OHDA 模型不能模擬人類PD 的所有病理和臨床特征,它在保存非DA 能神經元的情況下誘導DA 能神經元死亡,但不會形成胞漿內含物(路易小體)[8]。 6-OHDA 不影響與PD 有關的其他腦區,如前嗅覺結構、低位腦干區或藍斑[9-10]。 MPTP 模型多為急性或亞急性模型,病理局限于黑質紋狀體系統,該模型也顯示TH 神經元丟失,但未見典型的路易小體[11-12]。 魚藤酮誘導大鼠黑質神經細胞變性并形成包涵體,但這種化合物也引起更廣泛的變性,涉及紋狀體和小腦神經元,這種模式在PD 中并不典型[13]。 給小鼠使用除草劑百草枯以及聯合使用百草枯和殺菌劑會導致黑質中多巴胺能神經元的丟失,但百草枯不會即刻越過血腦屏障[14]。 百草枯、魚藤酮的模型會導致很高的死亡率,因為它們具有很高的全身毒性[15-16]。

研究表明PD 患者死后黑質組織中泛素-蛋白酶體途徑存在結構和功能缺陷[17]。 這些基本發現激發了基于蛋白酶體抑制劑的新一代動物模型的發展,該模型利用蛋白酶體抑制劑來擾亂蛋白質穩態,產生進行性黑質DA 能細胞丟失、路易小體形成和行為障礙[18-19],由于該模型能夠觸發內源性蛋白(如突觸核蛋白)的聚集,導致神經毒性,從而復制了PD 的中心致病途徑之一,因此引起了研究界的關注。

蛋白酶體抑制劑誘導的PD 模型比以前描述的毒素引起的疾病模型有幾個優點,McNaught 等[20]通過研究表明,該模型在治療停止后數周緩慢進展,一旦啟動,神經退化過程可能是自我維持的。其次,蛋白酶體抑制劑誘導的神經變性不限于黑質紋狀體系統,還包括其他結構,如藍斑、迷走神經背側運動核和梅納德氏基底核,這些結構也與PD 有關。 蛋白酶體抑制大鼠的SNc 神經元,且大鼠的藍斑和迷走神經背側運動核中形成了路易體樣包涵體。 因此,蛋白酶體抑制劑誘導的PD 大鼠模型比其他模型更能概括人類PD 的疾病特征,我們也可以推測環境中類似的毒素可能會導致或促進易感人群的疾病發展。

本研究通過皮下注射PSI 的方式,作用于SD 大鼠誘導PD 動物模型。 已有研究證實,PD 運動癥狀的產生與相關基底神經節活動失調及黑質DA 能神經元丟失關系密切[21]。 相關病理結果證明聚集性α-syn 是PD 的重要標志,異常高表達的α-syn 能夠引起PD[22]。 TH 是合成DA 的限速酶,在大腦黑質中含量較高,TH 表達的減少使得DA 合成受限是導致PD 的主要原因;因此,TH 是PD 發病機制的關鍵點。 例如,α-syn 不僅通過抑制TH 的Ser40 磷酸化來抑制TH,而且還通過刺激蛋白磷酸酶2A 活性來抑制TH,從而減少DA 合成并導致PD。 因此,對黑質內α-syn 以及TH 表達水平進行檢測,可推出DA能神經元的數量及位置,據此可明確PSI 所誘導PD模型的嚴重程度[23]。

從本次實驗看,隨著注射完成后時間的延長,模型組兩組大鼠爬竿時間逐漸延長,懸掛時間逐漸縮短,2 周后逐漸出現行動遲緩、下頜不自主震顫、豎毛、尾僵直等癥狀。 造模3 周后的大鼠協調運動能力降低更為明顯,活動減少,動作變慢;造模4 周后模型組B 大鼠多出現的步履蹣跚、甚至握桿不能。 上述表現均表明:PSI 皮下注射可造成大鼠的PD 樣癥狀,模型組大鼠肢體協調能力、肌力、動作靈敏度等運動功能較對照組均明顯下降,與模型組A 比較,模型組B 下降顯著,表明增大PSI 劑量后,爬桿實驗評分也隨之增高,懸掛實驗評分縮短。 從HE 染色和Western blot 檢測結果分析,給藥4 周后,模型組A 較對照組病理學顯示TH 表達明顯降低、α-syn 的表達顯著增加,成功建立了符合行為學及病理學特征的PD 大鼠模型,而注射6 mg/kg 的模型組B 大鼠狀態低下,與對照組相比,病理結果顯示TH 陽性細胞顯著減少,α-syn 高表達(P<0.05),因此可以選擇隔天皮下注射3 mg/kg,作為PD 慢性模型的一般標準。 這一研究結果與McNaught等[3]、劉雨清等[4]采用PSI(3 mg/kg)皮下注射,連續2 周造模的研究結果相似。 McNaught 等[3]以1.5、3.0、6.0 或12.0 mg/kg 的劑量給大鼠注射溶于70%乙醇的PSI,并在PD 分級量表上僅觀察到1.5和3.0 mg/kg 劑量的PSI 顯著的行為效應(惡化)。而關于皮下注射PSI 的劑量可引起進行性運動障礙和黑質DA 能細胞丟失,這是有爭議的,因為其他人沒有復制這些發現,Bové 等[24]在嚙齒類動物全身應用PSI 3.0、6.0 mg/kg 均不能誘導產生任何行為或病理學改變。 Bukhatwa 等[25]從未能夠達到McNaught 報道的效應程度,實驗采取PSI 劑量為8、12 和16 mg/kg 皮下注射誘導PD 模型,與對照組相比,大鼠黑質中中TH 陽性細胞的數量減少,但隨著PSI 劑量的增加,TH 陽性細胞的損失變得不那么明顯,只有在8 mg/kg 時才有統計學意義,同時發現神經元的丟失隨著PSI 劑量的增加而減少。

PSI 具有誘導大鼠產生PD 典型特征的作用,多項研究在重復McNaught 等[3]實驗方法時也得到相同結果,但仍有部分實驗室在嚴格按照McNaught等[3]實驗方法進行實驗時得到相反結果[24-25],為驗證此方法的可靠性,本次實驗重復了McNaught等[3,20]研究,結果發現,PSI 誘導的PD 模型大鼠在3 mg/kg 劑量組上造模是成功的,在此基礎上,本研究增加了行為學實驗爬桿實驗以及懸掛實驗,進行整合行為學評分與形態學表現關聯分析,以形態學結果為判定標準,在證實PSI 具有誘導大鼠產生PD典型特征作用的同時進一步分析了PSI 誘導PD 動物模型導致的PD 癥狀的嚴重程度。 鑒于樣本量限制,本次我們僅采用3、6 mg/kg 作為模型組,未來本課題組將擴大進行PSI 劑量對比實驗研究,同時目前也缺乏關于PSI 的藥代動力學曲線和劑量與效果之間關系的數據,后續有必要對PSI 進行全面的藥代動力學分析,這將有助于確定為什么很難在實驗室之間觀察到PSI 的一致影響的一些原因。

綜上所述,本研究發現在皮下注射PSI 誘導的大鼠PD 模型中,很好地概括了PD 的關鍵特征,同時黑質中細胞形態存在改變、TH 表達降低,α-syn過表達,且本次增加采用懸掛及爬桿實驗作為大鼠行為學表現的統計和評價,將行為學和形態學數據相互印證,這對PD 的發病機制、病理學與神經遞質變化的研究以及治療方法和效果的改善可能產生積極的影響。