類風濕性關節炎藥理實驗模型的研究進展

陸丹丹韓曉燕張 晗李 霖?房士明?

(1.天津中醫藥大學,方劑學教育部重點實驗室,天津 301617;2.天津中醫藥大學,中藥學院 天津 301617)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜炎癥為基本病理改變的自身免疫病,中醫認為“風、寒、濕三氣雜至,合而為痹”,并根據疾病特點將RA 歸屬于“痹癥”“尪痹”等范疇,在《內經》、《素問·痹論篇》等書中均有記載[1]。 據統計,RA 影響全球約0.1%~2.0%的人口,在中國類風濕關節炎的患病率約為0.42%,其中心血管合并癥患病率為1.5%[2-3]。 類風濕性關節炎臨床表現為手腕等小關節對稱性、持續性活動受限且疼痛腫脹,發病與氣候、遺傳、免疫及腸道菌群失衡具有相關性[4]。

現代研究認為RA 發病過程主要包括炎性細胞浸潤滑膜,造成滑膜增生并在滑膜腔中形成血管翳,最終使關節軟骨和骨質破壞[5]。 大量文獻研究表明類風濕關節炎與免疫T 細胞及B 細胞亞群的聚集、促炎因子、趨化因子活化和表達等相關,但其深入確切的發病機理尚不完全明確[6]。 中醫認為RA 病機復雜,多與濕、熱、瘀血等證緊密聯系[7]。

本文根據現代醫學理論和傳統中醫辨證論治原則,從類風濕關節炎發病機制出發,分析幾種關節炎實驗模型,同時綜述腸道菌群與RA 的關系,希望能為類風濕研究選擇合適的模型提供參考。

1 誘導性RA 動物模型

在誘導模型中,非特異性免疫激活,軟骨定向自身免疫或大量的外源、感染性誘因會引起類似RA 樣疾病,目前使用較多的該模型有膠原誘導關節炎、佐劑性關節炎模型。

1.1 膠原誘導的關節炎( collagen-induced arthritis, CIA)模型

CIA 是主動免疫誘導RA 的經典模型。 Ⅱ型膠原(collagen Ⅱ, CⅡ)乳劑制備方法是在4℃條件下將Ⅱ型膠原溶于乙酸,滅活卡介苗置于液體石蠟中配成弗氏完全佐劑(complete freund’ s adjuvant,CFA)。 將二者等體積混合乳化至滴水不溶狀態,制成CII 乳劑[8]。

小鼠(例如DBA/1J 品系)造模方法是將50 μL含2 mg/mL 牛Ⅱ型膠原的CII 乳劑在尾根部皮內注射誘發關節炎,于18 d 后用含有弗氏不完全佐劑(incomplete freund’s adjuvant, IFA)的CII 乳劑同法注射加強免疫[9]。 小鼠CIA 模型病變情況可由關節腫脹度測量,關節炎評分和關節病理變化確定[10]。 小鼠關節腫脹度和關節炎評分增加,關節組織中出現炎性細胞浸潤、滑膜增厚等可提示造模成功[11]。 此模型可用于RA 新藥物預防、治療作用檢測和細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α)等治療靶點的檢測[12]。 有研究發現DBA/1 小鼠中CIA 的嚴重程度和發病率可以通過CII 與CFA,IFA 和LPS的組合變化來控制,結果顯示使用LPS 可以增加關節炎嚴重程度[13]。

大鼠CIA 模型的制備方法是在距離大鼠尾根部4 cm 處皮下注射CII 乳劑(1 mg/mL)200 μL,注射后按壓針孔防止乳液流出,于7 d 后采用同樣方法在距離尾根2 cm 處皮下注射CII 乳劑100 μL。若大鼠炎癥評分、關節腫脹度均顯著增高,痛域顯著降低則提示造模成功[14]。 CIA 所致關節炎可探究Th17/Treg(輔助性T 細胞/調節性T 細胞)失衡在RA 中的作用,但模型在疾病的發生率、同步性和分布方面存在個體差異[15]。 國外學者借助CIA 大鼠模型,通過顯微計算機斷層掃描技術(microcomputed tomography, Micro-CT)、骨組織學檢查評估骨密度,定量ELISA 分析肌腱組織中促炎因子(TNF-α、 IL-23) 的 方 法, 得 出 英 夫 利 昔 單 抗(infliximab)可以預防關節炎相關的骨質疏松癥,抑制其肌腱損傷的結論[16]。

1.2 佐劑性關節炎(adjuvant arthritis, AA)模型

AA 大鼠發病原理是誘導后的大鼠會產生針對于熱休克蛋白65(heat shock protein 65, HSP65)的T 細胞和抗體反應[17]。 常選用Lewis 大鼠建立AA模型,對大鼠尾根部或足墊皮內注射0.1 mL 含有熱滅活分枝桿菌(10 mg/mL)的CFA[18]。 模型制備成功的標志是大鼠自造模兩周左右開始發病,炎癥以踝關節為重,并累及全足,第18 天左右達到炎癥高峰;在關節炎癥發展過程中同時伴有毛色暗淡、易脫毛和體重減輕等表現[19]。 在大多數情況下,AA關節炎的腫脹程度不對稱,其中一只足關節的發炎程度高于對側[20]。 AA 操作方法簡單,具有明顯的細胞免疫異常特征,缺乏慢性病過程[21]。 Bao 等[22]利用AA 模型,蛋白質印跡和免疫組化等分析方法確定JAK/STAT 和NF-κB 信號通路中蛋白質的表達和磷酸化水平,發現芫花素(genkwanin)能夠抑制AA 大鼠滑膜組織中JAK/STAT 和NF-κB 信號通路的激活。

1.3 蛋白多糖誘導的關節炎(proteoglycaninduced arthritis, PGIA)模型

在關節滑液中注射蛋白多糖抗原引發T 細胞慢性依賴性自身免疫反應,導致慢性炎癥、關節破壞和軸骨受累[23]。 Horváth 等[24]選取8~12 周齡的雌性BALB/c 小鼠,將PG 核心蛋白乳化劑每隔3 周對小鼠3 次腹腔注射來完成造模。 整個實驗周期較為緩慢,約需17 周完成。 小鼠初期以急性炎性水腫和滑膜炎為特征,隨后表現為骨和軟骨吸收,最后進展為廣泛的關節強直。 此造模方法的局限所在是人類軟骨必須經過廣泛的加工才能制備所需的蛋白多糖組分。 Liu 等[25]用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)阻滯劑對PGIA 中腸道菌群進行干預影響發現抗TNF-α 療法減緩了PGIA進程,起到調節腸道菌群和腸屏障功能的作用。

1.4 鏈球菌細胞壁誘導的關節炎(streptococcal cell wall-induced arthritis, SCWA)模型

鏈球菌產生一種具有較高炎癥活性的肽聚糖多糖(peptidoglycan-polysaccharide, PG-PS),可以誘導易感大小鼠形成關節炎[26]。方法是在第0、7、14和21 天,向右后足關節內注射包含細胞壁肽聚糖多糖片段的混懸液誘發單側慢性關節炎,在第8、15 和22 天再次關節內注射激活致發炎。 第1 天和第2天為急性非T 細胞依賴期,第23~28 天為慢性T 細胞依賴期[27]。 此模型有助于研究關節炎的急性反應,但這類動物模型使用頻率較低,可能是因為其使用成本和操作要求較高[28]。 Jain 等[29]利用SCWA 模型研究姜黃素- 雙氯芬酸共軛物(curcumin-diclofenac conjugate, CDC)體外抗炎活性,發現其顯著減輕了SCWA 模型的關節炎癥狀。

1.5 降植烷誘導的關節炎(proteoglycan-induced arthritis, PIA)模型

降植烷是一種非免疫原性化學物質,在DA(Dark-Agouti)大鼠尾部單次皮下注射300 μL 降植烷純品,于50 d 后再次同法注射以誘發關節炎,每隔1 周進行如上常規檢測,大鼠出現足容積增加、關節活動障礙等表現提示造模成功[30]。 該炎癥為T細胞依賴型,主要用來藥物驗證,也可用于分析類風濕關節炎發病相關的性別差異情況。 有研究指出大鼠關節炎PIA 模型可用于模擬RA 中的血管功能障礙和脂質受損情況[31]。

1.6 抗原誘導的關節炎( antigen-induced arthritis, AIA)模型

此模型建立原理是甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin, m-BSA)與免疫球蛋白G Fc 段受體(Fcγ R)結合,從而有效激活針對m-BSA 的T 細胞應答。 造模過程是將100 μg m-BSA在CFA 中1 ∶1 乳化對小鼠進行免疫,每隔1 周在頸部進行兩次皮下注射m-BSA/CFA 作為加強劑量,于3 周后通過關節內注射10 μg/μL m-BSA生理鹽水混懸液誘發關節炎[32]。 AIA 模型的特征是明顯的T 細胞受累且不影響對側關節。 Frey等[33]借助AIA 模型分析成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synovial cells, FLS)對慢性關節炎致病作用的分子機制,結果表明從AIA 急性期的小鼠中分離出的FLS 能夠在受體中誘發炎癥和關節破壞。

1.7 葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose 6-phosphate isomerase, G6PI)誘導的關節炎模型

該模型建立的發病機制是G6PI 能夠在體內產生抗體,通過誘導免疫活性細胞產生細胞因子(如TNF-α、IL-1β),從而誘發關節炎。 造模方法是將400 μg 重組人G6PI 在完全弗氏佐劑中1 ∶1 乳化,并將該乳劑皮下注射于小鼠體內進行免疫[34]。 基于免疫前Treg 細胞的耗竭將自限性關節炎轉變為具有明顯骨破壞的不緩解性關節炎理論,有學者利用G6PI 誘導的關節炎模型進行研究發現感覺神經元的分子標志物轉錄激活因子3 (activating transcription factor 3, ATF-3)上調對感覺神經元有早期性和持續性影響[35]。

2 自發性基因修飾RA 動物模型

該模型建立基礎是小鼠在經過一定的基因修飾后可以自發形成關節炎,該模型有利于了解類似于人類RA 的慢性病過程。

2.1 K/BxN 小鼠模型

將來自轉基因K/BxN 小鼠中含有G6PI 致病性自身抗體的血清注射到C57BL/6 幼鼠誘發RA[36]。K/BxN 血清誘導的關節炎模型制備:將雄性KRN鼠與雌性NOD 鼠合籠飼養,所生的第一代小鼠即為K/BxN 小鼠。 采集2~6 月齡K/BxN 小鼠靜脈血清。 將不同K/BxN 小鼠的血清混合后分別在第0天和第2 天尾靜脈注射至8 周齡C57BL/6 小鼠以制備K/BxN 小鼠模型。 小鼠踝關節腫脹程度嚴重,且HE 染色顯示關節腔隙變窄、炎癥細胞浸潤則提示造模成功[37]。 此模型的特點是在廣泛應變背景下誘導,且關節炎發病迅速,發病率100 %,可用于研究干擾素等治療RA 的相關機制。 Bopp 等[38]首次在K/BxN 小鼠模型中描述了顳下頜關節(temporomandibular joint, TMJ)損壞,得出了侵蝕性變化主要發生在關節軟骨的淺表部分,進而導致TMJ 軟骨纖維層消失的結論。

2.2 人TNF 基因(the human tumor necrosis factor gene, HTNFG)小鼠模型

通過構建人類TNF 轉基因小鼠,表現出人類TNF 基因表達的失調模式進而發展為慢性炎性多關節炎。方法是將含有3’端修飾后的完整人類TNF 基因的片段整合到CBA 與C57B1/6 雜交第2代小鼠受精卵內,待小鼠3~4 周齡時可觀察到踝關節腫脹,繼而9~10 周腿部運動障礙發展為完全喪失后腿的運動能力。 不同于AA、CIA 模型,TNF-α轉基因小鼠能自發性出現關節炎,與人RA 的關節破壞更為相似[39]。 有學者使用該模型來確定RA炎癥進展是否受到RANKL(receptor activator of NF-κB ligand, NF-κB 配體的受體激活劑)的基因失活或過表達的影響,發現RANKL 不僅可以作為破骨細胞生成和骨吸收的介質,而且可以作為影響炎癥和免疫激活的疾病調節劑來調節關節炎[40]。

2.3 SKG 小鼠模型

SKG 小鼠是一種BALB/c 小鼠,其編碼70×103zeta 相關蛋白(ZAP-70)Src同源2 結構域的基因發生突變,進而形成慢性自身免疫性關節炎[41]。方法是將溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS pH=7.2~7.4)溶液的甘露聚糖腹腔注射于16 周齡SKG 雌性小鼠誘發關節炎。 通過組織病理學評分發現,滑膜細胞多層次增生,關節腔內有單核細胞和中性粒細胞浸潤、血管緊張素形成和富含營養的粒細胞滲出表明造模成功[42]。 Jeong 等[43]為評估酵母聚糖誘導的SKG 小鼠的臨床和分子特征,利用酵母聚糖誘導的SKG 小鼠模型來反映人脊柱關節炎(spondyloarthritis, SpA)的復雜特征。

3 中醫癥候RA 動物模型

在RA 疾病動物模型的基礎上,施加風寒濕、風濕熱等外部刺激建立病證結合的RA 動物模型,或直接在痹癥理論基礎上建立中醫動物模型以探究RA 病因病機。

3.1 AA 模型基礎上的風寒濕痹模型

朱興旺[44]通過實驗表明風寒濕環境可能加重關節滑膜缺氧, 刺激缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)表達,造成RA 滑膜細胞和新生血管生成,從而產生或加重RA 滑膜病變。 造模方法是在造模的第0 天,每只大鼠左后足跖皮內注射0.1 mL CFA,造模7 d 后再注射0.1 mL 加強免疫,建立AA 大鼠模型,并將大鼠置于5~7℃冷水中,水深2 cm,伴以3 檔風力,每日1 次,每次20 min,連續14 d。 大鼠右后足墊致炎后腫脹明顯,致炎后關節炎指數評分顯著升高,提示造模成功[45]。

3.2 AA 模型基礎上的風濕熱痹模型

該模型建立的理論基礎是風濕熱環境可能使HSP 大量分泌,部分HSP 被瓜氨酸化進而激活免疫系統產生抗瓜氨酸抗體,從而激活或加重炎癥[44]。除將大鼠置于36℃~38℃熱水中,其余條件及結果觀察同上述風寒濕痹模型。

3.3 風、濕、寒、熱誘導的關節炎模型(wind-damp-

cold-heat induced arthritis,WDCH)

造模方法是將大鼠的后足分別在45℃和4℃的恒定溫度下放入水中10 min,然后在20℃的溫度下用風吹動大鼠10 min,每天2 次,共14 d。 通過血細胞分析、脾和胸腺系數、自身抗體和血清細胞因子變化對其進行評估。 大鼠滑膜中TNF-α 和血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)表達水平升高,可表明關節炎和血管生成的發生,提示WDCH 的變化可能是RA發病的關鍵因素[46]。 模型的主要特點是通過外界壓力來感染疾病,模擬自然環境變化。 該模型具有客觀性,建模時間短,自身抗體表達水平極高和明顯的組織病理學改變等優點。

4 潛在新型類風濕實驗模型建立

近年來,有學者發現類風濕性關節炎作為一種粘膜疾病,有3 個部位與其有關,即肺、口腔粘膜和胃腸道[47]。 其中腸道菌群被認為是類風濕關節炎發展的重要環境因素[48],研究表明類風濕關節炎患者的腸道微生物多樣性降低,與RA 持續時間和自身抗體水平相關[49]。 閆夢真等[37]通過研究發現腸道菌群失調可誘導關節組織炎性因子水平增高。 腸道營養不良可以通過影響T 細胞亞群的分化來誘發關節炎,并可能導致Th17/Treg 細胞比例失衡[50]。 有學者借助CIA 小鼠模型分析腸道微生物群及腸黏膜變化,結果發現腸道菌群失調可以影響小鼠疾病嚴重程度,在誘導CIA 之前微生物群的消耗可導致疾病嚴重程度降低約40%,誘導CIA 后期微生物消耗則導致疾病嚴重程度降低90%以上[51]。 腸道菌群的變化是現在研究RA 新發病機制的重要思路,未來可嘗試依據腸道菌群混亂誘發建立類風濕性關節炎模型,幫助探究類風濕性關節炎相關發病機制。

5 總結

目前RA 發病機制還未完全研究清楚,臨床治療主要以控制癥狀,延緩關節破壞,減少并發癥進而提高生活質量為目的。 因此,為更好地開發新的RA 治療策略,需依據不同的理論和發病機制建立RA 藥理模型,并根據RA 分型選用合適的動物模型。 其中CIA 模型和AA 模型應用較為廣泛,在CIA、AA 基礎上建立的病癥結合模型在中醫藥基礎研究中也日益受到重視。 上述幾類造模方法中均以出現關節發紅腫脹、關節病理改變等為主要標準,與中西醫臨床診斷標準中的部分內容(例如晨僵、RF 陽性等現象)有一定差別。

續表1

動物模型與臨床應用的接近程度有助于RA 相關炎癥及自身免疫的基礎研究。 因此,動物模型特征及評價方法與中西醫臨床診斷標準的吻合度[52]至關重要(表1),例如吻合度較高的模型有:AA 模型、人TNF 基因小鼠模型和風寒濕痹證模型等。 其中AA 模型具有多處關節對稱性腫脹、類風濕因子陽性及骨質侵蝕破壞等特征,與西醫診療標準吻合度較高。 而風寒濕痹模型則在滿足西醫診療標準的基礎上體現了中醫RA 臨床辨證分型,具有一定應用價值。 簡化模型評價方法從而提高與臨床應用的吻合度是未來動物模型發展的重要方向,如Micro-CT 技術在定量評價骨密度及骨結構等方面較為權威,且多適用于疾病的臨床前研究,可作為模型評價的重要指標之一。 除此之外,腸道菌群與RA 的發生、發展及治療有很大相關性,未來可通過矯正腸道微生物混亂來保護骨關節免受破壞,也可通過舌象與腸道微生物的聯系進而建立新型動物模型來探尋治療RA 的新策略。 然而針對中醫臨床癥狀如舌象、脈象等情況不易在動物身上被觀察,為滿足今后研究,還需深入研究中醫證候的內涵,同時契合現代醫學病因來選擇和建立模型。

表1 類風濕關節炎實驗模型與中西醫臨床病癥吻合度Table 1 Coincidence between experimental model of rheumatoid arthritis and the clinical symptoms of Chinese and western medicine