長鏈非編碼RNA 參與調控細胞程序性死亡的研究進展

汪貝貝張文波蔣鵬程

(江蘇大學附屬人民醫院普外科,江蘇 鎮江 212002)

細胞死亡在機體的生長發育過程中不可或缺,可按照意外因素或體內的分子調節機制的不同,分為意外細胞死亡和調節性細胞死亡(regulated cell death,RCD),在生理條件下,RCD 又被稱為細胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),根據發生機制及生化形態特征,PCD 包含凋亡(apoptosis)、壞死性凋亡(necroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、焦亡(pyroptosis)、自噬(autophagy)等多種形式[1]。 而根據細胞是否發生破裂,也可分為溶解性細胞死亡和非溶解性細胞死亡兩類[2]。 不少研究表明PCD 可顯著調控炎癥、腫瘤等疾病的發生發展,而作為下游因子,PCD 在分子水平、蛋白水平、葡萄糖水平、線粒體功能等方面可受諸多因子調控,其中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是關鍵的上游調控分子之一[3]。

長鏈非編碼RNA 是轉錄物長于200 nt 的RNA,曾經被認為是“轉錄噪音”序列、RNA 聚合酶II 的副產物。 盡管無法翻譯成蛋白質,但lncRNA從作為基因表達的調節器,到將遺傳密碼子翻譯成蛋白質序列,都扮演著功能分子的角色,其在細胞核內參與遺傳、轉錄的調控,在細胞質中可充當miRNA 的競爭性內源RNA(ceRNA)影響mRNA 翻譯,并參與mRNA 后續的穩定以及降解過程的調節[4]。 lncRNA 在細胞的增值、遷移等多種生物學過程中發揮重要作用,同時PCD 作為研究的熱點問題,近年來有較多lncRNA 參與其調控的研究報道,但目前尚缺乏歸納總結,本文就相應問題的最新研究展開綜述,以期為細胞程序性死亡的調控和lncRNA 的功能研究提供新的思路。

1 lncRNA 與凋亡

凋亡是在一系列酶的參與下、受基因調控的主動且有序的過程,具有不同于壞死的形態學變化的一類PCD,細胞凋亡及其失調是許多疾病的病理生理過程的基礎,包括細胞內穩態、組織重塑和腫瘤發生[5]。 凋亡主要包含線粒體途徑和死亡受體途徑兩類經典途徑。

線粒體途徑中,在細胞應激或發育信號作用下,Bcl-2 家族蛋白的表達或功能受到相應調節,3種促進凋亡的Bcl-2 效應蛋白——Bax、Bak 和Bok可直接引起線粒體外膜通透性(MOMP)增加,從而將線粒體膜間隙蛋白釋放到細胞質中,啟動凋亡;而抑制凋亡的Bcl-2 蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 和BFL/A1 等,及單個BH 區的BH3 蛋白Bid、Bim、Bad和Noxa 等則產生相反的效應[6]。 細胞中Bcl-2 蛋白的特異性和動態相互作用決定了MOMP 的發生與否。 而在死亡受體途徑中,腫瘤壞死因子受體(TNFR) 與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、Fas 配體(Fas L)等配體結合后,由細胞凋亡抑制因子(cellular inhibitor of apoptosis protein,cIAP)1 和腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAF)2 對受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting serine/threonine protein kinase, RIPK)1 來進行了泛素化標記,再經去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)作用,形成腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白(TNFRassociated death domain,TRADD)/凋亡促進蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)/半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)8/RIPK1/RIPK3和TRADD/FADD/caspase-8 兩種復合體,當前者中caspase-8 激活時,使得caspase-3/7 成熟,或水解Bid,促進細胞凋亡,而后者可通過FADD 直接使得caspase-8 成熟,導致凋亡[7]。

lncRNA 可以通過影響凋亡相關蛋白的表達,參與線粒體途徑的調控。 有研究用高糖處理lncRNA CA7-4 和si-CA7-4 轉染后的血管內皮細胞,發現CA7-4 升高了Bax 和裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase-1,PARP1)的水平,促進血管內皮細胞的凋亡[8]。 此外,Li 等[9]研究發現miR-296-5p 直接結合Bax mRNA 的3’非翻譯區,在mRNA 和蛋白質水平上抑制Bax 表達,而lncRNA KCNQ1OT1 作為一種有效的細胞凋亡促進因子,通過使miR-296-5p 海綿化,上調Bax,促進了神經母細胞瘤細胞凋亡。

lncRNA 亦可通過死亡受體途徑調節凋亡的發生發展。 He 等[10]發現lncRNA GAS5 的過表達顯著上調caspase-3 蛋白表達水平、促進平滑肌細胞凋亡且抑制其增殖,減少了平滑肌細胞的數量,從而參與調控腹主動脈瘤的形成。

lncRNA 還可以通過各種其它機制調節細胞凋亡,如Jiang 等[11]發現高水平的lncRNA RP11-468E2.5 表達可通過抑制JAK/STAT 信號通路來負調節信號轉導和STAT5/6 的表達,從而抑制了大腸癌細胞的增殖并促進其凋亡。

2 lncRNA 與壞死性凋亡

壞死性凋亡是由RIPK1、RIPK3 和人混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)介導的一種受調控的壞死細胞死亡形式,在凋亡缺乏的條件下可被激活[12]。

在TNFR1 參與的信號通路的研究中,TNFα 與TNFR1 的結合會觸發如NF-κB 通路、細胞凋亡和壞死性凋亡的激活,亦會招募TRADD、TRAF2/5、RIPK1、cIAP1 組成復合體I。 cIAP1 對RIPK1 的多聚泛素化所募集的復合物TAK1(TAK1、TAB1 和TAB2),可解離激活轉錄因子NF-κB[13],而CYLD對RIPK1 去泛素化作用或抗壞死蛋白(A20)泛素編輯復合物抑制NF-κB 活化,并形成Necrosome 復合體,包 含caspase-8、 TRADD、 RIPK1、 RIPK3 和FADD[14]。 caspase-8 的活性對于確定細胞的命運至關重要,當缺失或被抑制時,RIPK1 和RIPK3 會互相激活磷酸化,進一步活化Necrosome 復合體,激活下游的MLKL 蛋白,致使膜通透性增強,損傷相關分子模式( damage associated molecular patterns,DAMPs)滲出;此外還會造成線粒體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)累積,線粒體分裂,細胞發生壞死性凋亡[15-16]。 而當caspase-8 激活的情況下,caspase-8 會抑制RIPK1 和RIPK3 的磷酸化,Necrosome 復合體失活,導致細胞凋亡。

有研究表明,在敲低lncRNA TRINGS 或缺乏葡萄糖所誘導的死亡細胞內ATP 水平顯著降低,高遷移率族蛋白B1 和乳酸脫氫酶的釋放顯著增加,表明TRINGS 低表達導致缺糖下的壞死性細胞死亡,且在形態學觀察中,發現了細胞質膜破壞的壞死性凋亡表型的細胞,證明了這一結果[17-18]。 在缺乏葡萄糖時,p53 激活lncRNA TRINGS,上調的TRINGS與糖原合酶激酶-3β(GSK3β)競爭性地結合絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關蛋白(STRAP),從而減弱了STRAP 和GSK3β 之間的相互作用,TRINGS 通過抑制STRAP/GSK3β/NF-κB 信號傳導途徑,使癌細胞免于壞死。

隨著lncRNA 上的miRNA 識別元件的發現,miRNA-lncRNA 的相互作用增加了多方面轉錄后基因調控的復雜性[19]。 報道較多的為lncRNA 作為ceRNA 與 miRNA 相 互 作 用。 為 了 研 究lncRNA3037/miR-15a 軸在壞死性凋亡中的作用,Li等[20]發現敲除lncRNA 3037 顯著提高了RIPK1、RIPK3、p-MLKL、Bax 和caspase-3 的表達,降低了miR-15a 靶基因抗凋亡蛋白(BCL2)和抗壞死蛋白(A20)的表達從而增加細胞凋亡率和壞死率。 同樣的, lncRNA107053293 可 作 為 miR-148a-3p 的ceRNA,調控靶基因Fas 相關分子1 的表達,介導下游基因RIPK1 和RIPK3 的表達,誘導氣管細胞發生壞死性凋亡[21]。 研究表明,敲除在肝細胞癌中高表達的lncRNA00176 時,會使腫瘤抑制因子miR-9 和miR-185 釋放,從而影響細胞周期,造成肝癌細胞壞死性凋亡[22]。

MiRNA 和lncRNA 作為兩種主要的調節性非編碼RNA,不僅可以彼此相互作用,還可以作用于多種細胞內成分,參與細胞凋亡和壞死等PCD 調節[23],lncRNA 是否通過與其它的ncRNAs 的相互作用從而參與調控壞死性凋亡,有待進一步探索。

3 lncRNA 與鐵死亡

2012 年Dixon 等[24]首次提出一種鐵依賴性的調節性細胞死亡模式,通過不同的信號傳導通路,最終導致細胞內部脂質ROS 物質的積累、脂質過氧化,從而誘導細胞死亡,被定義為鐵死亡。

在較成熟的還原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)/谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)調節通路中,胱氨酸通過細胞膜表面的胱氨酸-谷氨酸反轉運受體(System Xc)轉移至細胞內,進一步形成GSH,再經GPX4 形成氧化型谷胱甘肽。 這個過程會輔助GPX4 去除多不飽和脂肪酸的過氧化,從而抑制鐵死亡的發生[25]。 循環鐵與轉鐵蛋白以三價鐵的形式結合,然后通過轉鐵蛋白受體1(TFR1)進入細胞,通過還原及脫蛋白,形成二價鐵離子,再經芬頓反應,產生大量羥自由基,最終造成ROS 的累積,促進鐵死亡的發生。 此外,腫瘤抑制蛋白p53 可以通過抑制System Xc 攝取胱氨酸,從而影響GPX4 的活性,導致細胞抗氧化能力下降、脂質ROS 積累和鐵死亡[26]。 而Erastin 不僅可以通過抑制System Xc 攝取胱氨酸,還可以激活p53、影響脂質代謝等形式參與鐵死亡的調控[27-28]。

在鐵死亡中lncRNA 可以扮演ceRNA 的角色,Wang 等[29]證明在肺癌中lncRNA LINC00336 的過表達降低了鐵濃度、脂質ROS 和線粒體超氧化物的表達,并增加了線粒體膜電位。 淋巴特異性解旋酶(LSH)通過失活p53 誘導類似胚胎致死性異常視覺基因的 RNA 結合蛋白1 表達, 后者通過與LINC00336 相互作用的轉錄調控提高了LINC00336的表達水平。 總之,LINC00336 吸收miR-6852 作為ceRNA,從而增加胱硫醚β 合成酶(cystathionineβsynthase,CBS;轉硫途徑活性的標志)的mRNA 水平,刺激細胞增殖,集落形成和腫瘤形成,并抑制肺癌細胞的鐵死亡。 同樣,Lu 等[30]發現miR-214 可以與lncRNA PVT1、p53 和TFR1 結合,miR-214 既可通過降低p53 水平從而抑制鐵死亡的發生,亦可與TFR1 的3’UTR 結合,部分地通過TFR1 調節鐵進入細胞內,參與鐵死亡的調控。 研究結果表明,lncRNA PVT1 作為miR-214 的海綿,通過miR-214介導的p53 和TFR1 途徑調節腦缺血再灌注中鐵死亡的發生發展。

鐵死亡還可以與其他類型的程序性死亡緊密相關。 LINC00618 通過上調Bax 蛋白和裂解的caspase-3 蛋白表達水平來促進細胞凋亡。 敲除LINC00618 顯著降低了脂質ROS 水平,敲除組細胞在經長春新堿(VCR)和caspase 抑制劑VAD 處理后,較對照組細胞的脂質ROS 水平顯著升高。 然而,當VCR 和Erastin 加入這些細胞時,它們對VCR誘導的鐵死亡沒有顯著影響,表明鐵死亡激活劑不會改變VCR 誘導的鐵死亡和凋亡,而LINC00618 誘發的鐵死亡依賴于VCR 誘發的凋亡。 過表達LINC00618 的細胞中LSH 和溶質載體家族7 成員11(SLC7A11)的表達水平均降低,LSH 與SLC7A11的啟動子區域結合,增強SLC7A11 的轉錄,表明LINC00618 可抑制LSH 誘導的SLC7A11 的表達,促進依賴于細胞凋亡的鐵死亡發生[31]。

4 lncRNA 與焦亡

2001 年Cookson 等[32]觀察到一種caspase-1 依賴性的死亡的現象出現在被感染的巨噬細胞中,將其命名為細胞焦亡,不同于細胞凋亡,焦亡的形態學變化在體外沒有DNA 片段化,但存在細胞核凝聚和細胞腫脹,最終破裂。

細胞焦亡有經由NOD 樣受體的經典途徑及通過JAK/STAT1 的非經典途徑兩類,在細胞在受到病原體或者外部損傷后,會分別激活JAK 和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor pyrin, NLRP;NOD 樣受體蛋白)/凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing CARD,ASC)/Pro-caspase-1 復合體。 后者水解形成為成熟的caspase-1,而JAK 則傳遞到下游的STAT1,形成STAT1 二聚體,入核激活caspase-4/11 的轉錄,成熟的caspase-1 或者caspase-4/11 和caspase-5 的復合體,水解Gasdermin D(GSDMD),生成的GSDMDPFD 可以在膜上形成多聚體管孔,引起細胞內滲透壓的變化、大量的DAMPs 分子涌出、細胞腫脹而破裂死亡[33]。 在缺乏GSDMD 的情況下,caspase-1 可以裂解并激活半胱氨酸蛋白酶,并且還可以裂解并激活Bid 以參與MOMP。 因此,在沒有GSDMD 的情況下,caspase-1 激活會導致細胞凋亡[34]。

近年來,lncRNA 參與焦亡過程調控的研究報道很多,Yang 等[35]發現lncRNA KCNQ1OT1 可以作為miR-214-3p 的 ceRNA, 增強糖尿病心肌病中caspase-1 的表達來加速高糖誘導的成纖維細胞的焦亡;且在抑制KCNQ1OT1 后,GSDMD-N 蛋白表達水平發生逆轉而呈嚴重下降趨勢。 類似的調控方式在糖尿病性角膜內皮功能障礙中被報道[36]。 除此之外,最新研究發現lncRNA MIAT 可與CASP1 競爭結合miR-342-3p,從而減輕對miR-342-3p 靶基因CASP1 表達的抑制作用,從而促進caspase-1 介導的人視網膜外膜細胞焦亡[37]。 無獨有偶,Liang 等[38]發現lncRNA MEG3 通過海綿吸附miR-485 抑制黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)的表達,缺乏MEG3 可抑制caspase-1 信號轉導,降低AIM2、ASC、裂解的caspase-1 和GSDMD-N 的表達,敲除MEG3 可抑制氧糖剝奪后再復糖復氧所誘導的焦亡和炎癥反應。

lncRNA 還可以通過介導NLRP 的表達參與焦亡的調控過程。 在缺氧心肌細胞中,人間充質干細胞分泌的lncRNA KLF3-AS1 通過作為ceRNA 與miR-138-5p 結合,促進沉默信息調節因子1(Sirt1)的表達,后者可以抑制NLRP3 炎癥小體的激活,從而下調焦亡的表達[39]。 Wan 等[40]報道了過表達的lncRNA H19 與程序性細胞死亡因子4 競爭miR-21,形成ceRNA 網絡,H19 介導其觸發了NLRP3/NLRP6 炎性小體的相互激活,募集活化的caspase-1來切割GSDMD,從而引發小膠質細胞焦亡。 而lncRNA GAS5 既參與凋亡的調控,GAS5 的DNA 甲基轉移酶1 甲基化通過影響NLRP3 軸也參與調控心肌成纖維細胞焦亡[41]。

另外還有其他的方式參與焦亡的調控,如Toll樣受體4 在脊髓損傷后被激活,進一步磷酸化STAT1 并促進了lncRNA-F630028O10Rik 的表達,該lncRNA 充當miR-1231-5p/Col1a1 軸的ceRNA,并通過激活PI3K/ AKT 途徑增強脊髓損傷后的小膠質細胞焦亡[42]。

5 lncRNA 與自噬

自噬是指在病原體因素、內質網應激下真核細胞通過形成雙膜限制的自噬小體,將受損或多余的物質從細胞質中隔離出來,并與溶酶體融合,分解的物質可以再利用,以完成自身代謝需要、細胞器的更新、維持細胞穩態的過程[43]。

在哺乳動物中,巨自噬是研究最為廣泛的一種經典類型,另外還有微自噬和分子伴侶介導的自噬。 不同的自噬相關基因(autophagy related genes,ATG)蛋白組成復合物,作為自噬機制的調節核心,負責自噬的誘導、自噬小體的形成、運輸以及與溶酶體的融合[44]。 自噬的啟動始于UNC-51 樣激酶-1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)復合物的激活,當雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin1,mTORC1)的活性受抑制,ATG13 的快速去磷酸化作用可以促進自身與ULK-1、粘著斑激酶家族相互作用蛋白和ATG101 之間形成穩定的復合物。 該復合物調節PI3K 復合物向內質網的轉運,從而促進隔離膜的成核和組裝;ATG12-ATG5-ATG16L1 復合物移至噬菌體裝配位點,并使微管相關蛋白1-輕鏈3(亦被稱為ATG 8 或LC3) 與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)結合形成ATG 8-PE復合物,這促進了自噬體膜的伸長并形成自噬體,隨后與溶酶體融合而發育成熟[45-46]。 自噬在細胞生存和死亡中均扮演著重要角色,且與凋亡存在Beclin1、p53、ROS 等共同的調節因子。 自噬不僅能夠促進或抑制凋亡,甚至可與凋亡同時發生,或在特定情況下相互轉化或協同作用[47]。 下文中我們將主要探討lncRNA 參與自噬樣死亡的調控。

部分 lncRNA 通過影響雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表達,參與自噬過程的調控。 lncRNA FA2H-2 通過在轉錄水平抑制了MLKL 的表達,從而抑制了mTOR 依賴性信號通路的激活促進動脈粥樣硬化中自噬的發生發展[48]。 P53 作為常見的抑癌基因,通過激活mTOR 的上游因子,參與自噬的調節,Liu 等[49]研究發現,lncRNA CAIF 通過與p53 蛋白直接相結合,阻斷其介導的心肌素轉錄,下調心肌素的表達水平,抑制了p53-心肌素信號轉導的心肌細胞自噬。

某些lncRNA 通過介導自噬小體的形成參與自噬的調控。 Li 等[50]發現lncRNA ZNNT1 的過表達顯著增加了葡萄膜黑色素瘤細胞中LC3-I 到LC3-II的轉化以及自噬底物受體SQSTM1(又稱p62)的降解,促進細胞自噬。 相反, Zhang 等[51]報道了lncRNA CRNDE 下調LC3-II 的表達顯著抑制胃癌細胞自噬。 除了針對LC3 之外,一些lncRNA 還介導了ATG 的表達,有研究發現lncRNA PVT1 通過上調LC3-II 的表達水平而減少p62 的含量,而消耗ATG14 可以恢復胰腺癌細胞中的這些影響,最終表明PVT1/miR-619-5p 軸通過調節ATG14 促進自噬活性[52];類似的,lncRNA EIF3J-DT 通過直接結合來增強ATG14 mRNA 的穩定性,并通過與miR-188-3p競爭性結合來阻止ATG14 mRNA 的降解,從而上調ATG14 的表達,促進自噬[53]。

除此之外一些研究者證實lncRNA H19 通過抑制了DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferase,DNMT) 3B 直接與Beclin1(參與形成PI3K 復合體)啟動子的區域結合,上調了Beclin1 的表達水平并促進了自噬[54]。

6 其它類型的細胞程序性死亡

除上文所述之外還有報道較少的RCD[1]。 如依賴性細胞死亡(parthanatos)、內在性細胞死亡(entotic cell death)、網織狀細胞死亡(netotic cell death)、溶酶體依賴性細胞死亡(lysosome-dependent cell death,LCD)、自噬依賴性細胞死亡(autophagydependent cell death)、堿死亡(alkaliptosis)和氧自由基誘導死亡(oxeiptosis)。 這些PCD 的具體機制尚在研究中,目前雖未有lncRNA 參與其調控的報道,但不同類型PCD 之間存在關聯,如溶酶體膜透化不僅發生在LCD 中,還可以在細胞凋亡、鐵死亡等其它PCD 中放大細胞死亡信號傳導,使得細胞死亡途徑變得更加復雜[55]。 臨床方面如堿死亡在胰腺癌中的作用被開始挖掘[56],近幾年來一種新概念PANoptosis 出現在研究的視野中,它是一種獨特的、生理相關的炎癥性程序性細胞死亡途徑,由特定的觸發因子激活,結合了凋亡、壞死性凋亡、焦亡三種類型PCD 的關鍵因子,在免疫領域發揮了相應的臨床價值[57]。 相信陸續會有更多的相關報道,這些細胞程序性死亡與lncRNA 的相互作用機制也未嘗不可作為新的研究方向。

7 總結與展望

PCD 作為近年來研究的熱點領域,在炎癥、腫瘤等方面均有著突破性的進展,而lncRNA 不僅在基因的表達過程中充當調節因子,同樣也參與了PCD 的調控,本文綜述了近年來lncRNA 與幾種常見的PCD 相互作用的研究進展(見表1),這對研究lncRNA 參與調控PCD 的機制的進一步探索以及發掘新的研究方向有一定的意義。 同一種的lncRNA,如MEG3、H19 等參與不同類別的PCD。 不同類型的PCD 之間亦存在相互作用、有些存在類似的調節因子,如鐵死亡被認為依賴于自噬的發生,兩者之間存在p53、STAT3、GPX4 等近10 種共有的調節蛋白;ROS 誘導既可以參與壞死性凋亡,也介導鐵死亡的發生,但目前未見有lncRNA 直接或間接參與調控此類關鍵因子,從而串聯多種PCD 的研究報道。 同時lncRNA 作為腫瘤診斷及治療的潛在靶點被相繼報道,而另一些如lncRNA ZNNT1 既誘導自噬又抑制了腫瘤的發生,lncRNA 通過一種或是多種PCD 在腫瘤發生發展中的具體機制,仍需深入研究。 lncRNA 與PCD 的關系或將為腫瘤及其它疾病的診療提供新的思路。

表1 lncRNA 在細胞程序性死亡中的作用Table 1 Role of lncRNA in programmed cell death