尾礦硫氧化微生物的分離鑒定與功能驗證

李嘉義，孫蔚旻，孫曉旭，孔天樂，李寶琴，劉振鴻，高品*

1.東華大學環境科學與工程學院，上海 201600；2.廣東省科學院生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650

尾礦是礦產資源開采過程中衍生出來的固體廢棄物。尾礦因產量大、有毒金屬浸出風險高而備受全球關注。據《中國礦產資源節約與綜合利用報告 (2018)》顯示，截至2017年底，我國尾礦的堆存量為195億噸左右（王雪峰等，2018）。尾礦往往未經任何處理直接露天堆放，在雨水的沖刷作用下，尾礦中的有毒金屬離子會隨地表徑流匯入江河或被土壤顆粒所吸附，從而造成水體和土壤污染（程睿，2021）。例如，“世界銻都”錫礦山尾礦庫周邊土壤存在多種有毒金屬污染，其中銻、砷及汞質量分數分別高達 141.92—8733.26、14.95—363.19、0.16—5.68 mg·kg?1（孔天樂等，2020）。

自然界中的金屬礦物主要以硫化物形式存在，如黃鐵礦（FeS2）、輝銻礦（Sb2S3）、方鉛礦（PbS）等，因此尾礦環境中往往富含硫元素（黃小龍等，2018）。硫元素循環是自然界最重要的元素循環之一，其中微生物硫氧化過程是硫元素生物地球化學循環中不可或缺的部分（Cao et al.，2018）。微生物硫氧化是指硫氧化細菌將低價態的還原性硫化物或單質硫完全氧化為硫酸鹽（SO42?）或部分氧化為更高價態的硫化物的過程（劉陽等，2018）。硫氧化微生物廣泛存在于各種生境中，如網箱養殖區、深海熱液區、污水處理廠硝化污泥池等（陳小紅等，2016；林旭等，2018；曲珊珊等，2021）。已有研究表明，硫氧化微生物代謝過程會產生SO42?，而SO42?會加快土壤中Cr、Pb等重金屬離子的解吸，顯著增強其活性形態（郭朝暉等，2002）。除此以外，含硫尾礦中的硫氧化過程會導致尾礦酸化，進而導致Cd、Hg、Ni、Pb、As等重金屬元素的活性和遷移能力提高（王存龍等，2012），加劇重（類）金屬對環境的污染（楊濤濤等，2020）。尾礦作為硫氧化過程的熱點區域，會促使酸性礦山廢水的產生。已有研究表明，微生物可以影響黃鐵礦、砷黃鐵礦、黃銅礦、白鐵礦和閃鋅礦溶解過程中的硫氧化速率，并且微生物對硫和中間硫化合物的利用可顯著地促進尾礦酸化和黃鐵礦溶解（Baker et al.，2003）。當前已有的研究對硫氧化過程機制及其環境效應進行了初步探究，但對尾礦中硫氧化微生物的分離鑒定及其對尾礦原位環境的影響仍需進一步解析。因此，本文圍繞尾礦中能驅動硫氧化過程的功能微生物種群開展研究，探討硫氧化功能微生物對尾礦酸化過程的貢獻，這對于尾礦治理與修復具有重要意義。

為了解析尾礦原位條件下參與硫氧化過程的關鍵微生物種類和硫氧化過程對尾礦酸堿度的影響，本項目以典型礦區土壤錫礦山尾礦作為實驗土壤，利用定向分離培養的方式獲得原位環境中的硫氧化微生物純菌菌株。對于分離所得純菌，通過16S rRNA和soxB基因測序等手段確定其種屬和功能基因，并驗證其硫氧化速率。在此基礎上，進一步通過實驗室模擬的方式，驗證硫氧化過程對土壤酸化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和實驗試劑

聚苯乙烯細菌皿，規格為90 mm×15 mm，品牌為BIOLOGIX；一次性接種環，品牌為Biosharp；涂布棒，品牌為Biosharp；無菌離心管，規格為50 mL，品牌為 BIOLOGIX；核酸提取試劑盒，品牌為QIAGEN凱杰；電泳儀，型號為LF-31DN；高壓滅菌鍋，型號為 MLS-3781L；恒溫振蕩器，型號為SHZ-82；生化培養箱，型號為LRH-250；PCR擴增儀，型號為bio-rad t100；Ged Dox xpt凝膠成像系統；pH計，型號為 LEICI/雷磁 PHS-3C；離子色譜儀，型號為ICS-600；升華硫（化學純），廣州化學試劑廠生產。

1.2 實驗土壤與培養基

實驗土壤采自湖南冷水江市錫礦山（27°27′N，111°33′E），去除表層土壤（約1 cm）后，用消毒鐵鍬收集尾礦樣本（約1—5 cm），采集的樣品用干冰覆蓋運回實驗室。本研究分離純化所用固體培養基和液體培養基參考Huang et al.（2020）分離硫氧化菌所報道的選擇性培養基，其具體成分如表1所示。液體培養基滅菌冷卻后分裝到50 mL的無菌離心管待用，固體培養基在液體培養基的基礎上另加15 g·L?1的瓊脂，而后高溫滅菌，待固體培養基凝固前分裝倒入平板，等其自然凝固，放于無菌操作臺中待用。

表1 硫氧化菌液體培養基和固體培養基Table1 Sulfur-oxidizing bacteria liquid medium and solid medium

1.3 土壤微生物的分離與純化

稱取10 g錫礦山尾礦土于無菌錐形瓶中，并加入100 mL無菌水，隨后振蕩30 min，得到土壤懸濁液。在無菌環境下，移取100 μL土壤懸濁液于固體培養基上，通過稀釋涂布法使土壤懸濁液均勻涂布于固體培養基上，并用封口膜將平板進行密封，密封完全后將平板倒置于生化培養箱（27 ℃）中進行培養，直至平板表面出現明顯菌落。隨后采用平板劃線法將平板中的單一菌落分離至新的固體培養基上，并于生化培養箱中進行培養，以此重復傳代，直到每個平板上的菌落從形態、顏色、光滑度以及濕潤度等特征來看均表現為單一菌種后結束傳代。接著用核酸提取試劑盒提取純菌的DNA，再將得到的純菌 DNA以 BoxAIR（5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′）為引物進行Box-PCR（PCR首先在95 ℃變性5 min；94 ℃變性10 s，52 ℃退火1 min，68 ℃延伸4 min，共10個循環；然后在接下來的25個循環中，每增加一個循環，延伸步驟就延長10 s）。Box-PCR所得產物通過瓊脂糖凝膠電泳技術進行電泳分析，以驗證菌株分離純化情況。

1.4 純菌物種鑒定及其硫氧化功能基因檢測

本研究使用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）對純菌16S rRNA基因序列進行擴增，并將PCR擴增產物送于上海生工生物工程有限公司進行一代測序（Lilian et al.，2021）。此外，采用引物 710F（5-ATCGGYCAGGCYTTYCCSTA-3′）和 1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTTGC-3′）對純菌的硫氧化soxB基因片段進行PCR擴增，PCR產物分為兩部分，一部分通過瓊脂糖凝膠電泳技術進行電泳分析，另一部分PCR擴增產物送于上海生工生物工程有限公司進行測序（儲巧玲等，2018）。測序所得序列于NCBI基因庫進行數據對比，以獲取純菌的物種信息。同時，使用MEGAX軟件對得到的堿基序列構建系統發育樹（Alignment方式選擇 ClustalW，構建方式選擇Maximum Likelihood），并比較分離純化得到的純菌與發育樹中各菌種之間在系統發育學上的關系和相似性。

1.5 硫氧化功能的驗證

在無菌條件下，將分離純化得到的純菌（200 μL菌液）分別接種于含有30 mL液體培養基和0.1 g升華硫的無菌西林瓶中。每種純菌設置5個重復組，同時設置了3個不加菌液的空白對照組。硫氧化實驗體系構建完成后將西林瓶靜置放于室溫條件下，最后采用離子色譜儀對各微宇宙中SO42?濃度進行檢測，以驗證純菌的硫氧化功能。

1.6 硫氧化微生物原位條件模擬實驗

尾礦是礦物提取殘渣與水的混合物，但由于礦石碎渣保水性較差，尾礦堆積一段時間后含水率降低，會由尾礦與水的混合形態變為濕潤狀態。因此，為了更加真實地模擬尾礦土壤的實際狀態，本研究構建了兩組原位條件模擬實驗，一組為淹水處理，另一組為濕潤處理。具體操作如下：淹水條件下，在超凈工作臺中向無菌錐形瓶中加入20 g滅菌尾礦土，1 g升華硫，并且加入50 mL無菌水使尾礦土壤完全被水淹沒，然后接種500 μL菌液于無菌錐形瓶中；濕潤條件下，向100 mL西林瓶中加入50 g滅菌并且冷凍干燥后的干土，12.5 mL滅菌水，控制含水率在20%左右，最后加入1 g升華硫，1 mL菌液。兩組實驗每種硫氧化微生物均設置5個重復組，同時設置3個不加菌液的空白對照組。微宇宙構建完成后將其放于室溫條件下進行培養。每間隔一段時間監測一次pH值，并計算氫離子濃度。對于淹水處理的尾礦土pH，搖勻后直接使用pH計進行測量；對于濕潤處理的尾礦土，則需稱取2 g尾礦，加入5 mL去離子水，振蕩搖晃30 min后，用pH計測量土壤浸出液的pH。

2 結果

2.1 硫氧化功能微生物分離鑒定

本研究以錫礦山尾礦土為研究對象，以還原態硫作為唯一電子供體，通過稀釋涂布平板法和平板劃線法成功分離得到了24株純菌?；贐ox-PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術的對比分析，確認了12個非冗余菌株。通過16S rRNA測序和NCBI基因庫比對結果發現，這 12株非冗余純菌分別為Pseudoxanthomonasjiangsuensis、Limnobacter、Ciceribacterthiooxidans、Pseudomonasoryzihabitans、Cellvibriozantedeschiae、Methyloversatilis、Nocardioidesalbus、Microbacteriumtrichothecenolyticum、Azoarcus olearius、Thauerasp.、Stenotrophomonasrhizophila和Flavobacteriumtructae。此外，從12株純菌的硫氧化功能基因（soxB基因片段）的PCR擴增及其瓊脂糖凝膠電泳分析結果中發現，具有soxB硫氧化功能基因片段的純菌有兩株，如圖1所示，標記為1和2，分別命名為Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2（以下分別簡稱為LJY-1和LJY-2）。

2.2 純菌LJY-1和LJY-2硫氧化功能驗證

硫氧化基因檢測結果表明，LJY-1和LJY-2兩株純菌具有硫氧化潛能。經預實驗驗證，在所得到的全部12株純菌中，僅LJY-1和LJY-2在試驗條件下展現出硫氧化能力。為了進一步驗證這兩株純菌的硫氧化潛力，對硫氧化微宇宙體系中SO42?濃度進行檢測。在硫氧化體系中，發現前8天內所有處理組中SO42?濃度均無明顯變化（圖2）。經過8 d的調整期后，接種了LJY-1的處理組中SO42?濃度以 (64.55±5.90) mg·L?1·d?1的平均速率快速增長，第 22天 SO42?濃度達到了 (1154.07±81.83)mg·L?1。與之相比，在培養結束時，接種了LJY-2的處理組的 SO42?濃度為 (387.978±24.04) mg·L?1，僅略高于空白對照組 (254.78±13.63) mg·L?1。

2.3 純菌16S rRNA和soxB基因序列分析及系統發育樹的建立

基于硫氧化實驗的結果，LJY-1表現出了較強的硫氧化性能。為了進一步深入了解LJY-1，本研究對LJY-1進行基于16S rRNA基因和soxB基因的系統發育分析?；?6S rRNA系統發育樹結果發現，LJY-1與Methyloversatilisdiscipulorum親緣關系最近，相似性達到了99.16%（BLAST對比得到）（圖3）。除此以外，LJY-1與Pandoraea、Ralstonia、Polynucleobacter等菌屬位于同一簇上，說明LJY-1與這些菌的相似性較高。基于soxB基因系統發育樹結果表明LJY-1含有兩個soxB基因片段（圖4），將其命名為Methyloversatilissp.LJY-1soxB1和Methyloversatilissp.LJY-1soxB2，還可發現LJY-1與Methyloversatilisdiscipulorum的相似度最高，達到了86.05%（BLAST對比得到）。

圖3 菌株Methyloversatilis sp.LJY-1基于16S rRNA基因序列同源性構建的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree of Methyloversatilis sp.LJY-1 based on the 16S rRNA gene homology

圖4 菌株Methyloversatilis sp.LJY-1基于soxB基因序列同源性構建的系統發育樹Figure 4 Phylogenetic tree of Methyloversatilis sp.LJY-1 based on the soxB gene homology

2.4 原位土壤硫氧化微生物對土壤酸化作用的影響

原位條件模擬實驗結果表明，在淹水狀態下（圖5），各處理組中pH隨著時間的推移均逐漸降低，尤其是接種LJY-1的實驗組在培養了28 d后，pH由8.05左右降至7.30左右，氫離子濃度顯著升高了 (6.10±0.35)倍，而接種 LJY-2實驗組和空白對照組中氫離子濃度分別升高了 (4.74±0.64) 倍和 (3.51±0.10) 倍。類似地，濕潤狀態下（圖6）接種 LJY-1的實驗組氫離子濃度上升幅度(3.18±0.21) 倍顯著大于接種純菌 LJY-2的實驗組(2.79±0.16) 倍和空白對照組 (2.59±0.66) 倍。綜上所述，LJY-1對尾礦土壤酸化具有顯著促進作用。與濕潤狀態相比，淹水狀態下LJY-1實驗組氫離子濃度提升更為明顯，加劇了尾礦土壤的酸化程度。

圖5 淹水狀態下微生物對土壤酸化的影響Figure 5 The influence of microorganisms on soil acidification under flooded conditions

圖6 濕潤狀態下微生物對土壤酸化的影響Figure 6 The influence of microorganisms on soil acidification under humid conditions

3 討論

伴隨著礦石的開采，尾礦產生量逐漸增多，進而帶來一系列污染問題（楊勇等，2015）。自然界中含硫礦物分布廣泛，種類繁多，主要以單質硫和化合態硫兩種形式存在。含硫礦石開采后的尾礦含有高含量的硫化物，一般在 2.1%—2.5%之間（蘇雄，2016）。微生物硫氧化是硫元素生物地球化學循環的重要過程。硫氧化菌作為硫元素循環中不可缺少的一部分，能利用硫氧化物獲取能量，并把低價硫化物氧化為硫酸鹽，同時產生大量氫離子，導致土壤酸化，嚴重影響土壤理化性質，尤其會促進土壤中重（類）金屬活性和遷移性，加劇重（類）金屬污染（楊濤濤等，2020）。

尾礦環境中廣泛存在硫氧化微生物，soxB基因驅動的硫氧化過程被認為是硫氧化的基本和原始分子機制，在硫氧化過程中具有重要作用（Ghosh et al.，2009）。soxB基因編碼硫酸鹽硫酯酶或硫水解酶亞基，這是硫氧化酶系的重要組成部分，與其他物質組成的酶復合體能催化硫單質、硫代硫酸鹽、硫化物進行氧化反應生成硫酸鹽（Meyer et al.，2010）。例如，soxB基因能編碼一種硫代硫酸鹽氧化多酶，其反應中心含有一個假錳簇，是Paracoccus pantotrophusGB 17氧化硫代硫酸鹽所必需的（Schneider et al.，1994）。因此，本研究采用分離純化技術從尾礦中成功分離純化得到 12株非冗余細菌，并結合 Box-PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術對 12株非冗余細菌的soxB基因進行鑒定。結果發現其中兩株細菌存在soxB功能基因片段，即Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2，表明 LJY-1和 LJY-2具有硫氧化潛能。據報道，Methyloversatilis是一種甲基營養生物，能從活性甲基化合物上將甲基催化轉移到其他化合物上，從而形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物（Chistoserdova et al.，2015）。Methyloversatilis存在于多種生境中，在華盛頓湖沉積物、火山口溫泉、活性污泥等環境中均被分離純化得到（Cai et al.，2011；Doronina et al.，2014；Smalley et al.，2015）。Methyloversatilis具有廣泛代謝能力，除甲醇和甲胺外，還能夠利用許多有機酸、醇和芳香族化合物（Zhang et al.，2015）。目前尚未有Methyloversatilis屬微生物具有硫氧化能力的相關報道，本研究首次發現Methyloversatilis屬中菌株具有硫氧化功能，這為菌株LJY-1應用于脫硫以及有機污染物轉化提供了重要理論基礎。此外，Limnobacter是一種能將硫代硫酸鹽氧化成硫酸鹽而進行化學異養生長的微生物（Spring et al.，2001）。盡管如此，本研究結果表明，LJY-2作為Limnobacter屬類菌株，具有硫氧化功能基因卻未表現出明顯的硫氧化性能，這可能與硫氧化實驗體系中未提供有機碳源，限制其生長發育有關。

為了進一步驗證LJY-1和LJY-2的硫氧化功能，本研究進行了硫氧化模擬實驗。結果發現，接種LJY-1的處理組中SO42?濃度快速增長，而接種LJY-2的處理組 SO42?濃度在整個周期內無明顯變化，說明在模擬試驗條件下，LJY-1具有快速將還原態硫氧化為硫酸根的能力。已有研究發現，Methyloversatilis在黃鐵礦尾礦、中性礦山排水、S2?自養顆粒污泥等環境微生物群落中均有分布（Kisková et al.，2018；Yang et al.，2018；Zhao et al.，2021），表明Methyloversatilis在環境中廣泛存在，且多出現于硫循環過程活躍的生態環境中。在本研究中，LJY-1菌株分離自錫礦山尾礦土，硫含量較高，證實Methyloversatilis可能對高硫環境具有良好適應性。

微生物硫氧化過程加快尾礦酸化。硫氧化微生物會在金屬硫化物表面附著并形成微生物膜，在礦物-微生物膜界面微環境中存在著強烈的微生物氧化和化學氧化作用，兩種氧化作用相互協同、共同促進，生成穩定硫酸鹽的同時還會產生大量酸性廢水（陸現彩等，2019）。對于采礦業來說，采礦增加了某些礦石暴露在空氣和水中的表面積，從而增加了產酸率（Baker et al.，2003）。硫氧化細菌通過協助分解硫化礦物會加速酸性礦山廢水的產生，進一步造成尾礦土壤的酸化（Akcil et al.，2006）。為此，有研究使用硫氧化細菌對鹽堿土進行改良，降低土壤 pH（張靜等，2009）。土壤酸化會促進尾礦土壤中重金屬和類金屬活性升高并進行遷移，甚至會破壞尾礦土壤微生物生態功能（Bolan et al.，2003）。由于礦石碎渣保水性較差，尾礦堆積一段時間后含水率降低，呈現濕潤狀態。本研究設置了兩組原位條件的模擬實驗，其中一組模擬新產生固液混合狀態的尾礦，另一組模擬堆放了一段時間含水率下降后濕潤狀態的尾礦。結果顯示，在硫氧化菌作用下，尾礦土壤在淹水狀態下的酸化速度更快，酸化程度更高?；诖?，礦石開采所產生的尾礦應盡早完成礦渣與廢液的分離，減緩土壤酸化，削弱重金屬污染物對周邊環境的不利影響。

4 結論

（1）以“世界銻都”錫礦山尾礦土為研究對象，在硫氧化條件下對原位微生物種群進行分離純化，成功獲得兩株具有硫氧化基因的純菌，分別為Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2。

（2）通過硫氧化驗證實驗，本研究首次發現了Methyloversatilis中的菌種具有硫氧化功能。

（3）基于硫氧化微生物原位條件模擬實驗，證實了Methyloversatilissp.LJY-1驅動的硫氧化過程，特別是在淹水條件下，會顯著加快尾礦酸化過程。