稀土礦區(qū)不同土地利用類型土壤細菌群落特征及網(wǎng)絡分析

楊賢房 ，陳朝 ，鄭林，萬智巍，陳永林，王遠東

1.江西師范大學地理與環(huán)境學院，江西 南昌 330022；2.廣東省科學院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所/廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650；3.華南土壤污染控制與修復國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510650；4.贛南師范大學地理與環(huán)境工程學院，江西 贛州 341000

細菌群落結構對植被變化十分敏感（Ji et al.，2020），植被通過影響土壤分泌物、溫度、水分、化學性質等影響細菌群落構建，同時特定功能細菌在植物根系中富集（Liu et al.，2020），對于土壤養(yǎng)分具有重要的指示作用（Creamer et al.，2016）。不同土地利用方式影響土壤的植被類型和理化性質，尤其在礦區(qū)周邊不同土地利用類型中，土壤植物類型不同，過度開采等人類活動所導致的環(huán)境變化，從根本上改變了土壤質量和養(yǎng)分循環(huán)，從而構建新的土壤微生物群（Mganga et al.，2016）。當前礦區(qū)不同土地利用類型微生物相關研究多集中在鉛鋅礦區(qū)（于方明等，2020）、銅礦區(qū)（黃健等，2019）等，而離子型稀土礦區(qū)周邊土地利用方式對細菌群落影響的研究較少。稀土礦山在長期開采、選冶等過程中造成了植被破壞，導致重金屬離子進入周邊土壤中，對周圍居民健康構成嚴重威脅（Romero-Freire et al.，2018；Wang et al.，2020），現(xiàn)有稀土礦區(qū)土壤環(huán)境問題治理研究多關注植被修復，研究表明，稀土開采對土壤細菌多樣性造成了顯著變化（王友生等，2017），不同植被修復模式下土壤質量存在明顯差異性（周彩云等，2019）,土壤修復后細菌多樣性有明顯的提高（陳熙等，2016），但植被恢復4年以后，土壤理化性質呈下降趨勢，細菌多樣性開始降低（李啟艷等，2019）。總體而言，已有研究多關注植被修復措施下土壤細菌群落的變化，而對礦區(qū)不同土地利用類型細菌群落特征及物種互作研究不多。當前，贛南離子型稀土礦區(qū)修復措施已由原來的單一植被修復發(fā)展為植被、果園、蔬菜等多種不同模式，基于此背景，了解稀土礦區(qū)內不同土地利用類型的細菌多樣性及群落結構差異，進而探索礦區(qū)土壤生態(tài)修復機理這一工作成為必要。此外，共現(xiàn)網(wǎng)絡常用來表達微生物的相互共存和排斥關系，并識別影響土壤功能的關鍵微生物（Banerjee et al.，2018），其中一些營養(yǎng)菌和植物病原菌等關鍵微生物類群影響著植物生長（Fan et al.，2020），對于土壤修復發(fā)揮著重要作用，共現(xiàn)網(wǎng)絡分析在稀土礦區(qū)生態(tài)修復中的應用，將為探究該過程中細菌生態(tài)功能提供重要幫助。

殘留在稀土礦區(qū)土壤中的SO42－和NH4+，隨著降雨、灌溉不斷向周邊擴散，導致水體銨態(tài)氮超標（師艷麗等，2020），土壤生態(tài)環(huán)境受到破壞。基于此，本研究運用高通量測序和網(wǎng)絡分析技術，分析礦區(qū)不同生境細菌多樣性及群落特征，目的在于：（1）分析稀土礦區(qū)不同土地利用類型理化性質、重金屬含量，探索細菌群落特征及其影響因素；（2）探究土壤中同銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、硫酸鹽等相關的功能細菌，研究結果可為離子型稀土礦區(qū)生態(tài)修復提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

樣品采集區(qū)為江西省龍南市足洞稀土礦區(qū)，年平均氣溫18.9 ℃，年降水量1526.3 mm，年蒸發(fā)量1064.2 mm，主要植被類型有百喜草、香根草、鐵線蕨和馬尾松等，取樣于2021年6月中旬進行，天氣晴朗，氣溫 33 ℃。裸地為礦區(qū)未修復地，以裸地為對照組，在礦區(qū)植被恢復區(qū)水稻田、草地、玉米地、蔬菜、果園、林地選取植物根際5—20 cm土層進行采集，每個采樣點分別取土5份，并將其混合均勻，合成一個樣品，每個土地類型設置一定數(shù)量的重復樣，其中水稻田3個、蔬菜地3個、果園3個、玉米地3個、林地3個，草地9個（包括鐵線蕨、百喜草、香根草）。此外，為了更好的提升裸地樣品的代表性，分別沿山地坡中、坡腳、尾水庫旁采樣，共采集土壤樣品14個(坡中3個、坡腳3個、沿尾水庫8個)，所有樣品共計38個。將采集樣品分為2份，并經(jīng)保溫處理后，一份送往深圳微科盟科技有限公司，另一份送往實驗室測定理化性質。

1.2 土壤理化性質測定

采用電位法測定土壤 pH值（土?水質量比=1?2.5）；用重鉻酸鉀容量法外加熱法測定有機質（OM）；全氮（TN）采用半微量凱氏定氮法測定；全磷（TP）采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定；有效磷用0.5 mol·L?1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤硝態(tài)氮（NO2-N）和銨態(tài)氮（NH3-N）分別采用KCl浸提-紫外分光光度法和KCl浸提-靛酚藍比色法。上述測定具體方法參見《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦，2000）。重金屬測試參考《土壤和沉積物王水提取金屬元素-電感耦合等離子體質譜法》（HJ 803—2016，中華人民共和國環(huán)境保護部，2016），測定8種重金屬元素（Cd、As、Cu、Pb、Cr、Ni、Zn、Mn）含量，采用內梅羅綜合污染指數(shù)評價重金屬污染情況。

式中：

PN——內梅羅綜合污染指數(shù)；

Ci——重金屬i的實測值；

Si——重金屬i的當?shù)乇尘爸怠?/p>

1.3 土壤樣品DNA提取和測序

按照Omega Bio-tek，Norcross公司E.Z.N.A.?soil DNA Kit試劑盒操作方法提取 DNA，對 16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增引物序列為338F和806R。將同一樣品的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用 AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)建庫檢測，將合格的文庫在IlluminaMiSeq（PE300）上進行測序。

1.4 細菌網(wǎng)絡構建及數(shù)據(jù)處理

基于屬水平測序結果，保留相對豐度占比>0.01%且在>20%樣本中出現(xiàn)的物種，參考相關文獻設置Spearman相關系數(shù)r≥0.6，顯著性P<0.05的閾值（Liu et al.，2020），構建耕地、植被、裸地3種土壤細菌網(wǎng)絡，利用Gephi軟件對網(wǎng)絡進行可視化。利用Pearson相關系數(shù)來確定土壤性質與細菌之間的關聯(lián)，通過冗余分析（RDA）研究理化性質對細菌群落結構的影響，通過火山圖分析不同土地利用類型間物種顯著性差異。

2 結果分析

2.1 土壤理化性質及重金屬含量

本研究中，不同土地利用類型土壤pH均為酸性，裸地的pH、全氮、有機質、全磷為所有用地最低，水稻田、果園、蔬菜地、玉米地全氮、有機質、全磷含量高于其他用地。林地、草地、裸地有效磷含量忽略不計（表1），水稻田、蔬菜地銨態(tài)氮含量大幅高于林地、草地，裸地、蔬菜地硝態(tài)氮含量高于水稻田、玉米地、果園等。不同土地利用類型均出現(xiàn)一定程度的重金屬污染現(xiàn)象，內梅羅綜合污染指數(shù)排序為草地 (4.75)>林地 (4.35)>果園(2.08)>水稻田 (1.71)>裸地 (1.61)>蔬菜地 (1.60)>玉米地 (1.57)。其中林地 Pb含量最高，為 191.11 mg·kg?1，是江西省背景值的5.95倍，其次為草地。草地Cd、As含量最高，Cd含量為背景值的6.3倍，As含量為背景值的5.04倍。蔬菜地Pb、Mn、Cd含量分別為背景值的2、1.7、1.4倍，水稻田Pb、Zn含量分別為背景值的2.26、1.24倍，玉米地Zn、Mn含量為背景值的1.42倍，Cu、Cr、Ni含量無超背景值，以上分析結果表明，不同土地利用類型土壤理化性質存在一定的差異。

表1 不同土地利用類型土壤理化性質分析Table 1 Analysis of soil physico-chemical properties of different land use types

2.2 細菌群落組成

不同土地利用類型細菌多樣性及群落結構差異較大（表2），其中Chao1指數(shù)排序為玉米地>蔬菜地>水稻田>果園>草地>林地>裸地，Shannon指數(shù)排序為玉米地>水稻田>蔬菜地>林地>果園>草地>裸地。優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria，25.4%—87.7%）、酸桿菌門（Acidobacteria，4%—43.3%）、放線菌門（Actinobacteria，3.1%—13.1%）。裸地 Proteobacteria比例最高（87.7%），其次為Actinobacteria、綠彎菌門（Chloroflexi），果園Acidobacteria占比最高（43.3%）。此外，在水稻田、果園、林地土壤 Chloroflexi占比分別為 8.7%、11.1%、6.7%，在蔬菜地、草地、玉米地擬桿菌門（Bacteroidetes）占比分別為10%、9.2%、6.2%。在屬水平上，較豐富的物種包括勞爾氏菌屬（Ralstonia）、產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）等，其中裸地Ralstonia豐度為10.1%，是裸地土壤主要菌屬，伯克霍爾德菌（Burkholderia）為裸地、果園、林地土壤優(yōu)勢菌屬（大于1%），地桿菌（Geobacter）為玉米地、水稻田土壤優(yōu)勢菌屬，硝化螺菌屬（Nitrospira）為蔬菜地土壤優(yōu)勢菌屬（圖1）。

圖1 不同土地利用類型土壤細菌群落組成Figure 1 Abundance of the bacterial community in soil under different land use types

表2 不同土地利用類型土壤細菌多樣性分析Table 2 Analysis of soil bacterial diversity in different land use types

由裸地、植被、耕地類土壤細菌豐度顯著差異比較分析可知（圖2），圖左側為豐度顯著下降物種，右側為顯著上升物種，相對裸地，植被、耕地類土壤Ralstonia豐度下降，Bradyrhizobium、Rhodanobacter、Kaistobacter豐度顯著上升。相較植被類土壤，耕地Ralstonia豐度顯著性下降，硫桿菌屬（Thiobacillus）、脫硫球莖菌屬（Desulfobulbus）、披毛菌屬（Gallionella）豐度顯著上升，其中草地和蔬菜地Rhodanobacter豐度分別為1.4%、2.0%，水稻田Thiobacillus豐度為1.6%、Desulfobulbus豐度為0.9%。

圖2 裸地、植被、耕地土壤細菌顯著性差異火山圖Figure 2 Bacterial volcanic map of bare land, vegetation and cultivated soil

2.3 細菌群落互作關系

基于裸地、植被（林地、草地）、耕地（蔬菜地、水稻田、果園、玉米地）測序結果構建生態(tài)網(wǎng)絡（表3、圖3）。結果顯示，植被、耕地類土壤細菌分子網(wǎng)絡平均連通度大于裸地，模塊數(shù)小于裸地，表明隨著土壤植物恢復，其網(wǎng)絡規(guī)模、復雜性均得到了提升，其中耕地節(jié)點數(shù)、連通度大于植被用地。相關性正負比例可以反映物種間共生或競爭捕食關系，3類用地細菌作用均以正相關為主，顯示不同土地利用類型細菌均以合作關系為主，其中負相關比例排序為耕地>植被>裸地。路徑長度可以反映物種間傳遞物質、能量效率高低，裸地路徑長度最大，耕地最小，表明耕地、植被分子網(wǎng)絡能量傳遞效率上升，細菌互作網(wǎng)絡對外界環(huán)境更為敏感。

圖3 不同土地利用類型細菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡Figure 3 Co-occurrence network of bacterial community under different land use

表3 生態(tài)網(wǎng)絡特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of the molecular ecological network

2.4 環(huán)境因子與細菌群落結構、多樣性相關性

通過 RDA分析了環(huán)境因子與細菌群落結構、多樣性相關性。在門水平上，土壤pH及土壤營養(yǎng)物質共解釋了細菌群落結構變化的73%，重金屬共解釋群落結構變化的61.72%。Ni、Cu、Pb是與細菌群落結構關聯(lián)性最大的重金屬因子，其中全氮、pH、Ni、Cu 同 Nitrospirae、疣微菌門（Verrucomicrobia）正相關，同 Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria負相關。

在屬水平上，全氮、pH同Bradyrhizobium負相關，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮同Rhodanobacter正相關，Ni、Cu同Rhodoplanes、Geobacter正相關（圖4、5）。土壤理化性質與細菌多樣性相關性結果顯示（表4），Ni、Cu、pH、全氮、有機質是與礦區(qū)土壤細菌多樣性關聯(lián)性最大的重要因子，與 OTUs數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)呈顯著以上正相關。

表4 土壤細菌多樣性與理化性質、重金屬含量相關性分析Table 4 Correlation Analysis of soil bacterial diversity with physico-chemical properties and heavy metal content

圖4 土壤理化參數(shù)與物種的非冗余分析（redundancy analysis，RDA）分析Figure 4 RDA of soil physico-chemical properties and species

圖5 重金屬含量與物種的非冗余分析（redundancy analysis，RDA）分析Figure 5 RDA analysis of heavy metal content and species

3 討論

3.1 稀土礦區(qū)土壤理化性質特征、重金屬與細菌多樣性相關性

不同生境土壤由于稀土開采、植被覆蓋、經(jīng)營管理措施等不同，可能導致土壤理化性質存在差異。從土壤pH看，礦區(qū)不同土地利用類型土壤pH均呈酸性，裸地、草地、林地等土壤pH低于其他用地，這可能是土壤中殘留浸礦劑向周邊土壤擴散，導致了土壤酸化，因林地、草地等樣地距離稀土開采點更近，所以其土壤酸化程度更高。從土壤營養(yǎng)物質含量看，蔬菜地、水稻田由于施肥等經(jīng)營措施，全氮、全磷、銨態(tài)氮等含量高于其他用地，林地、草地、裸地土壤全磷、有效磷含量明顯低于其他用地類型，李啟艷等（2019）對福建長汀離子型稀土礦區(qū)土壤研究也得出類似結論，有相關研究表明，土壤 pH值同有效磷含量顯著正相關（陳朝陽，2011），推測龍南稀土礦區(qū)土壤有效磷含量低同土壤酸化存在一定的關系。從土壤重金屬含量來看，礦區(qū)土壤存在重金屬Pb、Cd、As、Mn、Zn超過江西省背景值現(xiàn)象，劉勝洪等（2014）對廣東省河源市稀土礦區(qū)土壤重金屬開展了相關研究，發(fā)現(xiàn)Mn、Pb、Zn超過當?shù)乇尘埃噍^河源稀土礦區(qū)，龍南稀土礦區(qū)還存在Cd、As污染，其中裸地、草地、林地、蔬菜地Cd均存在不同程度污染。通常情況下，重金屬污染受距礦區(qū)空間距離、重金屬高背景值、植物類型、土壤營養(yǎng)物質等多方面影響，本研究中，草地、林地土壤樣品距離采礦點位置較近，受重金屬遷移和活化影響更大，可能導致其重金屬污染程度高于其他用地。與此同時，有研究表明龍南稀土礦區(qū)表層土壤具有重金屬高背景值特點（任仲宇等，2016），這可能是導致稀土礦區(qū)重金屬污染存在差異的重要原因。從重金屬與細菌多樣性相關性看，土壤 Pb含量與細菌多樣性關系并不顯著，王繼玥等（2018）發(fā)現(xiàn)，輕度Pb污染對三葉草根際土壤細菌多樣性影響不顯著。Cu含量與細菌豐度顯著性正相關，李大樂等（2021）研究銅濃度與細菌多樣性關系發(fā)現(xiàn)，當Cu濃度≤100 mg·kg?1時，隨著銅濃度增加細菌群落豐度和多樣性增加。礦區(qū)土壤Ni含量同細菌多樣性極顯著正相關，微量的 Ni能促進土壤微生物活動（王丙爍等，2018）。總體而言，由于龍南稀土礦區(qū)土壤重金屬多為輕度污染，重金屬污染并未對土壤細菌多樣性喪失造成顯著影響。

3.2 稀土礦區(qū)土壤細菌多樣性、群落結構差異及其影響因素分析

不同土地利用類型土壤細菌多樣性和群落結構均存在一定的差異。從土壤細菌多樣性方面來看，Chao1指數(shù)排序為耕地>植被>裸地，這同已有的研究結果存在一定的差異，張旭博等（2020）研究農(nóng)業(yè)土地利用方式對土壤微生物群落特征的影響發(fā)現(xiàn)，植被土壤細菌多樣性高于耕地，原因可能有以下幾點，一方面，本研究相關性分析結果顯示，pH與土壤細菌多樣性相關系數(shù)最大，草地、林地土壤pH約為4.5，且低于耕地土壤pH，這可能導致了耕地土壤細菌多樣性高于植被；另一方面，耕地全氮等含量均高于植被土壤，相關性分析顯示，全氮、有機質等與土壤細菌多樣性顯著正相關。從土壤細菌群落結構方面看，Ralstonia在裸地土壤中豐度相對較高，而在植被和耕地土壤中豐度顯著下降，該細菌是典型的植物病原菌，此前有研究發(fā)現(xiàn)，土壤磷含量較低會降低植物對病菌的抵御能力，導致植物病菌的豐度提升（楊尚東等，2013）。此外，從不同土地利用類型土壤細菌群落結構比較來看，相較裸地對照組，植被、耕地類土壤中Bradyrhizobium、Rhodanobacter、Kaistobacter、Rhodoplanes、CandidatusSolibacter菌屬豐度均顯著提升，綜觀相關文獻報道，這些細菌主要為植物促生、脫氮功能細菌，其中Bradyrhizobium為重要的固氮菌屬，能夠促進植物生長，且具備反硝化功能，Rhodanobacter為對低pH值、高硝酸鹽、重金屬具有耐受性的反硝化菌屬，Candidatussolibacter為能分解有機質、利用碳源的植物促生功能菌（Rime et al.，2015）。由上可知，植被和耕地恢復措施均能提升礦區(qū)土壤促生和反硝化功能優(yōu)勢細菌的多樣性，改變土壤細菌群落結構，土壤促生和反硝化功能優(yōu)勢細菌的多樣性增加，可對稀土礦區(qū)土壤生態(tài)修復起到一定程度的促進作用。

相較植被土壤細菌，耕地土壤Thiobacillus、Nitrospira、Desulfobulbus、Gallionella等硫循環(huán)功能微生物豐富度增加，其中Thiobacillus能將硫化物氧化成單質硫（Tang et al.，2009），Desulfobulbus是能使硫酸鹽化合物還原成硫化氫的常見菌（Hao et al.，2014）。稀土礦區(qū)原地浸礦反應完成后，大量 SO42－仍留存礦體中，隨地表徑流排入周邊河湖水體、土壤，形成硫酸鹽化合物。經(jīng)實測，本研究水稻田土壤 SO42－含量約為 250—300 mg·kg?1，礦區(qū)尾水庫兩側裸地 SO42－含量高達 3000 mg·kg?1，耕地土壤硫氧化還原功能優(yōu)勢菌屬多樣性更高，表明耕地修復措施具有更好促使硫循環(huán)的潛能。通常情況下，硫循環(huán)功能微生物多樣性主要受溫度、pH、海拔、有機質等多方面因素影響，該類功能細菌在中性條件或弱堿性條件下生長良好且能高效進行硫循環(huán)功能（Wang et al.，2011），pH偏酸性時，部分嗜堿菌株生長受到抑制。此外，有機質組分特征也是影響硫循環(huán)功能細菌群落差異的重要因素（陳俊松等，2020），總體而言，耕地土壤硫氧化還原功能優(yōu)勢菌屬的識別，對于稀土礦區(qū)土壤修復提供了重要信息。

土壤微生物之間以復雜的網(wǎng)絡共存或拮抗，不同土地利用類型物種共現(xiàn)網(wǎng)絡不同。本研究中，相較裸地土壤細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡，植被、耕地類土壤細菌網(wǎng)絡規(guī)模增加，網(wǎng)絡路徑長度減小。這可能是由于蔬菜、玉米等耕地氮、磷養(yǎng)分輸入，土壤營養(yǎng)物質含量增加，促進了富營養(yǎng)細菌繁殖，網(wǎng)絡規(guī)模增大。李冰等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，旱地、水田土壤的網(wǎng)絡規(guī)模要高于林地、城市綠地，重度富營養(yǎng)湖泊中分子網(wǎng)絡規(guī)模要高于中度湖泊（陳光哲等，2020），可見營養(yǎng)物質是影響物種共現(xiàn)網(wǎng)絡規(guī)模的重要因素。此外，耕地土壤細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡負相關比例高于植被、裸地，相關研究表明，在資源相對貧乏的區(qū)域，細菌更易增加合作來分解、合成難以利用的物質（Iliopoulos et al.，2008），林地、草地等植被土壤有效磷、全磷含量較低，這可能是影響礦區(qū)細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡負相關比例的重要因素。總體上，本研究通過分析不同土地利用類型的土壤細菌群落結構差異，識別了裸地、植被、耕地土壤的功能細菌，今后研究中應加強不同植被修復方式下酸性土壤解磷、硝化、硫氧化還原功能細菌研究，以其為稀土礦區(qū)生態(tài)治理提供參考。

4 結論

本研究分析了贛州市龍南稀土礦區(qū)不同土地利用類型土壤營養(yǎng)物質、重金屬含量特征，并利用高通量測序技術分析了土壤細菌多樣性及群落結構。研究發(fā)現(xiàn)，稀土礦區(qū)不同土地利用類型土壤pH值均呈酸性，裸地、林地、草地等有效磷含量較低，不同土地利用類型土壤Cd、Pb、As、Mn、Zn等重金屬含量超過背景值，內梅羅綜合污染指數(shù)排序為草地>林地>果園>水稻田>裸地>蔬菜地>玉米地。相較裸地，植被、耕地類土壤Ralstonia豐度顯著下降，Rhodanobacter、Bradyrhizobium和Kaistobacter等細菌豐度顯著上升。耕地土壤中Thiobacillus、Desulfobulbus、Gallionella等細菌相較植被土壤豐度更高，植被、耕地種植措施增加了土壤細菌網(wǎng)絡規(guī)模，減少了網(wǎng)絡路徑長度。銨態(tài)氮、全氮、有機質、pH、Cu、Ni等是影響礦區(qū)土壤細菌群落結構變化的主要因素，重金屬污染并未對礦區(qū)土壤細菌多樣性喪失造成明顯的影響。研究表明，相較裸地對照組，植被和耕地恢復措施均能提升礦區(qū)土壤促生和反硝化功能優(yōu)勢類細菌多樣性。耕地土壤中硫循環(huán)功能優(yōu)勢類細菌較植被土壤多樣性更高，不同土地利用類型土壤功能細菌的識別能對稀土礦區(qū)生態(tài)修復提供科學指引。