基于阻斷蛋白質相互作用的抗腫瘤多肽研究進展*

覃韋寧，谷春明，楊方紅，張河燕，楊恩澤，武福云，柯鏡

（湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000）

惡性腫瘤是臨床上常見的導致患者死亡的原因，目前癌癥治療包括手術、化療、放療、生物、激素治療等。然而，這些治療主要存在的問題是其昂貴的成本和副作用[1]。抗腫瘤肽因其具有多種優勢而得到了廣泛開發和應用。目前，從植物、動物及微生物中分離出了多種抗腫瘤活性肽，如罌粟花粉中分離的十三肽能夠抑制肝癌及乳腺癌細胞的增殖。茜草科植物寒丁子中分離的多肽RAVⅡ具有抗腫瘤活性，在日本作為抗癌藥已經進入臨床I期[2-3]。許多動物來源的多肽也具有很好的抗腫瘤活性，特別是海洋動物。如海綿和海鞘等的次生代謝產物，因其含有一些特殊的氨基酸，具有抗腫瘤活性[4]。除了天然的活性多肽，利用噬菌體展示技術及化學合成的多種多肽都被報道具有抗腫瘤作用[5]。多肽藥物具有多種優勢，如免疫原性低、受體結合率高、制備成本低且易于改造和聯合應用等，同時抗腫瘤肽又能通過多種機制發揮作用，如抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞壞死、抑制微管合成等[6-8]。目前，一種新的多肽藥物研發策略是阻斷蛋白質相互作用。因為大部分的蛋白質都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質形成復合物來發揮作用的。蛋白質相互作用幾乎在整個細胞生命活動過程中發揮功能，如DNA合成、蛋白質翻譯、信號轉導過程等，蛋白質相互作用構成了細胞生命活動及信號轉導的分子網絡。蛋白質相互作用異常導致基因表達異常、蛋白質功能異常及信號轉導異常，是多種疾病的發病基礎。因此，蛋白質相互作用已成為多種疾病治療的潛在靶點[9-10]。在腫瘤發生發展中，有很多經典的蛋白質相互作用發揮了重要作用，基于阻斷這些蛋白質相互作用的抗腫瘤多肽已經取得了極大的研究進展。

表1 抗腫瘤藥物的特性比較

1 阻斷P53-MDM2相互作用抗腫瘤肽

P53是一個重要的抑癌基因，參與多種細胞生命活動，如基因轉錄、DNA損傷修復、細胞衰老及凋亡等。大約50%的腫瘤中，P53基因發生了突變或缺失，從而失去了對細胞生長、凋亡及DNA修復的調控[11]。泛素化E3連接酶MDM2是P53最主要的負調控因子，通過N端與P53相互作用，使P53泛素化降解。目前，抑制P53-MDM2相互作用的一些小分子抑制劑，如Nutlins、MI-219，通過靶向MDM2 N端的P53結合位點，維持P53的穩定并激活P53信號通路，發揮了較好的抗腫瘤作用[12]。除此之外，基于阻斷P53-MDM2相互作用的抗腫瘤肽也得到了開發。PAZGIER等[13]利用噬菌體展示技術篩選到溶解度高且特異性強的抑制P53-MDM2相互作用的多肽PMI（TSFAEYWNLLSP）。LIU等[14]利用鏡像噬菌體展示技術（Mirror imagephage display）篩選出與MDM2分子鏡像對映體相互作用的Lpeptide配體，之后通過固相合成等手段合成出與篩選出來的L-peptide配體鏡像對應的D-peptide配體、DPMI-γ（DWWPLAFEALLR），D-peptide對目標分子的親和力與其對應篩選出的L-peptide與目標分子的親和力相同，但可以抵抗蛋白酶降解。這些多肽都能夠阻斷P53-MDM2相互作用，促進P53依賴的細胞死亡途徑有效激活，發揮抗腫瘤作用。

2 抗腫瘤肽靶向EGF，阻斷EGF-EGFR相互作用

表皮生長因子受體（EGFR或Her1/ErbB1）是ErbB細胞膜受體家族的4個成員之一，EGFR廣泛分布于哺乳動物細胞表面，通過其細胞外結構域結合配體發生構象變化，導致同型或異型寡聚化而被激活，從而參與細胞的增殖和分化[15]。表皮生長因子EGF是一種包含53個氨基酸的小肽，是EGFR的配體，通過與EGFR的特異性結合，并通過促進EGFR的二聚化和自磷酸化來啟動一系列信號級聯反應促進細胞增殖，如MAPK、Akt、JNK信號通路等。相關報道表明已在多種腫瘤中發現EGF和EGFR的異常表達及EGFR的突變，導致EGFR信號途徑過度激活。EGFR與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等密切相關，是腫瘤化療的重要靶點[16-17]。目前，針對EGFR的藥物有西妥昔單抗和帕尼單抗，通過與EGFR胞外結構域結合從而阻斷EGFR激活；以及小分子藥物吉非替尼和厄洛替尼，通過阻斷EGFR的自磷酸化從而阻斷下游的致癌途徑[18]。但是這些針對EGFR的藥物最大的問題是其副作用和產生的耐藥性。GUARDIOLA等[19]利用分子對接技術和EGFR受體熱點模擬技術設計并合成了一條EGF結合肽cp28（CQGTSNKLTQLGTFE DHFLSLQRMEFNNC），該多肽能夠與EGF結合從而阻斷EGFR與EGF的相互作用，并抑制乳腺癌細胞的增殖。這一研究為小分子蛋白的藥物多肽開發提供了基礎。

3 阻斷PD-1/PD-L1相互作用的腫瘤免疫治療肽

腫瘤免疫治療是一種新的腫瘤治療方法。目前，主要是通過抑制免疫檢查點來治療，其中較為有代表性的就是CTLA-4拮抗劑和PD-1/PD-L1抑制劑。CTLA-4是首個被發現的“免疫檢查點”，而PD-1/PD-L1被認為是目前腫瘤免疫治療最有希望的重要靶點。程序性細胞死亡受體1（PD-1）是一種在免疫細胞上表達的重要的免疫抑制分子，通過向下調節免疫系統對人體細胞的反應，以及通過抑制T細胞炎癥活動來調節免疫系統并促進自身耐受。PD-L1是PD-1的配體之一，在多種腫瘤細胞中過表達。PD-L1與PD-1的結合導致T細胞免疫抑制的激活，并誘導T細胞凋亡，使腫瘤細胞開啟免疫逃逸[20-21]。目前，靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點的藥物通過阻斷腫瘤細胞和T細胞結合，使T細胞能正常發揮作用，持續識別腫瘤細胞并清除。針對PD-1批準上市的單克隆抗體藥有Nivolumab和Pembrolizumab，適用于黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸鱗狀細胞癌等。而PD-L1的單克隆抗體抑制劑Atezolizumab、Durvalumab及Avelumab也已經被批準上市。盡管這些針對免疫抑制檢查點的抗體藥對部分腫瘤具有一定的療效，但隨后產生的耐藥性，及其高成本對免疫治療這一新興療法提出了挑戰。LI等[22]通過細菌表面展示技術，篩選到了具有高親和力且特異性結合PD-L1的多肽TPP-1（SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK），TPP-1多肽能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用，并使T細胞活化，體外裸鼠致瘤實驗表明該多肽具有抗腫瘤效應。LIU等[23]利用噬菌體展示技術結合一種新的生物篩選程序得到了能夠特異性結合PD-L1的CLP002肽（WHRSYYTWNLNT），該肽能夠特異性地結合PDL1與PD-1相互作用的殘基，并阻斷PD-1/PD-L1在腫瘤細胞中的相互作用，從而激活T細胞發揮抗癌作用。

4 靶向Bcl2-BH結構域，誘導腫瘤細胞凋亡多肽

Bcl-2是凋亡調節蛋白家族中起關鍵作用的成員，通過與其他凋亡蛋白相互作用，發揮細胞凋亡主開關的作用。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。Bcl-2蛋白具有4個BH結構域（BH1-4），這是大多數抗凋亡家族成員所特有的，而促凋亡家族成員僅具有BH1-3結構域（例如Bax和Bak）。另外一些促凋亡蛋白，如Bim則僅具有BH3結構域，充當激活Bax或Bak的前哨，進而通過透化線粒體外膜并釋放細胞色素c觸發細胞凋亡。Bcl-2通過結合這些促凋亡蛋白的BH3結構域形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡。Bcl-2蛋白在多種腫瘤中被發現表達升高，從而增加了腫瘤細胞的凋亡抗性[24-25]。目前，針對Bcl-2蛋白的癌癥治療藥物主要是模擬BH3結構域的小分子藥物，如ABT-737、ABT-263（Navitoclax）和ABT-199（Venetoclax），通過競爭性地抑制Bcl-2與促凋亡蛋白BH3結構域的結合，從而誘導腫瘤細胞凋亡[26]。除此之外，來源于促凋亡蛋白Bax、Bad、Bim等的BH3結構域的抗腫瘤多肽得到了大量的開發。除此之外，最新研究還開發了針對Bcl-2的BH4結構域的多肽來誘導腫瘤細胞凋亡。Bcl-2能夠通過其BH4結構域與肌醇1，4，5-三磷酸受體（IP3R）結合，抑制細胞內鈣離子濃度升高而發揮抗凋亡的作用。LAVIK等[27]合成了阻斷Bcl-2與IP3R相互作用的多肽BIRD-2（RKKRRQRRRGGNVYTEIKCNSLLPLAAIVRV），能夠誘導多種淋巴瘤細胞的凋亡，而且聯合模擬BH3結構域的小分子藥物ABT-263和ABT-199，腫瘤細胞凋亡效果更加明顯。

5 抑制離子通道活化的抗腫瘤肽

鈣庫調控的鈣通道Orai1與多種腫瘤密切相關，如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等。在腫瘤細胞內，Orai1蛋白的表達量明顯上調，鈣電流升高，鈣信號被異常激活，促進腫瘤細胞的侵襲遷移，影響細胞增殖，增加腫瘤血管生成。Orai1鈣通道的激活依賴于與內質網跨膜蛋白STIM1的相互作用。鈣離子信號與腫瘤細胞的發生發展密切相關，Orai1已經成為治療腫瘤的新的有效靶點[28]。但是，目前研究使用的Orai1鈣通道抑制劑，如2-APB和SKF-96365，并沒有特異性，在抑制Orai通道的同時，也會抑制其他一些鈣通道。我們課題組合成了與STIM1相互作用區域的Orai3-CT多肽，并偶聯了細胞穿透肽TAT，成功將TAT-Orai3CT多肽（YGRKKRRQRRRGGRSLVAHKTDRYKQELEELNRLQ GELQAV）導入乳腺癌細胞內，并阻斷了Orai1與STIM1的相互作用，抑制了細胞內的鈣內流，而且有效抑制了乳腺癌細胞的增殖[29]。

6 展望

目前，蛋白質相互作用已經成為了重要的抗腫瘤靶點，通過阻斷蛋白質相互作用從而抑制相關受體的過度激活、促進免疫細胞活化以及誘導細胞凋亡等，給腫瘤帶來了新的治療策略。很多針對蛋白質相互作用開發的小分子藥物取得了較好的療效，但特異性差及耐藥性是其主要問題。另外針對蛋白質相互作用開發的單克隆抗體應用到了臨床，但成本太高，其次開發難度大，很多蛋白質相互作用的表面比較大而且相對平坦，并沒有很好的抗體結合區域，因此這是單克隆抗體藥物開發的局限性，而小分子多肽則具有很大的優勢[30]。首先，針對蛋白質相互作用位點合成的多肽已被證明能夠有效阻斷蛋白質相互作用，發揮抗腫瘤作用；其次，抗腫瘤肽分子量小，易于侵入腫瘤細胞；再次，抗腫瘤肽易于合成，成本低，且免疫原性低，副作用小；最后，抗腫瘤肽靶向性好，而且可以通過納米藥物傳輸系統進行靶向釋放。但小分子多肽的主要缺陷是其不穩定性，易于降解。針對這一問題有兩種策略能夠提高多肽的構象穩定性。一種是通過環化作用，多肽可形成發卡結構、“訂書釘”肽等新的更加穩定的構象，另一種是通過修飾作用，將多肽鏈中參入D型氨基酸或者β氨基酸分別合成D型多肽和β型多肽，也可將多肽側鏈與氮原子相連，形成類肽。這些修飾的多肽能夠更加穩定且有效地阻斷重要蛋白之間的相互作用，從而發揮更好的抗腫瘤作用[31]。總之，基于阻斷蛋白質相互作用的抗腫瘤肽以其獨有的優勢在腫瘤治療中具有廣闊的前景。