生物鐘基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫調節中的作用研究進展*

李文強，張新晨

（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 普外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

生物鐘是生命的基本特征之一，普遍存在于多種生物中，從低等的細菌到真核的真菌、植物、動物到人類都存在生物鐘調控系統。哺乳動物的生物鐘由中樞生物鐘和外周生物鐘組成。中樞生物鐘位于下丘腦的視交叉上核，外周生物鐘存在于各種器官組織中。中樞生物鐘通過自主神經支配、體溫、激素信號和飲食來調控外周生物鐘。從分子水平上看，生物鐘系統是由一系列生物鐘基因組成，主要有生物鐘核心基因Bmal1、Clock、Npas2，負反饋基因Per1-3、Cry1-2，以及靶基因和 鐘 控 基 因Nr1d1、Nr1d2、RORα、Dbp、Tef、Nfil3等。隨著生物鐘研究的逐漸深入，生物鐘基因及蛋白在抗炎及免疫調節中的作用逐步被發現，本文簡單介紹生物鐘通路，并重點討論生物鐘基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫調節中的作用，以及針對Rev-erb和ROR靶向配體的研究及應用。

1 生物鐘通路

生物鐘系統是一個層次網絡[1]。這個層次的頂部是視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN），SCN位于下丘腦前部，接受光信息促進松果體褪黑激素分泌、腎上腺皮質酮釋放、調節體溫和睡眠-覺醒周期的節律，充當一個“指揮者”，為生物鐘系統提供主要的時間線索[2]。SCN通過神經元和體液信號同步機體大多數器官和組織細胞中運作的局部時鐘振蕩器，影響全身晝夜生理學和行為[3]。

在細胞水平上，生物鐘的基因和蛋白以轉錄-翻譯反饋回路表達，周期約為24 h。第一個生物鐘反饋調節機制：Bmal1和Clock形成一個異二聚體，激活Per1、Per2和Cry1、Cry2的轉錄，當Per和Cry蛋白到達關鍵值時抑制Bmal1-Clock二聚體對自身基因的激活以結束這個循環。在Per和Cry蛋白降解后再次開始一個新的晝夜循環，重新開始Bmal1-Clock介導的轉錄激活[4]。第二個生物鐘反饋調節機制：Bmal1-Clock異二聚體轉錄控制啟動子序列中含有E-box元件的核激素受體Rev-erbα（Nr1d1）、Reverbβ（Nr1d2）及RORα、RORβ和RORγ，轉錄出RORs蛋白和Rev-erbs蛋白在Bmal1基因的啟動子序列中競爭結合ROR元素（RORe）。RORs蛋白的結合增加Bmal1的轉錄，Rev-erbs蛋白的結合能抑制這種反應[5]，由于表達模式及靶基因的大量重疊，Rev-erb和ROR通常參與調節相似的生理過程。

2 Rev-erb在抗炎及免疫調節中的研究

2.1 Rev-erb通過調節炎癥因子表達發揮抗炎作用

有研究[6]發現，Rev-erb過表達抑制與類風濕關節炎相關的炎癥因子IL-6、TNF-α、CCL-2和MMP-9的表達。有動物實驗[7]發現Nr1d1-/-小鼠中Cx3cr1和MMP-9 mRNA表達升高，而Rev-erbα過表達促使Cx3cr1和MMP-9 mRNA表達下降。在巨噬細胞中，Rev-erbα通過結合小鼠CCL-2啟動子中的近端元件下調CCL-2的表達[8]，從而介導水泡性口炎病毒誘發腦炎模型中病毒感染的晝夜敏感性[9]。Rev-erbα能夠與組蛋白脫乙酰酶3（HDAC3）結合，并與DNA的一個由HDAC3和核受體輔助抑制因子（NCOR）組成抑制復合物，負性調節IL-6等炎癥因子的基因表達[7]。綜上所述，Rev-erb作為多種炎癥因子的負性調節因子發揮抗炎作用。

2.2 Rev-erb通過抑制NFκB/Nlrp3發揮抗炎作用

Rev-erbα在體外和體內調節小膠質細胞激活，Rev-erbα功能喪失促進體內自發性神經炎癥和神經元功能障礙。研究[10]發現，小鼠海馬中Rev-erbα缺失導致小膠質細胞免疫反應性的節律被破壞，并使腦小膠質細胞鎖定在促炎狀態；染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗表明，Rev-erbα與NF-κB信號傳導轉錄物的啟動子區域相互作用，Rev-erbα缺失導致培養的小膠質細胞和小鼠海馬中的促炎性NF-κB活化。在Raw264.7細胞熒光素酶報告分析、電泳遷移率轉移分析（EMSA）和芯片序列中，Reverbα與p65啟動子中的REV反應元件直接結合降低總胞漿和核p65水平[11]。Rev-erbα還通過與NLRP3和IL1b的啟動子區域結合，負調節NLRP3炎癥小體的表達[12]。在Nr1d1缺陷小鼠和人巨噬細胞中發現NLRP3的表達及其復合物的激活與Nr1d1的表達呈負相關，隨時間變化，在深夜達到高峰，Reverbα激活可抑制LPS誘導的急性腹膜炎和肝炎的NLRP3炎癥途徑[12]。抑制NF-κB/NLRP3軸可能是Rev-erbα介導抗炎的一種機制。

2.3 Rev-erb通過誘導巨噬細胞分化發揮抗炎作用

Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬細胞結合位點的全基因組分析顯示，這些受體參與了復合物靶基因的調控，提示Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬細胞中起重要作用；巨噬細胞能夠極化成具有不同表型和生理功能的促炎M1或抗炎M2狀態。敲除造血細胞中的Nr1d1，然后將骨髓移植到LDL受體（LDLR）無效的小鼠中，發現這些小鼠的動脈粥樣硬化斑塊增加，但脂質水平未受影響[7]。這種作用源于巨噬細胞功能的改變，Rev-erbα的過表達導致巨噬細胞轉錄水平降低[6]及抗炎M2巨噬細胞水平的升高[13]，進而發揮抗炎作用。

2.4 Rev-erb通過抑制Th17細胞發育發揮抗炎作用

Rev-erbα與Th17細胞中的RoR反應元件結合，抑制包括RoRγ在內的依賴于RoRα的基因表達。研究發現，提高Rev-erb mRNA的表達或用合成的Rev-erb激動劑治療可通過降低Th17細胞水平，顯著延緩實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發生、發展[14]。相反，Rev-erbα丟失則導致CD3+T細胞Nfil3的表達升高，進而使RORγT細胞誘導IL-17表達并促進Th17細胞的發育[15]。這些結果提示，抑制自身免疫性疾病中的Th17細胞分化發育可能是Rev-erb發揮抗炎作用的一種機制。

2.5 Rev-erb蛋白通過穩定性的動態變化發揮炎癥調節作用

Rev-erb蛋白在抑制未受挑戰的細胞內源性促炎機制中發揮動態平衡作用。其中，Rev-erbα起主導作用。在炎癥反應的形成過程中，促炎細胞因子通過SUMO化和泛素化，引起Rev-erbα蛋白穩定性顯著變化和降解增加。炎癥信號促進Reverbα的降解提供了一條新途徑來解釋慢性炎癥疾病中的晝夜節律破壞與先天免疫間的聯系，增加Rev-erb蛋白穩定性藥物的研究可能為一種新型抗炎途徑[16]。

2.6 Rev-erb依賴其DNA結合域發揮抗炎作用

清除小鼠支氣管上皮細胞中的Rev-erbαDNA結合域后，支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞反應顯著[16]。這表明Rev-erbα的另一種抗炎作用依賴于其DNA結合域。

3 ROR在抗炎及免疫調節中的研究

3.1 ROR通過調節炎癥因子表達發揮抗炎作用

RORα缺乏的小鼠（RORα-/-）存在嚴重的共濟失調神經元表型，其支氣管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和巨噬細胞炎癥蛋白-2（MIP-2）水平較高，氣管內滴注脂多糖（LPS）后更易致死[17]。RORα在淋巴細胞發育中起關鍵作用，RORα-/-小鼠由于B細胞和T細胞間室發育嚴重缺陷導致脾臟和胸腺細胞生成減少，在T細胞依賴性抗原免疫中，CD8型T細胞在T細胞受體刺激和IgG水平升高后表現出IFN-γ增加。RORα-/-小鼠肥大細胞和巨噬細胞中TNF-α和IL-6表達增加，表明RORα以亞群特異的方式作為炎癥細胞因子的負調節因子[18]。

3.2 ROR通過上調IκBα發揮抗炎作用

RORα還被證明與IκBα——B細胞抑制物α中Kappa輕多肽基因增強子的核因子、啟動子區域的ROR元件結合，上調IκBα轉錄，抑制NF-κB信號途徑，進而導致p65核移位減少和靶基因轉錄減少[19]。因此，RORα負性調節細胞因子誘導的炎癥反應。

3.3 ROR通過誘導巨噬細胞分化發揮抗炎作用

巨噬細胞中的RORα保持靜息、非激活狀態，防止早期先天性免疫反應[18]。在巨噬細胞中過表達RORα，可以通過激活磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）增加M2巨噬細胞標志物（Arg1、YM1和Fizz1）基因和蛋白的表達，進而誘導巨噬細胞向M2極化，這可能為RORα的一種抗炎機制[20]。

3.4 ROR通過促進Th17細胞發育發揮促炎作用

Th17細胞產生IL-17細胞因子，并在多發性硬化癥等自身免疫性疾病中激活炎癥反應；Th17細胞的分化依賴于視黃酸受體相關的RORγt[14]。在原始CD4 T細胞中RORγt的過表達驅動誘導Th17細胞的發育，抑制ROR-γt和ROR-α的表達，從而抑制Th17細胞的分化[21]。與之前所述作用相反，ROR可通過促進Th17細胞發育分化發揮促炎作用。

ROR在抗炎及免疫調節中發揮著重要作用，但在具體炎癥疾病中發揮的是抗炎還是促炎作用，仍需進一步研究。

4 合成的Rev-erb配體研究

4.1 Rev-erb激動劑：GSK4112

1，1-二甲基乙基N-[（4-氯苯基）甲基]-N-[（5-硝基-2-噻吩基）甲基]甘氨酸鹽是第一個合成的Rev-erb靶向配體。最初命名為SR6452，隨后被更名為GSK4112。GSK4112是從熒光共振能量轉移生化篩選中鑒定出來的。在熒光共振能量轉移生化篩選中，GSK4112以濃度依賴的方式增加NCOR肽與Rev-erbα的結合。GSK4112增加核受體輔助抑制因子（NCOR）向Bmal1啟動子的募集[22]，同時增加HDAC3募集到G6PC啟動子，這可以作為GSK4112對Rev-erb基因作用的一種機制。GSK4112能調節晝夜節律中涉及的幾個關鍵基因的水平，可作為一種潛在的調節晝夜節律的藥物[22]。在巨噬細胞中，GSK4112在LPS誘導的內毒素休克中可以減少人巨噬細胞IL-6的釋放、降低促炎細胞因子和趨化因子CXCL-11、CCL-2、CXCL-6和IL-19 mRNA的表達[23]。在星形膠質細胞中，使用GSK4112可顯著阻斷腫瘤壞死因子誘導的CCL-2 mRNA和MMP-9 mRNA的上調，均表明GSK4112具有抗炎作用[24]。GSK4112在腹腔給藥后沒有良好的藥代動力學曲線，在Rev-erb激動方面作用較弱，這限制其作為體內研究Rev-erbs功能的應用[25-26]。

4.2 Rev-erb激動劑：SR9009、SR9011

SR9009和SR9011以GSK4112為初始架構，改善了功效和藥代動力學特性（增加全身暴露）。SR9009和SR9011是Rev-erbα和Rev-erbβ的雙重合成激動劑，其效能是GSK4112的3～4倍，在驅動Rev-erb方面更有效。研究[27]發現當Rev-erbα表達達到峰值（即在睡眠期的中間）時，給小鼠進行兩種化合物的腹腔給藥都會導致小鼠清醒后車輪轉動活動的喪失；此外，這兩種化合物都能影響晝夜節律幾種核心時鐘基因在小鼠下丘腦的表達改變，包括Cry2的抑制，Per2的增強，Bmal1表達的相移和Npas2晝夜表達模式的消除。這表明SR9009和SR9011通過調節Rev-erb活性對晝夜節律振蕩器產生影響。

SR9009或其他人工合成Rev-erbs激動劑可抑制IgE和IL-33介導的肥大細胞激活，并抑制Gab2/PI3K和NF-κB途徑。因此，通過合成Rev-erb激動劑對Rev-erb活性的調節可能對廣泛的過敏性疾病有潛在的作用[28]。使用SR9009刺激動脈粥樣硬化模型小鼠骨髓源性巨噬細胞，可以降低骨髓源性巨噬細胞向促炎M1巨噬細胞的極化，同時增加其向抗炎M2巨噬細胞的極化，這表明Rev-erbs的藥理學靶向可能是治療動脈粥樣硬化的一種可行選擇[29]。SR9009治療后，心肌梗死模型小鼠炎癥因子IL-6、Mcp1、Ly6g、CD11b、MMP-9 mRNA表達及磷酸化NF-ERKBp65、磷酸化κ、磷酸化p38蛋白表達均明顯下降，中性粒細胞浸潤程度明顯降低。這表明，SR9009治療是通過調節炎癥和重塑過程改善心功能，減少心肌梗死的死亡率[30]。

4.3 Rev-erb拮抗劑：SR8278

SR8278是目前為止唯一一種Rev-erb合成拮抗劑。在基于Gal4的共轉染報告實驗及由3個Reverb啟動子驅動的全長Rev-erbα熒光素酶報告實驗中，SR8278提高了Rev-erbα和Rev-erbβ的靶基因活性，包括Bmal1、PCK和G6PC，用SR8278處理HepG2細胞可以增加G6PC和PCK的表達[31]。進一步研究發現GSK4112通過激活Rev-erbα刺激葡萄糖誘導的MIN-6小鼠胰島素瘤細胞中的胰島素分泌，SR8278能抑制GSK4112發揮作用[32]。SR8278對Rev-erb活性調節有一定作用，但在免疫調節中的研究仍較少。

5 合成的ROR配體研究

5.1 RORα和RORγ反向激動劑：SR1001

SR1001的發現和報告證明ROR配體可用于探索ROR在小鼠疾病模型中的作用[33]。SR1001抑制RORα和RORγ基因活性，降低受體和共激活劑之間的相互作用。使用SR1001治療動脈粥樣硬化模型小鼠，誘導了一種抗動脈粥樣硬化的免疫模式，其特征是Th17細胞減少，Treg和Th2細胞增加[34]。這種抑制與IL-17A細胞因子的表達下調相關[35]。TH17細胞可能是1型糖尿病發展的病理因素，SR1001減少了促炎細胞因子的表達，特別是TH17介導的細胞因子，減少了自身抗體的產生，并增加了CD4+Foxp3+T調節細胞的頻率，使用針對該細胞類型的ROR特異性合成配體可能會成為一種治療1型糖尿病的新方法[36]。

5.2 RORγ反向激動劑：SR2211

SR2211是一種在生化和細胞的測定中對RORγ顯示出優于RORα的精確選擇性的化合物。在EL-4細胞中，SR2211抑制IL-17a和IL-23R的表達，以及下調細胞內IL-17蛋白水平，并抑制TH17細胞分化[37]。動物實驗[38]顯示SR2211在膠原誘導的類風濕性關節炎模型小鼠中具有活性，通過腹膜注射SR2211，2次/d，持續15 d，能顯著減少模型小鼠的關節炎癥。

6 小結

生物鐘基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫調節中發揮重要作用，其通過影響炎癥因子、炎癥通路及免疫細胞的表達調節機體免疫反應。目前Rev-erb和ROR的人工合成配體也越來越多，其在免疫調節及相關疾病的治療潛力已經在免疫相關疾病的動物模型中得到一定證明。未來，進一步改進和優化配體有可能會應用于自身免疫相關疾病的治療。改善這些人工合成配體藥物性質的研究已經取得一定進展，其中一些改進的人工合成配體或其類似物在不久的將來極有可能進入臨床試驗階段。