臨床分離外耳道致病性黑曲霉生長特性研究*

郭艷玲，王艷麗，馬文鵬,3，陳 鴿，曾夢妮，劉成程

1.渭南市第二醫院檢驗科，陜西渭南 714000；2.渭南市第一醫院檢驗科，陜西渭南 714000；3.西安交通大學基礎醫學院病原微生物與免疫學教研室，陜西西安 710061

外耳道真菌感染是一種表現為耳癢、耳溢液、耳痛等癥狀的耳部疾病[1]。常見致病真菌有曲霉菌、念珠菌、毛霉菌、青霉屬，主要以曲霉菌感染為主，其中黑曲霉感染較為常見[2-3]。近年來，隨著糖皮質激素以及抗菌藥物的不規范應用，真菌感染日趨增多，實驗室診斷變得尤為重要。目前實驗室快速檢測黑曲霉已經應用到質譜和DNA序列分析等技術，然而，形態學鑒別還是真菌檢測的主要檢驗方法[4-5]。本文將從實驗室黑曲霉生長特性等方面進行闡述，以期為實驗室檢查提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料來源 黑曲霉標準菌株ATCC16404(簡稱“S”)來源于北京生物保藏中心。黑曲霉臨床菌株(簡稱“C”)，分離自渭南市第二醫院兩例耳道真菌病患者的外耳道分泌物，均通過質譜儀鑒定為黑曲霉，分別標示為C1、C2，見圖1。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)來源于青島高科技工業園海博生物技術有限公司；血瓊脂培養基(BAP)、沙保羅瓊脂培養基(SDA)和普通巧克力瓊脂培養基(CA)來源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

注：箭頭代表鏡下菌株菌絲；a～c分別為C1菌株在鏡下、BAP、SDA的形態；d～f分別為C2菌株在鏡下、BAP、SDA的形態。

1.2儀器與試劑 微生物質譜檢測系統購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；微生物培養箱購自天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司；革蘭染色液、乳酸酚棉蘭染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1顯微鏡下形態觀察 本研究采用插片培養觀察法，將孢子接種到培養基的中間，然后用小鑷子夾起一塊無菌蓋玻片，以45°的角度斜插入培養基中，待培養72 h后，用小鑷子將蓋玻片取出后轉移到滴有無菌生理鹽水的載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子及菌絲的形態。另外，對培養72 h的菌落用透明膠帶從菌落頂部粘取一定量的菌絲，粘在預先滴加乳酸酚棉蘭染色液的載玻片上，然后在顯微鏡下觀察頂囊孢子和菌絲的形態特征。

1.3.2菌落形態觀察 參照文獻[6]中孢子懸液的制備方法，從復蘇、分離好的3株黑曲霉中取適量孢子加入無菌生理鹽水中充分振蕩混勻，分別通過4層無菌紗布過濾后，用牛鮑計數板計數，制備成1×103個/毫升的3種孢子懸液。將已制備好的孢子懸液用振蕩器充分混勻，分別取1 μL孢子懸液接種在SDA、PDA、BAP和CA上，將接種好的培養基分別置入25 ℃和35 ℃的培養箱，培養72 h，觀察3株菌在不同培養基上的菌落形態。

1.3.3生長曲線檢測及菌落生長特征 在培養后的12、24、36、48、60、72、84和96 h觀察記錄兩組溫度下不同培養基上的菌落直徑、菌絲密度、菌落顏色出現變化時間、菌落黑色顯色區范圍和顯色區密度。

2 結 果

2.1顯微鏡下形態特征 在35 ℃條件下采用插片法培養72 h后，濕片顯微鏡(×40)下可見菌絲體、分生孢子頭和分生孢子，分生孢子頭為黑褐色，菌絲透明有隔膜，見圖2a、2b；乳酸酚棉蘭染色顯微鏡下可見頂囊球形或近球形，雙層小梗布滿頂囊，?；史派錉?，形似菊花，分生孢子呈球形表面粗糙有小刺，菌絲透明有隔膜，見圖2c、2d。

注：a、b為濕片顯微鏡(×40)下黑曲霉分生孢子頭、產孢子結構形態；c、d為乳酸酚棉蘭染色后顯微鏡(×40)下黑曲霉分生孢子頭、菌絲體形態。

2.2菌落形態特征 黑曲霉在35 ℃培養72 h后，可見黑色厚絨毛放射輪狀菌落生長。而且PDA比SDA上菌絲致密，孢子密度大，但是在SDA上生長速度最快，菌落直徑和產孢子直徑最大，見圖3。3株菌在PDA和SDA的背面形態有明顯不同，在SDA的背面產生大量褶皺，無色或呈黃褐色，72 h后褶皺更加明顯，但PDA的背面產生少量褶皺，見圖4。

注：a、b、c分別為S、C1、C2在35 ℃培養72 h后不同培養基上的菌落形態。

注：a、b、c分別為S、C1、C2在35 ℃培養72 h后SDA和PDA背面的菌落特點。

2.3生長曲線檢測 3株黑曲霉在25 ℃和35 ℃培養12 h，4種培養基上均無肉眼可見的菌落生長。25 ℃培養到36 h才出現菌落生長；35 ℃培養24 h，在4種培養基上均出現肉眼可見的菌落生長。隨著培養時間的延長，不同培養基上的菌落生長差異逐漸明顯。對兩種溫度的菌落生長曲線對比發現，在35 ℃培養條件下，菌落直徑更大，生長速度更快，見圖5。

注：注：a、c、e為菌株S、C1和C2在25 ℃培養條件下不同培養基上的生長曲線；b、d、f為菌株S、C1和C2在35 ℃培養條件下不同培養基上的生長曲線。

2.4菌落生長特征 35 ℃培養96 h后觀察發現，3株黑曲霉在4種培養基上生長有明顯不同的結果。該3株菌在SDA上的菌落直徑最大，平均生長速度最快，其次為PDA、BAP和CA；在菌絲密度和孢子顯色密度方面，PDA最為濃密，其次為SDA、BAP和CA；在PDA和SDA上生長36 h出現顏色變化，時間早于BAP和CA；在SDA上黑色顯色區范圍最大，其次為PDA、BAP和CA，見表1。

表1 黑曲霉在35 ℃培養96 h后的菌落生長特征

3 討 論

本次研究選用的培養基為臨床實驗室常用的4種培養基。PDA常用于真菌及曲霉菌的鑒定，SDA多用于常規真菌的培養，BAP和CA為一般細菌生長基礎培養基。不同的培養基成分不同，PDA是由20.0 g葡萄糖、6.0 g馬鈴薯浸粉和20.0 g瓊脂組成，其為黑曲霉的生長提供碳源；SDA是由20.0 g葡萄糖、20.0 g瓊脂、蛋白胨(主要以多肽、氨基酸為主，并輔以生物素、微量元素等)和氯霉素組成，含有真菌生長的碳源和氮源。在本研究中，黑曲霉在PDA上的菌落生長范圍、平均生長速度以及孢子黑色顯色區范圍均不及SDA，但菌絲密度和孢子密度大于SDA；BAP和CA因不含真菌生長的糖類，其成分單一，所以黑曲霉在這兩種培養基上生長緩慢。

黑曲霉在4種培養基上均可生長，對培養條件要求不高。SDA中的葡萄糖為黑曲霉生長提供所需的碳源，蛋白胨為黑曲霉生長提供氮源，其中，葡萄糖是黑曲霉生長的最好碳源，徐和平等[7]研究顯示，增加葡萄糖的含量可以加快黑曲霉的生長速度，但在葡萄糖含量相同的情況下，SDA與PDA相比，PDA中的馬鈴薯浸粉僅僅為黑曲霉提供了可溶性淀粉，然而，SDA還含有蛋白胨，其為黑曲霉提供豐富的氮源[8]。氮源是菌體合成氨基酸、蛋白質和細胞質的主要成分，也是合成各種含氮代謝產物的重要原料。唐詩潮等[9]研究發現，在培養基其他成分不變的情況下，加入固定量的氮源如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等，可顯著加快黑曲霉的生長速度，酵母膏為黑曲霉生長最適氮源，其次為蛋白胨，這與本研究結果相符，在富含蛋白胨的SDA上黑曲霉生長速度比PDA快。正如劉夢涵等[10]研究結果顯示，菌體生長階段氮源需求大，產孢子階段氮源的需求量遠大于碳源的需求量，由此可見黑曲霉在SDA上菌體生長迅速，產孢子范圍最大。

溫度是影響微生物生長的重要因素之一，在臨床微生物標本的培養過程中提供一個穩定且合適的溫度環境是必不可少的。黑曲霉生長的最適溫度范圍為24～37 ℃。有研究顯示，黑曲霉在30、35、40和45 ℃等溫度環境下培養，在35 ℃培養溫度下黑曲霉的生物量和催化活力最大[11]。本研究發現，3株菌在相同的培養基上，在35 ℃的培養環境中生長迅速，其菌落顏色變化的時間早于25 ℃培養環境。菌落顏色的變化代表著黑曲霉的成熟度，菌落顏色變化早說明成熟早，相反，則成熟晚。黑曲霉在35 ℃培養環境下成熟早于25 ℃培養環境[12]。由此可見，35 ℃培養環境可促使黑曲霉的快速生長，縮短培養時間，為臨床診斷黑曲霉感染提供最迅速的診療依據。

綜上所述，對于臨床微生物實驗室分離致病性黑曲霉，選擇碳源和氮源豐富的SDA以及35 ℃培養環境，縮短培養時間，可為臨床診療節省時間。