基因芯片和高分辨率熔解曲線在結核分枝桿菌檢測中的應用分析

龍麗娟，張冬青，趙 嬌 綜述，王海濱 審校

解放軍總醫院第四醫學中心檢驗科，北京 100048

結核病是人類尚未克服的難題，近年來，越來越多耐藥菌株的出現更加引起了人們對結核病的重視。目前結核分枝桿菌最常用的檢測方法為抗酸染色和羅氏培養法，這些方法雖然成本低廉，但靈敏度低，對結核病的診斷不夠及時、靈敏，不能滿足臨床對結核病診治的需求。傳統的PCR技術不能對結核分枝桿菌進行分型和耐藥性檢測，后續仍需進行復雜的生化實驗。而基因芯片技術和高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術從基因的角度出發，在菌種鑒定和耐藥性檢測上都更直接地反映待測標本的菌株信息，兩者因其檢測速度快、特異度高而引起了廣泛關注，本文就二者在結核分枝桿菌檢測中的應用進行對比分析。

1 基因芯片技術

1.1基因芯片概述 基因芯片技術是利用堿基互補配對原則，將結核分枝桿菌基因組中具有特異性的片段固定于固相載體上，片段的選擇一般為保守片段。針對不同的基因，人工合成不同的寡合苷酸片段作為靶基因，標記有熒光分子待測標本擴增后的產物與基因芯片雜交，根據目的基因標記的熒光數量不同，熒光掃描儀檢測到的熒光信號強度不同，即可對擴增產物進行分析。基因芯片技術具有高特異度、高通量、高效率等特點[1]。

1.2基因芯片在結核分枝桿菌菌種鑒定上的應用 目前臨床常用的結核分枝桿菌菌種鑒定的方法為分離培養后進行藥敏試驗，該方法耗時長、步驟繁瑣，不利于陽性標本的及時檢出以及及時指導臨床用藥。而基因芯片技術因其高通量、高特異度的特點，能及時對臨床標本進行菌種鑒定、分型以及耐藥性檢測，對治療有著重要的指導作用。有研究表明，目前的基因芯片檢測系統可以檢測17種結核分枝桿菌，檢測時間一般為6～8 h，可檢測的標本類型包括痰液、膿液、引流液、尿液、胸腔積液、穿刺物等，這些標本均不需要進行結核分枝桿菌的培養[2]，可直接進行檢測，但不同標本的陽性率有差異，其中以手術過程中的洗肉水檢出率最高，其次依次為穿刺液、膿液、組織、引流液、痰液等[3]，這就要求臨床需根據結核分枝桿菌不同的感染部位進行標本的取樣，如對無菌體液標本的量有一定要求，一般為5～10 mL。有研究表明，目前基因芯片技術對結核分枝桿菌復合群的鑒定成功率可以達到100%，對非結核分枝桿菌的鑒定成功率達95%，對結核分枝桿菌的快速鑒定有重要意義[4]。

1.3基因芯片在結核分枝桿菌耐藥性檢測中的應用 目前臨床最常用的抗結核病藥物為利福平和異煙肼，基因芯片技術針對結核分枝桿菌對這兩種藥的耐藥基因進行檢測，主要是利福平的耐藥基因rpoB和異煙肼的耐藥基因KatG和inhA[5-7]。以待測標本分離出來的結核分枝桿菌為模板，以耐藥基因的保守序列設計引物及寡合苷酸探針，在引物的末端標記有熒光分子，帶有熒光探針的擴增產物與基因芯片上的探針根據堿基互補配對原則進行雜交，根據熒光信號的不同即可推斷檢測標本的耐藥信息。有研究表明，絕大部分利福平的耐藥基因rpoB存在不同部位的突變，傳統檢測方法不能確定其突變位置，因此限制了其在臨床中的應用[8]。而異煙肼的耐藥基因KatG均為特定位點的突變，因此從分子水平上更容易檢出，從而獲得耐藥株的耐藥信息，目前實驗檢測出的最常見的異煙肼耐藥基因為katG315和inhA-15[9]。但也有研究證實，由于異質性耐藥菌的存在，基因芯片技術無法確定其是否存在katG突變，需要借助測序技術[10]。實驗表明，目前的基因芯片技術可檢測出rpoB 6個位點的野生型和13個突變型，katG 1個位點的野生型以及inhA基因啟動子區的野生型和突變型[9，11]。因此可以看出，基因芯片技術并不能檢測出結核分枝桿菌全部的耐藥基因型，所以它并不能完全替代傳統的藥敏試驗，但因其靈敏度和效率高，可作為傳統藥敏試驗的一種補充手段，尤其是對利福平和異煙肼耐藥的菌株的檢測[12]。

1.4基因芯片在結核分枝桿菌檢測中的缺陷 實驗研究數據表明，基因芯片檢測出的耐藥信息與傳統藥敏試驗檢測出的耐藥信息有一定的差異，部分菌株表現為藥敏試驗耐藥而基因芯片敏感[13]，導致這種差異的原因分析如下：(1)基因芯片技術檢測的位點有限，它主要針對的是保守片段，因此對于部分耐藥基因片段，因其缺少相應的檢測位點而表現為敏感[14]。(2)因為兩種檢測方法檢測的菌株來源不同而造成差異，一般藥敏試驗的對象為臨床分離培養后的純菌落，而基因芯片技術直接檢測標本中的耐藥菌，因二者耐藥菌的濃度有差異而表現出不同的耐藥結果[15]。研究顯示，以藥敏試驗結果為標準，對于不同等級的涂片陽性痰液來說，基因芯片對≥2級抗酸桿菌(+)痰液標本的敏感性優于其他痰液標本[11]，由此可推測，相較于直接檢測核酸擴增陽性的標本，檢測結核分枝桿菌分離株的DNA更符合藥敏試驗的結果。但因其不需要經過培養而直接進行檢測，大大縮短了檢測時間，由此可見基因芯片技術在臨床上有巨大的應用價值。(3)部分基因位點的突變只是使其編碼的產物活性減低，而非完全喪失，如katG315發生突變后，仍然可以將異煙肼轉化為活性異煙酸，只是其編碼的過氧化氫或過氧化物酶的活性降低，因此部分轉化率降低不是很明顯的菌株在基因芯片檢測耐藥性中表現為敏感[16]。(4)一些無菌體液標本或者含菌量較少的標本在檢測中有可能會出現假性敏感的情況。

2 HRM

2.1HRM概述 HRM是近年來興起的研究單核苷酸多態性的一種手段，因其檢測原理不受檢測位點的局限以及其可實現閉管操作從而避免交叉污染而引起廣泛關注[17]。近年來因結核分枝桿菌分型基因和耐藥基因的不斷檢出，科學家們開展了一系列利用HRM來檢測結核分枝桿菌耐藥基因的研究。因每個核酸分子的CG含量、分布、核酸長度均不相同，在升溫過程中，通過對飽和染料與PCR產物的結合程度進行實時監測，而形成各自的溶解曲線[18]。如果發生了基因突變，那么對應堿基會不匹配，結合力減弱，升溫時先裂解，溶解溫度變低，熒光染料從DNA分子上釋放，根據熒光強度和溫度曲線判斷是否存在突變，并且不同的峰型反映了不同的突變位點和突變形式。

2.2HRM在結核分枝桿菌菌種鑒定中的應用 相比于傳統的結核分枝桿菌培養和化學反應，HRM技術可以更快速地對結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌進行鑒定，同時受標本中細菌量的多少和細菌的純度影響較小[19-21]，也避免了較為繁瑣的一系列菌種鑒定手段。理論上來說，通過選取不同的靶基因合成不同的引物，可對臨床常見的結核分枝桿菌進行分型，并成功得到相應的特征曲線，HRM和傳統羅氏培養法的結果相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3HRM在結核分枝桿菌耐藥性檢測中的應用 目前的HRM技術主要針對臨床上最常見的利福平[22]和異煙肼[23]進行耐藥性檢測。研究發現，目前的HRM技術對于利福平的耐藥可檢測出12種突變形式，涉及7個基因位點；對于異煙肼的耐藥檢測出了katG基因的6種突變形式，inhA基因的啟動子區域5種突變形式，ahpC基因的6種突變形式[23]。綜合目前的研究來看，HRM技術在耐藥性的檢測中特異度較高，接近100%，而靈敏度在85%以上，有待于進一步提高。

2.4HRM技術在結核分枝桿菌檢測中的不足 目前開展HRM技術的醫院較少，HRM技術在結核分枝桿菌的檢測上缺少臨床數據的支持。HRM技術的靈敏度需要進一步提高，一方面的原因是目前已知的耐藥基因還不夠全面，可能會造成耐藥基因的漏檢[24]；另一方面，目前的技術并不能確定具體是哪個非單核苷酸多態性引起的耐藥性[25]，這就要繼續探索相應的突變基因和位點；同時目前的研究大多針對臨床常用的一些抗結核病藥物進行檢測，如利福平和異煙肼，而對其他藥物的研究甚少，今后可以擴大藥物的種類和檢測范圍。有研究顯示，86%的利福平耐藥株同時對異煙肼耐藥[26]，那么就存在ropB的同義突變，而HRM技術無法鑒別這種同義突變，數據分析時會出現多種曲線，具體結果還要進一步進行基因測序才能得出[27]。另外有研究證明，由于存在雜合耐藥菌株和不引起氨基酸改變的基因突變，會造成HRM檢測結果與藥敏試驗檢測結果不一致的情況[24]。

3 小 結

作為目前新興的兩項技術，基因芯片和HRM都具有高速、高特異度、高通量的特點，隨著研究的不斷深入，兩者在臨床中的應用一定會越來越多，對臨床治療的指導作用也會越來越大。兩者的不足也有共通之處，即因目前研究水平的問題，兩者都不能檢測出全部的突變類型，這也是因為結核分枝桿菌的耐藥機制復雜，目前未能完全掌握其突變規律。相對于HRM技術來說，基因芯片臨床上應用更多，技術更加成熟，結果也更容易判讀，但因其需要專門的檢測設備，成本相對更高[28]。而目前HRM技術由于更多地應用于科學研究，臨床數據相對缺乏，其靈敏度和特異度還有待于進一步研究，但是它真正實現了閉管操作，很大程度上減少了污染。綜上所述，基因芯片技術和HRM技術雖然都有一些不足，但它們作為新型的檢測手段，在結核分枝桿菌檢測方面的發展前景較可觀，未來可以與實時定量熒光PCR技術相結合，對標本同時進行分型和定量分析，節約檢測時間，將會對結核病的診治提供巨大的幫助。