急性髓系白血病患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平及其與臨床病理特征的關系

王曉萍，李啟欣，林 靜

佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東佛山 528000

急性髓系白血病(AML)為人類常見造血系統惡性腫瘤，骨髓中集聚血細胞的髓性癌，且快速生長的異常白細胞會干擾正常血細胞的生成，可致髓性癌從骨髓進入血液并取代正常血細胞所引起的高度異質性疾病，呈現慢性進展的特點，嚴重危害人體健康[1]。近年來，盡管移植預處理方案不斷優化，抗排斥技術不斷進步，臨床新藥不斷發展，但大多數AML患者的預后仍欠佳，患者復發率較高，其根本原因在于微小殘留的存在，故最大限度地清除微小殘留對于延長AML患者緩解期、提高治愈率至關重要[2]。隨著腫瘤免疫治療的不斷進展，國內外研究發現，細胞免疫系統的功能狀態與血液腫瘤的發生、發展及預后密切相關，其中，T淋巴細胞為機體重要的免疫細胞，經抗原刺激后能形成特異性的細胞毒T淋巴細胞而產生抑制抗腫瘤免疫的作用[3-5]，但AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平及其臨床意義尚未完全明確。本研究以85例AML患者和85例體檢健康者為研究對象進行回顧性分析，旨在進一步探討AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平及其與臨床病理特征的關系，進而為AML的臨床診治提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2019年3月至2021年3月于本院就診的85例AML患者作為AML組，另選取85例同期體檢健康者作為體檢健康組。AML組：年齡25～78歲，平均(60.17±2.21)歲；男46例，女39例。體檢健康組：年齡25～79歲，平均(60.25±2.36)歲；男45例，女40例。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。其中，AML患者根據染色體檢查情況可分為高危組(染色體高危核型，25例)和非高危組(非染色體高危核型，60例)。高危組：年齡26～77歲，平均(60.08±2.17)歲；男16例，女9例。非高危組：年齡25～78歲，平均(60.21±2.26)歲；男30例，女30例。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2納入及排除標準 納入標準：(1)AML及高危AML診斷符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[6]相關標準，并經免疫學、形態學、細胞遺傳學、分子遺傳學分型明確診斷者；(2)入組前未接受任何醫學治療，在本院全程接受治療，且臨床資料完整者；(3)無其他腫瘤、免疫性疾病等病史者。排除標準：(1)急性早幼粒細胞白血病者；(2)伴其他嚴重感染性、傳染性疾病者；(3)慢性骨髓增殖性疾病史者；(4)治療相關性AML者；(5)伴嚴重糖尿病、高血壓等內分泌疾病及心、脾、肺、腎等器質性疾病或器官病變者。

1.3方法

1.3.1治療方案 所有AML患者入組后均接受標準誘導方案治療，主要包括IA方案(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)、DA方案(柔紅霉素+阿糖胞苷)、MA方案(米托蒽醌+阿糖胞苷)、HA方案(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)，根據患者病情及自身耐受情況選擇合適的方法進行治療，并于化療后骨髓抑制期接受輸注懸浮紅細胞、血小板及常規抗菌藥物等對癥支持治療。

1.3.2外周血T淋巴細胞亞群檢測 采集AML患者規律治療前及體檢健康者的清晨空腹靜脈血3 mL，經乙二胺四乙酸抗凝處理后，取100 μL標本置于流式檢測管，加入相應熒光單克隆抗體(20 μL)充分混勻，避光孵育15 min(室溫)，加入紅細胞裂解液(2 mL)充分混勻，避光孵育10 min(室溫)，1 200×g離心5 min(4 ℃)，除去上清液，加入磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)振蕩混勻，洗滌2次，然后加入PBS(500 μL)混勻，采用FACSCalibur流式細胞儀檢測AML患者與體檢健康者、高危組與非高危組AML患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例，并計算CD4+/CD8+，所有試劑盒、溶液及儀器均由美國Becton Dickinson公司提供。

1.4觀察指標

1.4.1AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平與臨床病理特征的關系 通過本院電子病歷系統收集所有AML患者的基因陽性突變情況,包括FMS樣酪氨酸激酶3-內部串聯重復基因(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白基因1(NPM1)、分型[AML非特指型(AML-NOS)、AML伴重現性遺傳學異常(AML-RGA)、AML伴髓系發育異常相關改變(AML-MRC)]等，并比較不同臨床病理特征下的外周血T淋巴細胞亞群表達水平，標本處理與外周血T淋巴細胞亞群檢測同1.3.2。

1.4.2不同療效組AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平檢測 根據《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[6]可將所有AML患者分為完全緩解(CR)組(55例)和未CR組(30例)，比較兩組外周血T淋巴細胞亞群表達水平，經誘導化學治療后，于AML患者骨髓恢復期(化學治療28 d后)采集其血液標本，標本處理與外周血T淋巴細胞亞群檢測同1.3.2。

2 結 果

2.1AML組與體檢健康組外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較 AML組外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均低于體檢健康組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細胞比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 AML組與體檢健康組外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較

2.2高危組與非高危組AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較 高危組外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細胞比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 高危組與非高危組AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平表達水平比較

2.3AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平與臨床病理特征的關系 FLT3-ITD突變陽性者外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞表達水平高于FLT3-ITD突變陰性者(P<0.05)；NPM1突變陽性者外周血CD4+T淋巴細胞表達水平高于NPM1突變陰性者(P<0.05)。見表3。

表3 AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平與臨床病理特征的關系

2.4不同療效組AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較 CR組外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細胞比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同療效組AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較

3 討 論

AML為起源于髓系造血干細胞的惡性疾病，近年來國內AML發病率呈現逐漸升高的趨勢，但其具體發病機制尚未完全闡明，大多學者認為其發生、發展可能與藥物、遺傳因素、化學毒物、放射、機體免疫功能異常等密切相關[7-9]，其中，機體免疫功能異常所致骨髓微環境改變對于AML的發生、發展具有重要作用這一理論得到了廣泛認可。隨著腫瘤免疫治療相關研究的不斷深入，越來越多的研究學者發現，在抗腫瘤免疫效應中，相較于體液免疫，細胞免疫發揮著更為重要的作用，T淋巴細胞在腫瘤免疫中發揮著中心調控作用，對血液系統惡性腫瘤的免疫異常實質及臨床治療意義重大[10-11]。本研究通過分析AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平及其與臨床病理特征的關系取得了較好的研究結果。

T淋巴細胞亞群屬于人胸腺中輸出細胞，可執行細胞免疫功能及免疫調節功能，在機體免疫應答過程中，CD3+T淋巴細胞代表T淋巴細胞總數，其活性、數量與機體免疫應答活性、免疫活性細胞數量呈正相關；CD4+T淋巴細胞為反應細胞，可增強或擴大其他免疫細胞功能，一旦外周血CD4+T淋巴細胞減少，提示患者機體細胞免疫功能較低；CD8+T淋巴細胞則為T殺傷細胞，可對靶細胞產生細胞毒作用，同時調節性免疫抑制CD4+T淋巴細胞；CD4+/CD8+的穩定比例是維持細胞免疫反應平衡、抗腫瘤作用有效發揮的關鍵[12-13]。本研究結果顯示，AML組外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均低于體檢健康組，高危組外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危組，進一步說明AML患者的機體免疫力呈抑制性優勢，可見T淋巴細胞減少、功能不全及CD4+/CD8+比例失調，容易引起T淋巴細胞介導的機體細胞免疫功能缺陷，且隨著病情進展，高危AML患者免疫紊亂狀態更為嚴重。分析原因可能為：AML患者體內白血病細胞可直接抑制T淋巴細胞分化抗原的表達，還可能產生許多免疫抑制因子，如白細胞介素-2、白細胞介素-10、轉化生長因子β1等，進而影響T淋巴細胞亞群分布，進一步產生促進腫瘤發生免疫逃逸、抑制機體抗腫瘤免疫的作用，形成惡性循環，嚴重影響AML患者治療效果及預后[14]。黃方等[15]研究亦指出，AML患者機體存在免疫功能紊亂，可致外周血T淋巴細胞亞群表達水平下降。

本研究結果顯示，FLT3-ITD突變陽性者外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞表達水平高于FLT3-ITD突變陰性者，NPM1突變陽性者外周血CD4+T淋巴細胞表達水平高于NPM1突變陰性者，與李珊等[16]研究結果相一致。分析原因可能為FLT3-ITD突變可致非配體依賴性的FLT3受體自身磷酸化，使得酪氨酸激酶受體途徑異常活躍，容易引起細胞增殖、活化異常而影響免疫活性細胞的產生、增殖及分化，使得CD3+、CD4+T淋巴細胞表達水平升高；NPM1蛋白在正常生理狀態下可參與脫氧核糖核酸聚合酶活性的調節、核糖體的轉運、中心體的生物合成等，還可發揮腫瘤抑制作用，一旦出現NPM1突變則可能破壞正常血細胞的增殖、分化與凋亡，進一步引起機體微環境的代謝紊亂，進而影響T淋巴細胞的表達，使得外周血CD4+T淋巴細胞水平升高，具體影響機制有待進一步探討[17-19]。本研究還發現，CR組患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR組，提示臨床療效較好的AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平可見明顯升高，分析原因可能為：AML患者經標準誘導方案進行化學治療誘導緩解后，其體內白血病細胞負荷明顯下降，有助于促進T淋巴細胞亞群表達水平獲得部分恢復[20-23]。

綜上所述，AML患者隨著病情進展，可致外周血T淋巴細胞亞群表達水平降低而引起機體免疫功能失衡；而FLT3-ITD突變陽性可致外周血CD3+、CD4+T淋巴細胞表達水平升高，NPM1突變陽性可致外周血CD4+T淋巴細胞表達水平升高，且臨床療效較好的AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平可見明顯升高。臨床可通過密切監測AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平以對其病情進行評估，并為臨床治療方案、用藥強度等提供參考。本研究亦存在一定的不足，如樣本量較小、為單中心研究等，容易導致結果出現一定的偏倚，臨床需進一步進行大樣本量、多中心的研究以明確AML患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平及其與臨床病理特征的關系。