磁微粒化學發光法測定人尿液/血漿中兒茶酚胺類物質

莊路陽，許君艷，劉 念，王 丹，牛自飛

鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450000

嗜鉻細胞瘤/副神經節瘤(PHEO/PGL)是一種少見的導致內源性兒茶酚胺過量的神經內分泌腫瘤，位于腎上腺的為PHEO，位于腎上腺外的為PGL[1-2]。除PHEO/PGL外，壓力、長期使用安非他命等藥物均可導致體內兒茶酚胺類物質水平過高[1,3-4]。兒茶酚胺類物質主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)等，過量兒茶酚胺可引起頭痛、大汗、心悸、胸痛等癥狀，還可導致嚴重的心血管疾病[5-8]。由于PHEO/PGL的臨床癥狀及體征不典型，極易導致誤診或漏診，更多的PHEO通過偶然的影像學檢查被發現[9]。目前常用的兒茶酚胺檢測方法有放射酶學法、化學發光法、熒光法、高效液相色譜法(HPLC)等。放射酶學法技術難度高，檢測速度慢且容易造成污染；熒光法靈敏度不夠；HPLC存在檢測時間長、不能批量操作等問題[10-13]。而《嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤診斷治療的專家共識》建議使用HPLC測定兒茶酚胺類物質[14]。基于此研究現狀，本研究通過對含兒茶酚胺的尿液/血漿標本進行前處理，再利用磁微粒化學發光法對其進行檢測，提高其檢測靈敏度以及實現檢測批量化、自動化，以滿足臨床檢驗的需求。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全自動化學發光儀(Autolumo A2000 Plus)，安圖生物工程股份有限公司；微孔板快速振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；移液器，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；79-1磁力加熱攪拌器，江蘇科析儀器有限公司。E純品購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；NE、DA、3-甲氧酪胺(3-MT)、L-左旋多巴純品(L-Dopa)純品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧基腎上腺素(MN)、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)純品購自上海柯維化學技術有限公司；E、NE、DA單克隆抗體、親和素標記的辣根過氧化物酶(HRP)、甲基轉移酶(COMT)均購自鄭州伊美諾生物技術有限公司；表面包裹有羧基功能基團的磁微粒購自德國Merk公司；二甲基亞砜(DMSO)購自北京益利精細化學品有限公司；硼酸親和凝膠、(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸對甲苯磺酸鹽購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；Succinimidyl N-[6-(Biotinamido)hexanoyl]-6-amino hexanoate購自北京百靈威科技有限公司；24孔細胞培養板購自美國康寧公司。

1.2方法

1.2.1試劑配制 (1)校準品：校準品稀釋液為pH=4的檸檬酸緩沖液(保護劑：0.2%的乙酰半胱氨酸)，加入不同水平的E、NE、DA純品，制備出一組E水平為0、2、6、18、54、162 ng/mL，NE水平為0、10、30、90、270、810 ng/mL，DA水平為0、100、300、900、2 700、8 100 ng/mL的校準品。(2)抗體固相化：將選用的磁性微球原液經過10倍原液體積的磷酸緩沖液沖洗2～5遍后使用N-羥基琥珀酰亞胺(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(NHS)或戊二醛進行活化，分別與水平為0.3 μg/T的抗體通過化學連接進行包被，包被后的磁性微球經封保液封閉后，定容并分裝，2～8 ℃環境保存備用。(3)親和素標記的HRP溶液：首先按照配方三(羥甲基)氨基甲烷-氯化鈉(Tris-NaCL)0.05 M、牛血清清蛋白(BSA)2%、氨基比林(ADP)1%、碘丙炔正丁氨甲酸酯(IPBC-II)1%、聚乙二醇-4000(PEG-4000)1%配制稀釋液，再按照1∶5 000加入親和素標記的HRP，得到親和素-HRP溶液，混合均勻后2～8 ℃保存待用。(4)提取板：稱取一定質量的順式二醇特異性親和介質于250 mL燒杯中，加入適量純化水，振蕩混勻，取一定體積，通過物理吸附使其均勻分布，氮吹或37 ℃烘干。(5)酰化劑：量取一定體積的DMSO，稱取適量酰化劑，使其完全溶解，2～8 ℃保存待用。(6)甲基化酶溶液：分別取兒茶酚胺COMT凍干粉，加入3.75 mL的COMT緩沖液(1 M Tris-HCL、臨用現配)。

1.2.2標本的前處理 (1)提取：吸取1 mL提取緩沖液(0.1 M Tris-NaCL，pH=9.18)于提取板中，再加入20 μL校準品或標本(尿液標本20 μL、血漿標本500 μL)，室溫振蕩反應30 min，甩干后用2 mL純化水洗兩遍，在吸水紙上拍干提取板；(2)酰化：取150 μL的提取緩沖液于提取板中，再加入50 μL酰化劑，振蕩反應20 min，甩干，純化水洗兩遍，在吸水紙上拍干提取板；(3)釋放：加入300 μL釋放緩沖液(0.1 M檸檬酸緩沖，pH=3)振蕩反應30 min；(4)甲基化：將上述300 μL液體轉移至空白板，每孔分別加入300 μL的COMT溶液，振蕩反應30 min，得到待檢測抗原。

1.2.3標本檢測 將處理好的校準品及標本轉移至反應杯中，配套使用AutoLumo A2000 Plus全自動檢測分析儀進行檢測，得到抗體-抗原-HRP復合物，該復合物催化發光底物發出光子進行檢測。用E、NE、DA的檢測試劑分別檢測處理好的系列校準品，并按照四參數擬合方式進行校準曲線的擬合，計算標本水平，其中尿液標本水平=計算水平，血漿標本水平=計算水平/25。

1.2.4校準曲線的擬合 采用E、NE、DA的檢測試劑分別檢測處理好的系列校準品，橫坐標為校準品對應水平值，縱坐標為信號值取log，按照四參數法擬合劑量反應曲線，根據檢測標本信號值回算其水平值。

2 結 果

2.1靈敏度及特異度 重復檢測0水平的校準品20次，可得出E檢測試劑的靈敏度為6.2 pg/mL，NE檢測試劑的靈敏度為11.9 pg/mL，DA檢測試劑的靈敏度為4.2 pg/mL。E、NE、DA之間相互交叉率均小于0.5%，與其他結構類似物(L-Dopa、3-MT、MN、NMN)交叉率均小于0.1%，見表1。

表1 檢測試劑的特異度

2.2重復性 DA檢測試劑的CV為1.30%～1.96%，NE檢測試劑的CV為1.45%～3.65%，E檢測試劑的CV為1.12%～1.77%，可以滿足臨床使用的一般要求(CV<10%)，見表2。

表2 不同水平標本的重復性

2.3穩定性 建立的E檢測方法的偏差為-6.67%～-2.93%，建立的NE檢測方法的偏差為-7.06%～-3.87%，建立的DA檢測方法的偏差為-4.81%～-1.71%,偏差符合一般體外診斷試劑的標準要求，說明檢測方法的穩定性較好，見表3。

表3 檢測方法的穩定性

2.4稀釋線性 DA的檢測水平與理論水平相關曲線為Y=1.093 8X-129.17，R2為0.993 6；E的檢測水平與理論水平相關曲線為Y=1.094 2X-0.995 4，R2為0.994 3；NE的檢測水平與理論水平相關曲線為Y=0.967 1X+4.735 9，R2為0.997。3項R2均>0.99，具有較好的稀釋線性。見圖1～3。

圖1 DA稀釋線性評估結果

圖2 E稀釋線性評估結果

圖3 NE稀釋線性評估結果

3 討 論

研究表明，PHEO/PGL可以導致嚴重的并發癥，涉及心、腦、腎血管系統等，引起持續性或陣發性高血壓，危及患者生命，但如能及時、早期獲得診斷和治療，90%的患者可以治愈。因此，檢測血漿及尿液兒茶酚胺對臨床診斷PHEO/PGL具有重要意義[15]。《嗜鉻細胞瘤與副神經節瘤診斷治療專家共識》推薦診斷PHEO/PGL首選血漿(游離)或尿液(游離與結合態)MN水平，可同時檢測血漿或尿液 E、NE、DA等代謝物水平以幫助診斷[16]。

兒茶酚胺類物質檢測方法從最初的放射酶學法、熒光法發展到現在的串聯質譜法(LC-MS/MS)，LC-MS/MS因其高靈敏度、高特異度被廣泛應用，但不同實驗室的檢測結果差異較大[17]，此外，由于兒茶酚胺類物質的半衰期極短，穩定性較差，因此各實驗室間檢測結果的一致性較差。

為了驗證本次建立的檢測方法的準確性，對檢測試劑的靈敏度、特異度、重復性、穩定性及稀釋線性進行了評估。本研究建立的化學發光免疫法檢測試劑對待測物具有較高的特異度(與其結構類似物交叉率均<0.5%)，可以實現待測物的準確檢測；E檢測試劑的靈敏度為6.2 pg/mL，NE檢測試劑的靈敏度為11.9 pg/mL，DA檢測試劑的靈敏度為4.2 pg/mL，遠低于健康人血漿和尿液中的水平，可以滿足3項指標檢測需求；且E、NE、DA低、中、高三種水平的重復性CV均<5%，確認了該檢測系統具有較好的重復性；稀釋線性評估的目的是為了檢驗檢測試劑在一定量值區間內的檢測準確度，結果顯示，E<162 ng/mL、NE<810 ng/mL、DA<8 100 ng/mL時，3項的R2均>0.99，具有較好的稀釋線性；穩定性評估結果顯示，建立的DA檢測方法的偏差為-4.81%～-1.71%，NE為-7.06%～-3.87%，E為-6.67%～-2.93%，偏差符合行業標準要求，3項指標檢測方法具有較好的穩定性。本文建立的利用安圖全自動化學發光儀的檢測方法可實現血漿及尿液中E、NE、DA的特異性檢測，可以通過進一步的研究，實現該試劑各項性能指標的優化，助力PHEO/PGL的診斷。