磁微粒化學(xué)發(fā)光法測(cè)定人尿液/血漿中兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)

莊路陽(yáng)，許君艷，劉 念，王 丹，牛自飛

鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450000

嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤(PHEO/PGL)是一種少見(jiàn)的導(dǎo)致內(nèi)源性?xún)翰璺影愤^(guò)量的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，位于腎上腺的為PHEO，位于腎上腺外的為PGL[1-2]。除PHEO/PGL外，壓力、長(zhǎng)期使用安非他命等藥物均可導(dǎo)致體內(nèi)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)水平過(guò)高[1,3-4]。兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)等，過(guò)量?jī)翰璺影房梢痤^痛、大汗、心悸、胸痛等癥狀，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管疾病[5-8]。由于PHEO/PGL的臨床癥狀及體征不典型，極易導(dǎo)致誤診或漏診，更多的PHEO通過(guò)偶然的影像學(xué)檢查被發(fā)現(xiàn)[9]。目前常用的兒茶酚胺檢測(cè)方法有放射酶學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、高效液相色譜法(HPLC)等。放射酶學(xué)法技術(shù)難度高，檢測(cè)速度慢且容易造成污染；熒光法靈敏度不夠；HPLC存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不能批量操作等問(wèn)題[10-13]。而《嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤診斷治療的專(zhuān)家共識(shí)》建議使用HPLC測(cè)定兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)[14]。基于此研究現(xiàn)狀，本研究通過(guò)對(duì)含兒茶酚胺的尿液/血漿標(biāo)本進(jìn)行前處理，再利用磁微粒化學(xué)發(fā)光法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，提高其檢測(cè)靈敏度以及實(shí)現(xiàn)檢測(cè)批量化、自動(dòng)化，以滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)的需求。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(Autolumo A2000 Plus)，安圖生物工程股份有限公司；微孔板快速振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；移液器，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；79-1磁力加熱攪拌器，江蘇科析儀器有限公司。E純品購(gòu)自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；NE、DA、3-甲氧酪胺(3-MT)、L-左旋多巴純品(L-Dopa)純品購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧基腎上腺素(MN)、甲氧基去甲腎上腺素(NMN)純品購(gòu)自上海柯維化學(xué)技術(shù)有限公司；E、NE、DA單克隆抗體、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)均購(gòu)自鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司；表面包裹有羧基功能基團(tuán)的磁微粒購(gòu)自德國(guó)Merk公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；硼酸親和凝膠、(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Succinimidyl N-[6-(Biotinamido)hexanoyl]-6-amino hexanoate購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2方法

1.2.1試劑配制 (1)校準(zhǔn)品：校準(zhǔn)品稀釋液為pH=4的檸檬酸緩沖液(保護(hù)劑：0.2%的乙酰半胱氨酸)，加入不同水平的E、NE、DA純品，制備出一組E水平為0、2、6、18、54、162 ng/mL，NE水平為0、10、30、90、270、810 ng/mL，DA水平為0、100、300、900、2 700、8 100 ng/mL的校準(zhǔn)品。(2)抗體固相化：將選用的磁性微球原液經(jīng)過(guò)10倍原液體積的磷酸緩沖液沖洗2～5遍后使用N-羥基琥珀酰亞胺(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(NHS)或戊二醛進(jìn)行活化，分別與水平為0.3 μg/T的抗體通過(guò)化學(xué)連接進(jìn)行包被，包被后的磁性微球經(jīng)封保液封閉后，定容并分裝，2～8 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?3)親和素標(biāo)記的HRP溶液：首先按照配方三(羥甲基)氨基甲烷-氯化鈉(Tris-NaCL)0.05 M、牛血清清蛋白(BSA)2%、氨基比林(ADP)1%、碘丙炔正丁氨甲酸酯(IPBC-II)1%、聚乙二醇-4000(PEG-4000)1%配制稀釋液，再按照1∶5 000加入親和素標(biāo)記的HRP，得到親和素-HRP溶液，混合均勻后2～8 ℃保存待用。(4)提取板：稱(chēng)取一定質(zhì)量的順式二醇特異性親和介質(zhì)于250 mL燒杯中，加入適量純化水，振蕩混勻，取一定體積，通過(guò)物理吸附使其均勻分布，氮吹或37 ℃烘干。(5)酰化劑：量取一定體積的DMSO，稱(chēng)取適量酰化劑，使其完全溶解，2～8 ℃保存待用。(6)甲基化酶溶液：分別取兒茶酚胺COMT凍干粉，加入3.75 mL的COMT緩沖液(1 M Tris-HCL、臨用現(xiàn)配)。

1.2.2標(biāo)本的前處理 (1)提取：吸取1 mL提取緩沖液(0.1 M Tris-NaCL，pH=9.18)于提取板中，再加入20 μL校準(zhǔn)品或標(biāo)本(尿液標(biāo)本20 μL、血漿標(biāo)本500 μL)，室溫振蕩反應(yīng)30 min，甩干后用2 mL純化水洗兩遍，在吸水紙上拍干提取板；(2)酰化：取150 μL的提取緩沖液于提取板中，再加入50 μL酰化劑，振蕩反應(yīng)20 min，甩干，純化水洗兩遍，在吸水紙上拍干提取板；(3)釋放：加入300 μL釋放緩沖液(0.1 M檸檬酸緩沖，pH=3)振蕩反應(yīng)30 min；(4)甲基化：將上述300 μL液體轉(zhuǎn)移至空白板，每孔分別加入300 μL的COMT溶液，振蕩反應(yīng)30 min，得到待檢測(cè)抗原。

1.2.3標(biāo)本檢測(cè) 將處理好的校準(zhǔn)品及標(biāo)本轉(zhuǎn)移至反應(yīng)杯中，配套使用AutoLumo A2000 Plus全自動(dòng)檢測(cè)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，得到抗體-抗原-HRP復(fù)合物，該復(fù)合物催化發(fā)光底物發(fā)出光子進(jìn)行檢測(cè)。用E、NE、DA的檢測(cè)試劑分別檢測(cè)處理好的系列校準(zhǔn)品，并按照四參數(shù)擬合方式進(jìn)行校準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合，計(jì)算標(biāo)本水平，其中尿液標(biāo)本水平=計(jì)算水平，血漿標(biāo)本水平=計(jì)算水平/25。

1.2.4校準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合 采用E、NE、DA的檢測(cè)試劑分別檢測(cè)處理好的系列校準(zhǔn)品，橫坐標(biāo)為校準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)水平值，縱坐標(biāo)為信號(hào)值取log，按照四參數(shù)法擬合劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本信號(hào)值回算其水平值。

2 結(jié) 果

2.1靈敏度及特異度 重復(fù)檢測(cè)0水平的校準(zhǔn)品20次，可得出E檢測(cè)試劑的靈敏度為6.2 pg/mL，NE檢測(cè)試劑的靈敏度為11.9 pg/mL，DA檢測(cè)試劑的靈敏度為4.2 pg/mL。E、NE、DA之間相互交叉率均小于0.5%，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(L-Dopa、3-MT、MN、NMN)交叉率均小于0.1%，見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)試劑的特異度

2.2重復(fù)性 DA檢測(cè)試劑的CV為1.30%～1.96%，NE檢測(cè)試劑的CV為1.45%～3.65%，E檢測(cè)試劑的CV為1.12%～1.77%，可以滿(mǎn)足臨床使用的一般要求(CV<10%)，見(jiàn)表2。

表2 不同水平標(biāo)本的重復(fù)性

2.3穩(wěn)定性 建立的E檢測(cè)方法的偏差為-6.67%～-2.93%，建立的NE檢測(cè)方法的偏差為-7.06%～-3.87%，建立的DA檢測(cè)方法的偏差為-4.81%～-1.71%,偏差符合一般體外診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)要求，說(shuō)明檢測(cè)方法的穩(wěn)定性較好，見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性

2.4稀釋線(xiàn)性 DA的檢測(cè)水平與理論水平相關(guān)曲線(xiàn)為Y=1.093 8X-129.17，R2為0.993 6；E的檢測(cè)水平與理論水平相關(guān)曲線(xiàn)為Y=1.094 2X-0.995 4，R2為0.994 3；NE的檢測(cè)水平與理論水平相關(guān)曲線(xiàn)為Y=0.967 1X+4.735 9，R2為0.997。3項(xiàng)R2均>0.99，具有較好的稀釋線(xiàn)性。見(jiàn)圖1～3。

圖1 DA稀釋線(xiàn)性評(píng)估結(jié)果

圖2 E稀釋線(xiàn)性評(píng)估結(jié)果

圖3 NE稀釋線(xiàn)性評(píng)估結(jié)果

3 討 論

研究表明，PHEO/PGL可以導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，涉及心、腦、腎血管系統(tǒng)等，引起持續(xù)性或陣發(fā)性高血壓，危及患者生命，但如能及時(shí)、早期獲得診斷和治療，90%的患者可以治愈。因此，檢測(cè)血漿及尿液兒茶酚胺對(duì)臨床診斷PHEO/PGL具有重要意義[15]。《嗜鉻細(xì)胞瘤與副神經(jīng)節(jié)瘤診斷治療專(zhuān)家共識(shí)》推薦診斷PHEO/PGL首選血漿(游離)或尿液(游離與結(jié)合態(tài))MN水平，可同時(shí)檢測(cè)血漿或尿液 E、NE、DA等代謝物水平以幫助診斷[16]。

兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)方法從最初的放射酶學(xué)法、熒光法發(fā)展到現(xiàn)在的串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，LC-MS/MS因其高靈敏度、高特異度被廣泛應(yīng)用，但不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果差異較大[17]，此外，由于兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)的半衰期極短，穩(wěn)定性較差，因此各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的一致性較差。

為了驗(yàn)證本次建立的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)檢測(cè)試劑的靈敏度、特異度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及稀釋線(xiàn)性進(jìn)行了評(píng)估。本研究建立的化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)試劑對(duì)待測(cè)物具有較高的特異度(與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉率均<0.5%)，可以實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的準(zhǔn)確檢測(cè)；E檢測(cè)試劑的靈敏度為6.2 pg/mL，NE檢測(cè)試劑的靈敏度為11.9 pg/mL，DA檢測(cè)試劑的靈敏度為4.2 pg/mL，遠(yuǎn)低于健康人血漿和尿液中的水平，可以滿(mǎn)足3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)需求；且E、NE、DA低、中、高三種水平的重復(fù)性CV均<5%，確認(rèn)了該檢測(cè)系統(tǒng)具有較好的重復(fù)性；稀釋線(xiàn)性評(píng)估的目的是為了檢驗(yàn)檢測(cè)試劑在一定量值區(qū)間內(nèi)的檢測(cè)準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，E<162 ng/mL、NE<810 ng/mL、DA<8 100 ng/mL時(shí)，3項(xiàng)的R2均>0.99，具有較好的稀釋線(xiàn)性；穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果顯示，建立的DA檢測(cè)方法的偏差為-4.81%～-1.71%，NE為-7.06%～-3.87%，E為-6.67%～-2.93%，偏差符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性。本文建立的利用安圖全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀的檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)血漿及尿液中E、NE、DA的特異性檢測(cè)，可以通過(guò)進(jìn)一步的研究，實(shí)現(xiàn)該試劑各項(xiàng)性能指標(biāo)的優(yōu)化，助力PHEO/PGL的診斷。