miR-34a和miR-145在宮頸癌及癌前病變中的表達及與HPV16感染的相關性

喻金梅，李霞，鄒美燕，安云婷，喬志強

（江西省婦幼保健院腫瘤科，江西 南昌 330006）

宮頸癌嚴重影響女性患者的身體健康，研究[1-2]顯示，全世界約有30 萬名女性的死亡原因是宮頸癌，其中大部分發生在發展中國家。因此，采取準確的方案預防和治療宮頸癌的發生及發展具有重要的臨床意義。隨著臨床及科研技術的不斷發展，宮頸癌及癌前病變的檢測篩查技術逐漸成熟，其中人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的檢測是宮頸癌及癌前病變篩查的主要方式，不同分型的HPV致病能力也存在差異[3]。目前在不同高危HPV類型中，以HPV-16 最為常見[4]。研究[5]顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）在多種腫瘤發生進展中起到重要的作用，主要以調控蛋白和相關基因的表達水平形式，同時miR-145 和miR-34a 在結腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤中呈低表達。目前關于miR-145和miR-34a 在宮頸癌中與HPV16 感染間的關系等相關研究較少。基于此，本研究旨在探討miR-34a和miR-145在宮頸癌及癌前病中的表達水平及其與HPV16感染的相關性，以期為臨床靶向治療宮頸癌提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年6 月至2020 年6 月于本院經宮頸活檢病理學確診的41例宮頸癌患者作為A組，42例癌前病變患者作為B組，40例慢性宮頸炎患者為C組。A組年齡45～72歲，平均（61.12±8.17）歲。B組年齡47～71歲，平均（60.39±7.99）歲。C組44～75歲，平均（63.15±8.45）歲。所有患者臨床診斷均由高年資病理醫師確診。3組年齡比較差異無統計學意義，具有可比性。納入標準：經宮頸組織檢測，明確為宮頸癌前病變為宮頸低級別上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasmgrade1，CIN1）及宮頸高級別上皮內瘤變（CIN2-3）；患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書；組織標本經病理科醫生統一閱片，有病理依據。排除標準：宮頸原位腺癌；宮頸鱗癌；其他病理類型癌。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 miR-34a 和miR-145 表達水平檢測 采用實時免疫熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測miR-145 和miR-34a在宮頸組織中表達水平。cDNA 逆轉錄和RT-PCR根據相關說明書，使用全合一的TM-miRNA 和RTPCR檢測試劑盒。PCR反應在95 ℃下預熱10 min，然后在95 ℃下變性40個循環，每次10 s，在60 ℃下退火20 s，在72 ℃下延伸10 s。miR-145 引物序列，正向：TGCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA，反向：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT；miR-34a引物序列，正向：TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT，反向：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。內參U6 引物序列，正向：CGGGTTTGTTTTGCATTTGT，反向：AGTCCCAGCATGAACAGCTT。通過2-ΔΔCt方法計算miR-145和miR-34a的相對含量，每個標本重復檢測3次，并取平均值。

1.3 HPV16 感染檢測 采用原位雜交法檢測患者HPV16的表達陽性率，使用10%的甲醛溶液固定所有患者的宮頸標本，同時，使用石蠟包埋，將組織連續切片（4 μm厚），然后使用原位雜交染色法檢測所有患者的HPV16感染情況及感染陽性率，原位雜交染色使用的試劑盒購自北京奧科鼎盛生物科技有限公司，使用過程中嚴格遵循實驗試劑盒說明書進行實驗，陽性指標為陽性探針，同時，使用超純水作為陰性對照。

1.4 觀察指標 比較3 組miR-34a 和miR-145 表達水平；比較3 組宮頸組織中HPV16 感染陽性率；分析3 組宮頸組織miR-34a 和miR-145 表達與HPV16感染的相關性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以“±s”表示，3組比較采用單因素F分析（one-way ANOVA），計數資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman 相關系數檢驗進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組中miR-34a和miR-145表達水平比較 A組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達水平顯著低于B組、C組，B組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達水平顯著低于C組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組宮頸組織miR-34a、miR-145水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a and miR-145 levels in cervical tissue among the three groups(±s)

表1 3組宮頸組織miR-34a、miR-145水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a and miR-145 levels in cervical tissue among the three groups(±s)

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05

組別A組B組C組F值P值例數414240 miR-34a水平0.21±0.090.46±0.22a 1.06±0.45ab 90.691＜0.001 miR-145水平0.24±0.130.64±0.25a 1.05±0.45ab 71.570＜0.001

2.2 3組宮頸組織中HPV16感染陽性率比較 3組宮頸組織中HPV16 感染陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。A 組HPV16 感染陽性率顯著低于B 組、C 組，B 組HPV16 感染陽性率顯著低于C 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組宮頸組織中HPV16感染陽性率比較[n（%）]Table 2 Comparison of the positive rate of HPV16 infection in cervical tissue among the three groups[n(%)]

2.3 3組宮頸組織miR-34a和miR-145表達與HPV16感染的相關性分析 Spearman相關性分析顯示，宮頸癌及癌前病變患者組織中miR-34a和miR-145的表達與HPV16感染呈高度負相關（P＜0.05），同時宮頸癌組織中相關性更高；慢性宮頸炎患者組織中上述表達與HPV16感染無關，見表3。

表3 3組宮頸組織miR-34a、miR-145表達與HPV16感染的相關性Table 3 Correlation between the expression of miR-34a and miR-145 in cervical tissue of three groups and HPV16 infection

3 討論

宮頸癌是威脅我國女性患者身體健康的重大疾病，早期篩查診斷宮頸癌及癌前病變具有重要的經濟與社會意義[6]。研究顯示，HPV的感染是導致女性患者發生宮頸癌及癌前病變的重要原因，是目前普遍認可的主要因素，HPV感染的準確檢測是目前早期篩查診斷宮頸癌與癌前病變的重要方法[7]，尤其對于高危型HPV病毒，其中HPV16最為常見[8-9]。目前對于宮頸癌的發病機制尚未完全闡釋，多與微小RNA基因等異常表達有關。研究[10]顯示，miR-145和miR34a對于宮頸癌及癌前病變的發生發展具有重要的臨床意義，可促進腫瘤細胞的增殖與轉移。目前關于宮頸癌及癌前病變組織miR-145 和miR34a 表達與患者HPV感染之間的關系報道較少。

本研究結果顯示，A組HPV16感染陽性率顯著高于B 組、C 組（P＜0.05），與靳榮等[11]研究結果一致，表明隨著患者宮頸病變嚴重程度的增加，HPV感染陽性率隨之增加，HPV16可能是宮頸癌發生發展的重要原因。同時相關研究[12]顯示，開展接種9價HPV 疫苗可有效降低高危HPV 的感染率，可預防宮頸癌的發生。本研究結果顯示，A 組宮頸組織中miR-34a 和miR-145 表達水平顯著低于B 組、C組，B組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達水平顯著低于C 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明在宮頸上皮組織不斷向宮頸癌病變的進展期間，miR-145 和miR34a 的低表達可能起關鍵作用。同時，宮頸癌及癌前病變患者中miR-145和miR34a的低表達與HPV16感染顯著相關，miR-145和miR34a的表達水平越低，患者感染HPV16 的風險越高，因此，可將miR-145和miR34a動態監測結果作為患者宮頸癌及癌前病變早期篩查與診斷的重要生物學標志物。

綜上所述，宮頸癌及癌前病變患者miR-145、miR-34a 呈低表達，與HPV16 感染高度相關，miR-145、miR-34a表達水平越低，患者HPV16感染風險越高，未來可將miR-145和miR-34a動態監測結果作為宮頸癌及癌前病變早期篩查與診斷的重要標志物。