基于GEO數據庫芯片的老年骨骼肌減少癥關鍵基因篩選與生物信息學分析

張濤 安云 尹露 陳霄 閆慧新 馬書杰 嚴雋陶

(1上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437；2上海市第二康復醫院)

Screening and bioinformatics analysis of hub genes of sarcopenia based on GEO database chip

ZHANG Tao,AN Yun,YIN Lu,etal.

Yueyang Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the differential expression of hub genes in sarcopenia by using bioinformatics.MethodsThe microarray data of lateral femoral muscle samples in patients with sarcopenia was downloaded from the data platform of GEO and the differentially expressed genes(DEGs) were screened by using bioinformatics.The DEGs were subjected to gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway analysis with David online database．The protein-protein interaction (PPI) network was constructed and analyzed using the String11.0 online database. Cytoscape v3.6.1 and its plugin MCODE were used to analyze the central node protein of PPI network and hub genes in the process of sarcopenia were screened out.ResultsThrough analysis of the GSE1428 data set,1 001 DEGs were screened,of which 19 were up-regulated and 982 were down-regulated;these genes were mainly involved in the biological processes such as extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand,negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway,signal transduction,peptidyl-tyrosine phosphorylation,positive regulation of epithelial cell migration,activation of protein kinase B activity.DEGs were found to be mainly concentrated in the pathways in cancer,signaling pathways regulating pluripotency of stem cells,HIF-1 signaling pathways,Rap1 signaling pathways by KEGG pathway analysis.After analyzing the PPI network,SRC,VEGFA,JUN,UBC,CASP3,CYCS,IGF1,KRAS,F2,IL-4 were identified as hub genes.ConclusionsThe selected hub genes may become an important marker for diagnosing sarcopenia or a potential therapeutic target,and provide a new theoretical basis for the pathogenesis of the sarcopenia.

【Keywords】 Sarcopenia;Bioinformatics;Differentially expressed genes;Enrichment analysis;Protein-protein interaction

骨骼肌減少癥(sarcopenia)又稱為肌少癥、骨骼肌衰減征，是一種常見于中老年人的慢性疾病，可增加流行人群跌倒、骨折及住院的風險〔1,2〕，嚴重影響老年人正常的生活活動能力〔3〕，且住院、護理等費用也明顯高于一般人〔4〕。該病的發病與年齡密切相關，健康人骨骼肌總質量從40～80歲可以下降大約40%，60歲后肌肉功能每年則會下降3%〔5〕。神經功能下降、生長激素分泌的改變、炎癥通路激活、胰島素抵抗、慢性疾病、脂肪浸潤和營養不良等引起的肌肉蛋白合成和蛋白水解不平衡是該病的主要病因，相關的分子通路研究則圍繞細胞增殖、細胞凋亡及線粒體衰退等生物學過程進行〔6,7〕。事實上，骨骼肌維持、發育的分子機制涉及多種信號通路、基因和蛋白質之間的相互作用(PPI)，維持肌肉蛋白合成和蛋白水解之間的平衡〔8〕。骨骼肌減少癥發病和維持發展機制復雜，現有的研究大多圍繞在個體基因研究上，但全局數據的探索上仍有很多未知。本研究通過生物信息學分析老、幼骨骼肌之間的差異基因、相關通路及關鍵蛋白的PPI，以確定骨骼肌減少癥關鍵基因、通路和中樞蛋白，進一步探究骨骼肌減少癥的發生發展機制。

1 對象與方法

1.1GEO芯片數據來源 以“sarcopenia”作為搜索詞，在美國國立生物中心(NCBI)的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)搜索已公布的人類骨骼肌減少癥的基因芯片數據集。本研究使用GSE1428數據集〔9〕，該系列基于GPL96平臺(HG-U133A)Affymetrix Human Genome U133A Array，包括10例年輕受試者(19～25歲)和12例年齡較大受試者(70～80歲)的股外側肌整體基因表達譜。

1.2數據處理及篩選差異表達基因 將GSE1428數據集中的數據分組后使用GEO自帶的GEO 2R分析工具進行分析，利用R語言limma〔10〕工具包輸出同時滿足|log2 fold change(log2FC)|>1且P<0.05的差異表達基因(DEGs)，然后根據相應平臺文件所對應的R語言hgu133a.db包將探針名轉化為基因名；然后使用heatmap.2工具包繪制熱圖，將每個DEGs的差異表達情況進行直觀展示。

1.3差異基因基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將獲得的DEGs上傳到 David 在線數據庫(https://david.ncifcrf.gov)進行 GO 富集分析及 KEGG 信號通路分析。GO 功能分析從分子功能(MF)、生物學過程(BP)及細胞組分(CC)3個部分進行富集分析〔11〕。通過 KEGG數據庫對差異基因進行通路富集分析，了解疾病狀態下顯著改變的代謝通路。將P<0.05設定為差異顯著臨界值，分別選取GO富集分析及KEGG信號通路分析中基因富集數最多的10個功能進行分析。

1.4差異基因編碼蛋白互作(PPI)網絡分析及關鍵基因表達驗證 采用STRING在線數據庫(https://string-db.org)，將參與GO功能富集和KEGG通路富集的差異基因所編碼的蛋白進行PPI分析。并利用Cytoscape軟件對PPI網絡進行拓撲學分析，以度值前5位的差異基因作為PPI網絡中的關鍵基因。最后使用Cytoscape軟件中MCODE插件對PPI網絡進行模塊分析，以MCODE分數>5分作為顯著性模塊的篩選標準，篩選出模塊關鍵基因〔12〕。

2 結 果

2.1差異基因的篩選 通過R語言3.6.2軟件將原始芯片歸一化處理，利用limma包對骨骼肌減少癥和正常肌肉組織歸一化的數據進行差異表達分析，最終得到1 001個差異基因。其中上調19個，下調982個，見圖1。使用R語言中的gplots包繪制差異基因熱圖，見圖2。

2.2差異基因GO分析和KEGG通路分析 DEGs參與的生物學進程主要包括缺乏配體的外在凋亡信號通路、內在凋亡信號通路的負調控、信號轉導、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白激酶B活性的激活等；細胞組分分析顯示DEGs主要參與原生質膜的組成、細胞表面、HFE-轉鐵蛋白受體復合物、微管相關復合物、線粒體小核糖體亞基、細胞溶質等的組成；參與的分子功能主要包括蛋白質結合、蛋白質均二聚活性、轉運活性、過氧化物酶體增殖物激活受體結合、肌動蛋白結合、生長因子活性、蛋白磷酸酶抑制劑活性等。

進行KEGG通路分析后發現，DEGs主要集中在癌癥通路、調節干細胞多能性的信號通路、HIF-1信號通路、碳代謝、Rap1信號通路等，見圖3，圖4。

圖1 骨骼肌減少癥差異表達基因火山圖

綠色為下調，紅色為上調圖2 骨骼肌減少癥最大的前50 個基因熱圖

圓圈的大小表示參與基因的數量；顏色表示參與該功能的顯著性圖3 骨骼肌減少癥差異基因GO功能分析和顯著參與的KEGG信號通路

圖4 骨骼肌減少癥相關KEGG通路分析及相應基因

2.3差異基因PPI網絡 將上述篩選出的DEGs上傳到String v11.0在線數據庫，轉換差異基因編碼PPI網絡，共包含有711個節點和2 956條邊。通過Cytoscape v3.6.1軟件構建PPI網絡；進行拓撲學分析，篩選度值(Degree)>20的蛋白分子進行互作網絡分析，共包含64個節點和385條邊，見圖5。度值前10的hub基因分別為原癌基因，非受體酪氨酸激酶(SRC)、血管內皮生長因子(VEGF)、原癌基因，AP-1轉錄因子亞基(JUN)、泛素(UB)C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、細胞色素c體細胞(CYCS)、胰島素樣生長因子(IGF)1、GTPase，原癌基因,GTPase(KRAS)、凝血因子Ⅱ，凝血酶(F2)、白細胞介素(IL)-4，其相互作用關系見圖6。使用Cytoscape中MCODE插件對子模塊進行分析，可發現一些在骨骼肌減少癥局部調控中起重要作用的關鍵基因，見圖7。

圖5 蛋白質相互作用網絡分析

圓圈的大小表示該基因的度值；紅色為上調基因，綠色為下調基因圖6 骨骼肌減少癥hub基因差異PPI 分析

顏色越深代表度值越大圖7 骨骼肌減少癥差異基因蛋白網絡的子網絡分析(包含3個模塊)

3 討 論

骨骼肌減少癥是一種以肌肉質量和肌肉功能喪失為特征的年齡相關性疾病，會使老年人跌倒、功能受限、殘疾和死亡等不良后果的風險增加〔13〕。正確理解該病的發病機制有助于制定新的診斷和治療策略。本研究通過對微陣列數據進行生物信息學分析，識別出老年患者和年輕人骨骼肌之間的差異基因，并通過進行GO富集分析和KEGG途徑富集分析揭示DEGs的功能，探索老年人骨骼肌減少癥的相關基因、蛋白和通路。

通過KEGG通路分析發現影響骨骼肌減少癥發病的相關基因富集最多的信號通路為癌癥通路，該通路是過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARs)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、HIF-1、PI3K-Akt-mTOR、轉化生長因子(TGF)-β、JAK-STAT等骨骼肌減少癥的發生相關信號通路的共同交匯通路，參與骨骼肌細胞的增殖、應激、炎癥、分化、轉化、凋亡等多種生物過程。調節干細胞多能性的信號通路也參與了其中某些過程。此外，研究結果顯示DEGs還在HIF-1信號通路上富集，該通路活性的調控機制受到活性氧和氮氧化物等多種因素的影響，在骨骼肌細胞凋亡和自噬過程中同樣發揮了重要作用。通過激活調節葡萄糖轉運和糖酵解的基因，HIF-1還可以提高肌細胞對缺氧的適應性，并增強VEGF及其受體的表達，以應對氧供應減少〔14〕。研究表明，在暴露于嚴重的低壓低氧前10 min抑制HIF-1轉錄因子，可以減輕骨骼肌損傷〔15〕。Rap1信號通路在多種細胞類型的細胞黏附和整聯蛋白功能中起重要作用，在細胞間和細胞-細胞外基質相互作用的控制中發揮主導作用〔16〕。調控MAPK或PI3K-AKT通路活性促進細胞的增殖〔17,18〕，調節VEGF誘導的血管生成〔19〕，并參與肌動蛋白細胞骨架的生成〔20〕。本研究顯示Rap1信號通路相關基因在骨骼肌減少癥樣本中出現下調，體現了其對于骨骼肌穩態的積極作用。

通過構建PPI網絡，研究確定了骨骼肌減少癥中關鍵基因。研究顯示，SRC激酶在骨骼肌減少癥樣本中下調。作為第1個被識別并與細胞增殖調節相關的酪氨酸激酶，通過參與激活MAPK、PI3K等信號通路促進細胞增殖〔21〕。同時，SRC激酶可以通過抑制糖原合成酶(GSK)-3來發揮其抗凋亡作用，防止細胞蛋白質的過度分解〔22〕。此外，SRC還參與細胞黏附生長的信號傳導，促進肌動蛋白細胞骨架的調節，維持其正常的生理功能〔23〕。KRAS的活化能夠激活一系列下游通路，尤其是RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT通路，也可促進細胞分裂增殖和抑制細胞凋亡〔24,25〕，KRAS表達的降低可能是肌肉減少癥的誘發因素。JUN作為JAK/STAT信號通路成員，負調控骨骼肌細胞的增殖，在骨骼肌減少癥中表達上調。有報道證實了JAK/STAT信號通路在老年人骨骼肌肌衛星細胞中的激活〔26〕。但也有研究表明，JUNB能夠抑制蛋白質的降解，增加JunB表達可顯著提高肌纖維的橫截面積〔27〕。

盡管肌細胞的凋亡會引起骨骼肌的氧化損傷和肌纖維的萎縮壞死,但這一生物過程在降解受損炎性細胞、限制組織損傷、恢復組織完整性等方面同樣發揮積極作用。細胞正常的凋亡過程在骨骼肌的正常發育、自穩平衡方面起非常重要的作用〔28〕，本研究也發現了一些促進細胞凋亡的關鍵基因在骨骼肌減少癥肌肉樣本中表達下調。CYCS從線粒體內釋放進入到細胞質，在ATP作用下激活凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1，Apaf-1活化后依次激活Caspase-9和Caspase-3，是肌細胞發生凋亡的早期誘因〔29〕，而CYCS基因在本研究中顯示表達下調。UBC可以通過酶促反應相互連接，進而介導靶蛋白降解，泛素化蛋白降解途徑可介導細胞凋亡〔30〕。目前沒有文獻證明泛素蛋白酶體系統對于骨骼肌減少癥的促進作用，但UBC可以識別、標記并降解錯誤折疊蛋白，減輕細胞的損害，在應對細胞應激反應時可發揮重要作用〔31〕。IL-4可以通過上調Bcl-2蛋白家族調控骨骼肌細胞的自噬和凋亡，在骨骼肌內穩態發揮重要作用〔32〕。而IL-4表達的降低可能會使Bcl-2控制細胞程序性死亡的作用減弱,降低骨骼肌線粒體更新速率及抗氧化水平〔33,34〕。本研究結果提示，維持細胞正常凋亡的相關基因、蛋白表達減少在骨骼肌減少癥的發病中有一定促進作用。

作為SRC和KRAS的上游調控因子，VEGFα具有促進內皮細胞增生、遷移及增加血管通透性的作用，可維持血管正常的形態和完整性〔35〕。研究發現，VEGF表達降低是老年毛細血管稀疏和血管生成減弱的潛在原因，而微循環是否正常也是影響骨骼肌發育的重要因素，阻斷VEGF會破壞由超載或剪應力引起的骨骼肌血管生成〔36〕。同時，VEGF還可能通過VEGF受體Flk-1和Flt-1作用于肌衛星細胞，刺激肌衛星細胞遷移并抑制肌衛星細胞凋亡，維持骨骼肌的穩態，促進骨骼肌再生〔37〕。因此，在骨骼肌減少癥的研究和治療中，應重視微循環對肌肉可塑性、修復和再生的作用。結合之前通路分析，衰老相關VEGF表達減少導致血管生成受損的主要原因可能是老年人HIF-1、Rap1活性缺陷〔38〕。

肌肉減少癥的發展與多種合成代謝激素水平下降有關，而30歲以后睪丸素的生成速度將會以每年1%的速度減少〔39〕,而這種由衰老而出現生長激素下降也會使IGF-1的表達降低，最終影響骨骼肌蛋白的合成。IGF-1通過參與IGF1/PI3K/Akt/PKB/mTOR信號通路增強肌肉蛋白質合成〔40〕，并負性調控轉錄因子FoxO家族以減少蛋白質的分解〔41〕。實驗顯示肌肉特異性胰島素和IGF-1受體雙敲除小鼠會出現FoxO誘導的骨骼肌大量減少〔42〕。除此之外，本研究發現影響骨骼肌減少癥生成的基因還參與了肌動蛋白細胞骨架通路的調節。細胞骨架蛋白作為骨骼肌細胞重要的結構，可以連接和錨定肌細胞內的結構成分〔43〕。肌動蛋白作為細胞骨架網中的一員，在骨骼肌減少癥的發生發展中有十分重要的作用。關鍵基因F2通過與細胞表面F2受體和整合素結合激活肌動蛋白細胞骨架通路〔44〕，并與其受體結合增加了肌動蛋白應力纖維的形成，調節了肌動蛋白細胞骨架組織〔45〕。

本研究通過模塊分析還發現一些新的與骨骼肌減少癥有關的基因，如中心體蛋白(CEP)290、細胞分裂周期(CDC)6、G蛋白耦聯受體(GPR)17、G蛋白亞基(GNB)5、溶血磷脂酸受體(LPAR)2、甲酰基肽受體(FPR)2等，可能作為骨骼肌減少癥潛在診斷和治療的靶點。這些基因在骨骼肌減少癥中研究較少，僅有少量研究證實CDC6主要參與DNA的復制，對于維持細胞周期的正常運轉和細胞增殖具有重要作用〔46〕。有學者證實了CDC6對于肌衛星細胞增殖有促進作用〔47〕。

綜上，影響骨骼肌減少癥發病的某些基因涉及了癌癥通路，可能與癌癥的發生有密切聯系。此外，在診斷和治療骨骼肌減少癥時，應重視細胞的正常增殖與凋亡、生長激素水平及局部微循環對骨骼肌的修復和再生作用。本研究的局限性在于所選數據納入樣本量較少，且未進行不同性別的差異基因分析。所篩選出的關鍵基因是否能成為骨骼肌減少癥潛在的靶點，還需要進一步進行分子機制的研究證實。