聯合早期腸內營養和生態免疫腸內營養對重癥急性胰腺炎大鼠腎功能保護作用

逄澤輝 王慶華 (濱州醫學院護理學人文教研室，山東 濱州 256603)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種發病機制復雜的急危重癥，其發生、發展與抗炎因子、促炎因子、細胞凋亡等密切相關〔1〕，對機體微循環產生嚴重影響，導致肝、肺及腎等相關器官衰竭〔2〕。其急性腎損傷(AKI)發生率高達35%，合并急性腎衰竭(ARF)后病死率明顯上升，高達80%〔3〕。早期腸內營養(EEN)指患者入院24～72 h內盡早實行EEN。生態免疫腸內營養(EIN)即在腸內營養的基礎上，添加益生菌、谷氨酰胺和精氨酸等對免疫功能有重要影響的免疫營養素輔助治療〔4〕，從而抑制外源性致病菌和內源性條件致病菌的過度生長和繁殖。本研究旨在探討聯合EEN和EIN對SAP大鼠腎功能保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 選取健康清潔級雄性SD大鼠120只，體重(250±30)g，由山東濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司提供〔動物合格證號：SCXK(魯)20140007〕，SD大鼠先在動物實驗中心適應性喂養2 w。隨機分為4組：正常對照(SO)組，SAP模型(SAP)組，EEN組，EIN組。每組30只，將每組再分為12、24、48 h 3個亞組(n=10)。實驗前12 h禁食，自由飲水。

1.2實驗動物模型制備 SAP大鼠采用逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉法制備模型。用10%水合氯醛溶液對大鼠進行腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)，在劍突下腹正中處縱行約2 cm的手術切口，逐層切開循腔入腹，沿胃竇幽門找到十二指腸，于十二指腸內側可見片狀分布胰腺，進一步尋找十二指腸乳頭及透明狀胰膽管，給予無損動脈夾夾閉胰膽管近肝端，用尖端磨鈍的一次性0.45號靜脈輸液針經胰膽管十二指腸開口處逆行穿刺入主胰膽管，用無損動脈夾固定針頭。向胰膽管內緩慢注入5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 ml/100 g)，無菌鹽水紗布覆蓋手術區，當胰腺發生水腫滲出、局部出現暗紅色時，證明造模成功。最后將十二指腸還納至腹腔內后逐層關腹。術后于大鼠背部皮下注射生理鹽水(2 ml/100 g)以補充丟失的體液，術后大鼠自由飲水，但仍禁食。SO組：手術方式同上，但開腹后胰膽管注射等量生理鹽水。

1.3營養途徑的建立 (1)腸內營養液配制：用百普素(Milupa GmbH，德國)配制，在潔凈容器中注入500 ml冷水，加入本品1袋(125 g)，充分混合。其主要成分為：水解乳清蛋白、麥芽糖糊精、植物油、礦物質、維生素、微量元素等。(2)EIN組：在EEN組腸內營養乳劑中加入谷氨酰胺(L-Gln，成都藥業股份有限公司)0.4 g/(kg·d)、精氨酸(L-Arg，上海信誼制藥廠)0.25 g/(kg·d)、三聯活菌制劑(長型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌，內蒙古雙奇藥業股份有限公司)109CFU/d。(3)所有大鼠腸內營養喂養途徑采用胃十二指腸置管方法，大鼠術后清醒4 h后給予2 ml生理鹽水沖洗腸管，SAP建模后12 h起間歇緩慢泵入營養液(10 min/次，5 ml/1.5 h)，總量逐漸增加至50 ml/24 h，能量達到250 kCal/(kg·d)，并采用微量輸液泵維持。營養過程中，觀察大鼠適應性，根據情況調整營養液速度。SAP組和SO組經腸內營養管注入等量生理鹽水。

1.4方法

1.4.1各組炎癥反應指標 分別在各亞組營養支持后12、24、48 h觀察大鼠腹腔內各臟器的大體情況，進行腹主動脈采血后處死。血液標本室溫靜置30 min，然后在4℃下12 000 r/min速度離心約5 min后提取血清，血清于-20℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6 、IL-10水平，具體實驗步驟按試劑盒說明進行操作。

1.4.2各組腎功能指標 保存于-20℃中的血清，采用全自動生化分析儀進行血清淀粉酶(AMY)、血清血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)的測定。

1.4.3各組組織學指標 取胰腺和腎臟組織，先用生理鹽水沖洗干凈，然后4%多聚甲醛固定24 h后，采用石蠟包埋后切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色處理，光學顯微鏡下觀察組織形態和結構的改變。采用改良的Schmidt等〔5〕病理學評分標準進行評分，對大鼠胰腺組織的病理變化作定量評估和組織學研究。采用Rabb等〔6〕評分標準對各組腎臟組織進行病理學評估，評估由兩位實驗人員單獨進行，取平均值作為最終評分。

1.5統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1胰腺組織形態觀察 (1)SO組胰腺組織3個時間點無明顯變化，胰腺組織為淡粉紅色，光澤度較好，無明顯壞死和出血等病理改變；(2)SAP組：腹腔可見血性腹水，胰腺組織充血、水腫，且有散在出血點和部分壞死，隨時間的進行而加重，表明造模成功。(3)EEN組和EIN組在不同時間點病變程度不同，都可見到胰腺組織光澤變暗、充血和水腫等病變，但腹水、出血和壞死的程度較SAP組明顯減輕。且EIN組較EEN組減輕。

2.2光鏡觀察病理改變

2.2.1各組胰腺組織病理變化 (1)SO組胰腺組織結構清晰，細胞形態正常，無出血壞死；(2)SAP組12 h胰腺組織結構輕度紊亂，間質水腫明顯，少量炎性細胞浸潤，少許腺泡細胞壞死；24 h胰腺組織結構紊亂，炎性細胞浸潤，部分腺泡細胞壞死；48 h胰腺組織結構嚴重紊亂，間質充血、出血，大量炎性細胞浸潤，腺泡大面積壞死。(3)EEN組間質水腫減輕，腺泡壞死減少，炎癥細胞浸潤程度較SAP組減輕。(4)EIN組彌漫性小葉間水腫、出血壞死灶及炎癥細胞浸潤較EEN組減輕。見圖1。

2.2.2各組腎臟組織病理變化 (1)SO組腎組織結構未見明顯異常。(2)SAP組腎組織可見明顯異常改變，12 h出現輕度腎小管上皮細胞腫脹，腎小管管腔擴張；24 h腎小管上皮細胞明顯腫脹，部分腎小管間質炎性細胞浸潤，小管間血管充血；48 h腎小管上皮細胞重度水腫，管腔出血，間質大量炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞可見部分壞死。(3)EEN組較SAP組腎小管上皮腫脹程度、腎小管間質炎性細胞浸潤程度減輕。(4)EIN組較EEN組間質炎性細胞浸潤程度、腎小管上皮細胞充血水腫程度、上皮細胞壞死程度均減輕。見圖2。

2.2.3各組胰腺、腎臟組織病理評分 各組胰腺組織標本根據Schmidt評分顯示：①各組胰腺病理評分有時間依賴性(均P<0.05)；②EEN、EIN組各時間點胰腺病理評分均明顯低于SAP組(P<0.05)；③EIN組各時間點胰腺組織病理評分均明顯低于EEN組(P<0.05)。各組腎臟組織標本根據Schmidt評分顯示：①各組腎臟病理評分有時間依賴性(均P<0.05)；②EEN、EIN組各時間點腎臟病理評分明顯低于SAP組(P<0.05)；③EIN組各時間點腎臟組織病理評分明顯低于EEN組(P<0.05)，見表1。

2.3各組AMY、BUN、Cr水平比較 (1)AMY比較：①SO組AMY水平較低，各時間點無明顯變化，且各時間點均明顯低于其余3組(P>0.05)；②SAP組、EEN組及EIN組24 h AMY水平明顯高于12 h,48 h AMY水平明顯低于24 h(均P<0.05)；③SAP組、EEN組及EIN組同一時間點AMY水平比較：SAP組>EEN組>EIN組(均P<0.05)。(2)BUN、Cr水平比較：①SO組不同時間點BUN、Cr水平無顯著差異(P>0.05)；②各組同一時間點BUN、Cr水平比較:SAP組>EEN組>EIN組>SO組(P<0.05)；③SAP組、EEN組及EIN組BUN、Cr水平呈時間依賴性(均P<0.05)。見表2。

圖1 各組營養支持不同時間點胰腺組織病理變化(HE，×100)

圖2 各組營養支持不同時間點腎臟組織病理變化(HE，×100)

表1 各組營養支持不同時間點胰腺、腎臟組織病理學評分分)

2.4各組血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較 SO組血清TNF-α、IL-6和IL-10水平較低，在造模后各時間點無顯著差異(P>0.05)，且各時間點均明顯低于其余3組(P<0.05)；SAP組、EEN組及EIN組24 h TNF-α水平明顯高于12 h,48 h AMY水平明顯低于24 h(均P<0.05)；SAP組、EEN組及EIN組同一時間點TNF-α水平比較：SAP組>EEN組>EIN組(均P<0.05)；各組同一時間點IL-6水平比較:SAP組>EEN組>EIN組>SO組(P<0.05)，IL-10水平比較：SO組

表2 各組營養支持不同時間點血清AMY、BUN及Cr、TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

3 討 論

由于SAP時機體處于強烈應激狀態，微循環功能障礙，難以為機體提供正常的營養及能量供應，可在較短時間內引發細菌轉移及炎癥瀑布樣級聯反應，導致全身炎性反應綜合征(SIRS)，進而發展為多器官功能障礙綜合征(MODS)，對SAP相關腎損傷的發生起關鍵作用〔7〕。BUN主要經腎小球濾過后由腎小管重吸收，當腎損傷或處于全身炎癥反應時，腎小球濾過降低，導致血清BUN表達水平顯著上升，從而反映腎損傷的程度和病情的嚴重程度〔8〕。正常情況下Cr主要通過尿液排出體外，當腎臟功能受損導致對Cr濾過能力降低，從而引起血清Cr上升，可能發展為ARF〔9〕。本研究結果表明EIN聯合EEN能有效控制SAP的發展，減輕腎臟組織的進一步損害。可能原因EIN中L-Arg能擴張血管，有效改善胰腺微循環，抑制血小板黏附和聚集，有效抗血栓形成，改善機體的缺血狀態〔10〕。亦可參與機體蛋白代謝，抑制炎癥細胞因子的生成和胰酶的激活，從而對SAP胰腺本身及腎功能均有一定的保護作用。

細胞因子和炎癥介質的持續過量釋放是導致SAP持續發展并造成急性ARF的重要原因。由于SAP時機體微循環功能障礙，巨噬細胞、中性粒細胞等白細胞過度激活，釋放的大量TNF-α、IL-6等炎癥因子導致炎癥反應。TNF-α是反映SAP早期嚴重程度的重要指標，可進入血液促進白細胞在炎癥局部聚集并活化，造成胰腺組織損傷和臟器功能紊亂。IL-6可激發白細胞黏附參與SIRS和MODS。IL-10通過抑制巨噬細胞和中性粒細胞的增殖與活化，從而減少炎癥因子釋放，在SAP治療及預防中起到修復胰腺損傷的關鍵作用〔11〕。本研究結果表明EIN聯合EEN能下調TNF-α、IL-6促炎細胞因子的釋放，有效調節IL-10抗炎因子產生，從而恢復體內抗炎因子與促炎因子之間的平衡，對SAP腎損傷起到治療作用。鄭傳明等〔12〕研究發現大量的炎性因子如TNF-α、IL-6 及IL-1β瀑布樣釋放導致腎臟損傷和加重微循環障礙，同時也是造成高死亡率的主要原因。EIN中谷氨酰胺是機體內最豐富的條件非必需氨基酸，是多種免疫細胞的主要能源物質，提示可能Gln刺激免疫細胞分泌，調節生成細胞因子，能抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌，可顯著減輕SAP時機體炎癥，從而保護組織器官功能。此外EIN營養液中特有的三聯活菌片，皆為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長繁殖，可抑制并清除腸致病菌對腸上皮細胞的黏附，避免其繁殖，減少腸內菌群的移位，促進腸蠕動及穩定腸黏膜免疫屏障，從而減少或阻斷炎癥介質和細胞因子的釋放，有效預防SAP并發癥的發生與發展。