瑞戈非尼通過抑制Wnt信號通路調控肝癌進展的分子機制

陳建南 吳進盛 于莉 余華軍

(1儋州市人民醫院藥劑科，海南 儋州 571700；2海南醫學院第一附屬醫院腫瘤姑息治療科)

肝細胞癌是原發性肝癌的主要形式，由于其5年生存率較低，是導致肝癌死亡的第二大原因〔1〕。肝細胞癌作占世界范圍內總肝癌病例的70%～85%〔2〕。世界范圍內每年新診斷的肝癌的患者超過780 000例〔3〕。肝細胞癌的發生和惡性進展依賴于遺傳、環境和生活方式因素之間復雜的相互作用〔4〕。肝細胞癌通常發生在慢性肝損傷的環境中，進而導致炎癥、肝細胞再生、肝基質重構、纖維化和肝硬化，其中肝硬化是肝細胞癌最重要的危險因素〔5〕。

目前肝細胞癌的治療方案包括肝部分切除、肝移植和局部區域治療〔6〕。對于無法再獲得治療的晚期肝細胞癌患者多激酶抑制劑索拉非尼是一線治療藥物，其可以較好地維持肝臟功能〔7〕。然而，對于臨床上索拉非尼耐藥的患者，在瑞戈非尼被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準前，一直沒有有效的治療方案〔8〕。瑞戈非尼作為一種多靶點激酶抑制劑，主要適用于先前接受索拉非尼治療且耐藥的肝細胞癌患者〔9〕。瑞戈非尼是首個也是唯一一個能夠顯著改善肝細胞癌患者總生存期的二線治療藥物〔10〕。對于多吉美治療期間疾病出現進展的肝細胞癌患者，在接受瑞戈非尼治療后，總生存期得到統計學意義和臨床意義的改善〔11〕。

Wnt信號通路在進化中高度保守，普遍存在于脊椎動物和無脊椎動物中，調節細胞的增殖、分化及死亡，在維持機體正常生長和代謝等方面發揮重要作用〔12〕。經典的Wnt信號通路包括蓬亂蛋白受體家族的激活及β-catenin在細胞核中水平上調，從而導致細胞的異常增殖。目前眾多癌細胞中均發現了Wnt信號持續活化〔13〕，其中，Wnt信號通路的失控與肝細胞癌的發生亦密切相關〔14〕，瑞戈非尼作為首個獲批用于肝細胞癌的二線治療的新藥，瑞戈非尼的靶點包括c-RAF、突變型b-RAF、血管內皮生長因子受體和成纖維細胞生長因子受體等生長信號和血管生成因子反應的重要中介〔10〕。由于Wnt信號通路在肝細胞癌中異常激活，本研究旨在探究瑞戈非尼處理是否可通過調控Wnt信號通路而發揮抗癌作用。

1 材料和方法

1.1試劑和材料 瑞戈非尼由拜耳公司(大中華區)提供，雄性野生型C57BL/6小鼠購買自上海斯萊克生物有限公司，二乙基亞硝胺(DEN，貨號：N0725) 和青/鏈霉素(貨號：N03294)自Sigma Aldrich公司，小鼠飼料(貨號：D12450Bi)購買自Research diet公司，β-catenin抗體(貨號：AB30482)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗體(貨號：AB11291)、重組蛋白A/G-瓊脂糖凝膠珠(貨號：D39492)購買自上海煊翎生物有限公司。

1.2小鼠肝癌模型的構建 雄性野生型C57BL/6小鼠飼養在(23±3)℃，濕度35%±5%，12 h/12 h的暗/光循環的房間里(早上6∶30開燈)，自由進水和飼料。肝癌模型是在4周齡野生型C57BL/6小鼠的腹腔注射25 mg/kg的DEN溶液，對照組注射同劑量的生理鹽水，每組20只，1次/w，連續注射4 w，然后小鼠正常飼料連續飼養24 w。

1.3瑞戈非尼藥物處理 在DEN處理20 w后，將對照組和肝癌模型組隨機分為2個亞組，每組10只，即對照組，瑞戈非尼處理組，肝癌模型組，肝癌瑞戈非尼處理組4組，其中瑞戈非尼處理組、肝癌瑞戈非尼處理組每天灌胃給予瑞戈非尼10 mg/kg，對照組給予同體積的生理鹽水，每天給藥一次，連續給藥4 w。給藥期間，定期檢測小鼠體重。給藥結束后1%戊巴比妥鈉麻醉動物，小鼠心尖取血，取出肝臟，稱量肝臟重量，測量腫瘤相關參數，并將肝臟組織取材后立即放入液氮冷凍，然后放入-80℃保存。所有動物實驗按照動物保護與使用委員會批準的方案進行。

1.4檢測腫瘤相關參數 計數肝臟中腫瘤的數量，用游標卡尺測量不同腫瘤結節的最長直徑并統計不同直徑腫瘤的數量，測量腫瘤的最長直徑和最短直徑及腫瘤的高度，根據V=長×寬×高×π/6計算腫瘤的體積，并統計4組之間的腫瘤相關指數的差異。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 用4%多聚甲醛固定液固定肝臟組織，樣品脫水處理，石蠟浸蠟包埋，然后切片，用石蠟切片進行HE染色，經過二甲苯脫蠟和不同濃度乙醇水化，蘇木素染色液染色5 min，沖洗去多余的染色液，伊紅染色液染色30 s，脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察拍照，觀察各組小鼠肝臟組織的基本形態。

1.6免疫組化染色 石蠟切片經過二甲苯脫蠟和不同濃度乙醇水化，然后高溫加熱抗原修復，山羊血清封閉液，室溫封閉30 min，加入β-catenin抗體，室溫靜置2 h，然后加入二抗，室溫靜置1 h，蘇木素復染30 s，脫水透明最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果，觀察β-catenin在各組小鼠肝臟切片中的表達量。

1.7Realtime PCR技術 提取總RNA，Trizol室溫裂解細胞，氯仿分離去除蛋白，取水相加入異丙醇萃取RNA沉淀，用75%酒精(DEPC水配制)洗滌沉淀，晾干殘留乙醇，將沉淀溶于適量DEPC水中，檢測RNA純度及濃度。用M-MLV逆轉錄系統進行反轉錄，得到cDNA。使用Applied Biosystems公司的SYBR Green PCR system，以actin為內參，進行基因的實時熒光定量PCR (qRT-PCR)比較相關基因表達差異。

所使用的引物合成于上海生工有限公司，序列如下：小鼠actin：正向 5′-AGCTCGATCGATCGCTCG-3′，反向 5′-GTCTCGTCGCTCGCTATCTGG-3′；小鼠β-catenin：正向 5′-CAGCGCTGTCGCTGCAG-3′，反向 5′-ACGCTGCTAACCACCGCCTCTGG-3′；小鼠G1/S-特異性周期蛋白(cyclin)D1：正向 5′-ATATGTGTCGATGTGA-3′，反向 5′-ACCCCTCGCTCGCTA-GACCA-3′；小鼠基質金屬蛋白酶(MMP)9：正向 5′-ACACCGTCGTGACGGTTC-3′，反向 5′-CCG-GGCTGAATCCCGGACAAT-3′。

1.8CO-IP技術 肝臟組織用研磨儀在添加了蛋白酶抑制劑的CO-IP裂解液裂解，置于冰上30 min后，4℃，20 000 r/min離心15 min，收集上清，每個IP反應中加入2 μg GSK-3β抗體，4℃溫和旋轉2 h。然后加入蛋白G/A 瓊脂糖凝膠珠使其終濃度為2.5%(V/V)，4℃旋轉2 h。4℃，3 000 r/min離心3 min收集瓊脂糖凝膠珠，并用IP洗液洗3次。洗后的珠子加入SDS上樣緩沖液并煮沸10 min，隨后12 000 r/min，室溫離心5 min，上清用于免疫印跡檢測，檢測GSK-3β和β-catenin的蛋白結合水平。

1.9數據統計 采用Graphpad Prism6.0軟件進行two-way ANOVA檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠狀態及體重的變化 4組小鼠在實驗過程中均未出現死亡。表1小鼠體重監測表可以看出，DEN處理的肝癌模型組給藥8 w后體重明顯低于對照組(P<0.001)，且給予瑞戈非尼干預后，肝癌瑞戈非尼處理組小鼠體重開始緩慢上漲，肝癌瑞戈非尼處理組體重明顯高于肝癌模型組(P<0.01)。

2.2腫瘤相關指標比較 肝癌模型組的肝臟重量/體重比，肝臟腫瘤數量，腫瘤的最大直徑及最大腫瘤體積均顯著高于對照組(P<0.001)。肝癌瑞戈非尼處理組的肝臟重量/體重比，肝臟腫瘤數量，腫瘤最大直徑及最大腫瘤體積均顯著低于肝癌模型組(P<0.01)。見表2。

2.3各組肝臟HE染色 對照組和單純的瑞戈非尼處理組肝臟組織結構清晰，可以看到肝小葉輪廓清楚完整，肝細胞索排列整齊，肝竇清晰可見，未有顯著的增生和凋亡現象。肝癌模型組可以看到肝癌組織排成細梁狀的假小葉狀結構，癌細胞呈多邊形，體積明顯增大，核質比增大，核染色加深，胞質嗜酸性增強。而給予瑞戈非尼處理后，肝癌組織體積變小，癌細胞形狀較肝癌模型組略規，部分細梁狀排列，假小葉狀結構較肝癌模型組減少。見圖1。

表1 各組體重監測

表2 各組腫瘤相關指標及cyclinD1、MMP9表達比較

2.4各組肝臟Wnt/β-catenin信號通路表達 瑞戈非尼可顯著逆轉肝癌組織中cyclinD1、MMP9的高表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.5各組肝臟組織中β-catenin的亞細胞定位 對照組和瑞戈非尼處理組β-catenin主要是分布于細胞質，且在肝臟組織中表達較少。與對照組比較，肝癌模型組組織中β-catenin的表達水平顯著升高(1.02±0.13 vs 2.65±0.43，P<0.01)，且β-catenin以核內分布為主。與肝癌模型組比較，當給予瑞戈非尼處理后，小鼠肝癌組織中β-catenin明顯減少(1.45±0.27，P<0.05)，見圖2。

2.6瑞戈非尼調控β-catenin和GSK3β的結合 與對照組比較，肝癌模型組小鼠肝臟中GSK-3β和β-catenin蛋白的相互作用減弱(1.13±0.21 vs 0.47±0.13;P<0.05)，β-catenin蛋白增加進而入核增加；而給予瑞戈非尼后，相較于肝癌模型組GSK-3β和β-catenin蛋白表達明顯增加(2.14±0.58，P<0.001)，見圖3。

圖1 小鼠肝臟HE染色

圖2 各組肝臟β-catenin的表達及定位(免疫組化)

1～4：對照組、瑞戈非尼處理組、肝癌模型組、肝癌瑞戈非尼處理組圖3 瑞戈非尼對β-catenin和GSK-3β結合的調控

3 討 論

近年來，我國肝癌的發病率呈上升趨勢，復發率較高。傳統的輔助治療、放療和化療研究進展緩慢，嚴重影響肝癌患者的生存率，因此尋找更有效的靶向藥物勢在必行〔2，3〕。越來越多的研究表明，肝細胞癌的發生與癌基因的過表達和腫瘤微環境有關〔15〕。目前在體研究顯示瑞戈非尼可抑制腫瘤發生，腫瘤血管生成，轉移和腫瘤免疫〔16〕。此外瑞戈非尼作用于腫瘤細胞中的多個激酶包括血管內皮生長因子受體1～3、血管生成素受體2、血小板衍生生長因子受體β、成纖維細胞生長因子受體、原癌激酶等，通過抑制腫瘤微環境抑制腫瘤血管生成〔17〕。

Wnt/β-catenin通路與肝細胞癌的生長和侵襲密切相關的信號轉導通路，Wnt/β-catenin通路的異常激活在肝癌腫瘤進展中具有關鍵作用。Wnt蛋白質結合跨膜受體(Fizzled)，激活經典Wnt/β-catenin途徑，Wnt信號的激活可以抑制β-catenin“蛋白降解復合體”的形成，β-catenin不再進入降解途徑而是轉移到細胞核內，β-catenin在細胞核內累積，與TCF/LEF轉錄因子家族相互作用從而激活特定基因的轉錄表達，如cyclinD1、MMP9的轉錄表達，促進腫瘤細胞的增殖和遷移〔18，19〕。

本研究結果發現瑞戈非尼處理可改善肝癌小鼠的體重，減少肝臟腫瘤數量，腫瘤的最大直徑及最大腫瘤的體積。體外細胞學實驗結果顯示瑞戈非尼對HepG2細胞的增殖及活性具有顯著的抑制作用。分子水平檢測發現瑞戈非尼主要通過促進GSK-3β和β-catenin的蛋白相互作用，促進β-catenin降解復合體的形成，抑制肝癌組織細胞核內β-catenin的累積，逆轉肝癌組織中cyclinD1、MMP9的高表達，最終抑制肝臟癌細胞的增殖和侵襲。據報道，腫瘤細胞來源的經典的Wnt/β-catenin信號通路可促進M2型巨噬細胞極化，導致肝臟癌細胞的遷移、轉移、生長和免疫逃逸〔18〕。

綜上，肝細胞癌組織中的Wnt/β-catenin通路過度激活是肝細胞癌預后不良的標志之一。抑制Wnt/β-catenin通路的過度激活是瑞戈非尼治療肝細胞癌的一個重要靶點。瑞戈非尼負性調控肝細胞癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活抑制細胞增殖和侵襲。這一發現為瑞戈非尼的抗癌機制提供了一個新的理論依據，同時也證實了肝癌的治療靶點Wnt/β-catenin通路在肝細胞癌發病中的重要作用。