基質輔助激光解吸電離質譜成像技術及其應用

沈鈺琳， 許 旭

（上海應用技術大學 化學與環境工程學院，上海 201418）

1 質譜成像概述

質譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）是一種新型的分子成像技術，能夠可視化組織分子，利用成像軟件獲得待測物空間分布特征[1]。MSI技術根據電離方式的不同，主要可分為：基質輔助激光解吸電離質譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）、二次離子質譜成像（secondary ion mass spectrometry imaging，SIMS-MSI）和解吸電噴霧電離質譜成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，DESIMSI）。其中MALDI-MSI是目前應用最廣泛的質譜成像技術。

在1994年第42屆美國質譜學會（american society for mass spectrometry，ASMS）會議上首次提出MALDI-MSI成像方法，后來Caprioli等[2]在1997年首次將MSI應用于組織樣品中多種蛋白質和多肽的分子成像研究。MSI與基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）相結合是代謝組學研究中的一項有效技術。這項技術可以通過精確測定存在于組織中不同位置的的化合物信息來可視化其空間分布，例如：脂質、蛋白質、肽和DNA序列[3]。

MALDI-MSI是一種以軟電離技術MALDI為基礎的分析方法。將基質分子均勻分散在切成薄片的待分析物上并形成共結晶。利用激光照射共晶時，基質分子吸收能量后傳遞給待分析物，使待分析物解吸電離，所產生離子通過質譜儀進行測量。最后利用特定的質譜成像軟件完成對組織樣品的分子成像[4]。

2 MALDI-MSI的操作流程

MALDI-MSI的基本操作流程如圖1所示。主要分為3個步驟：樣品制備、質譜分析、數據解析及成像。首先根據樣品組織的性質決定是否選擇包埋劑進行冷凍包埋；將組織放于冷凍切片機上進行切片，切片后將薄片放置于MALDI-MSI專用的導電載玻片上；選擇合適的基質、合適的涂覆方法將基質均勻分散于組織切片表面；待干燥后將載玻片放入MALDI質譜成像儀，利用激光激發共結晶，使其解吸電離；離子化分子經質量分析器分析后被質譜檢測器檢測并記錄；最后通過特定軟件重構呈現待測分子在組織表面的空間分布圖像。

圖1 MALDI-MSI流程圖[3]Fig. 1 Workflow of MALDI-MSI[3]

3 MALDI-MSI的樣品制備

MALDI-MSI時，樣品的制備對獲得高質量的質譜成像結果至關重要。MSI分析通常使用新鮮冷凍組織，也可以在適當處理后分析福爾馬林固定石蠟包埋的組織[5]，但這會增加樣品制備的時間，同時也會干擾MSI檢測。在樣品處理過程中，首要目標是保證組織的完整性[6]。

在MALDI-MSI樣品制備過程中最常用的方法是冷凍切片。冷凍過程必須溫和而均勻，如果組織的不同部分以不同的速率冷卻，就可能形成冰晶，導致樣品開裂，最推薦的方法是用鋁箔松散地包裹組織，并在低溫（約–70 ℃）下的液氮或酒精中冷凍約1 min。或者，也可以在冷卻的異戊烷浴（在干冰中）中進行冷凍[7]。然而，一些植物組織由于含水量較高，在切片過程中容易碎裂和褶皺，難以獲得高質量的冷凍切片。因此，通常采用包埋的方法來提高冷凍切片的質量[8]。通常使用的包埋劑有冷凍切片包埋劑（optimum cutting temperature，OCT）、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）、明膠、冰。使用OCT時，由于其含有的多聚物會影響質譜測定，因此只能將其用于樣品固定，而不能包埋整個樣品[9]。Li等[10]用MALDI-MSI分析銀杏葉中的次級代謝物時，系統比較了3種包埋材料，其中明膠包埋效果最好，推薦用于葉組織切片的包埋，其不同包埋方式對包埋效果的影響最小。CMC的包埋性能不如明膠穩定，更容易受到包埋方式的影響。對于含水多、薄而小的植物組織，不建議將冰作為包埋介質，這很可能導致圖像失真與分析物離域，緩解分析物離域的一個簡單的方法是在解凍安裝前去除包埋組織切片的包埋介質。Schmidt等[11]對比了幾種包埋介質，發現變性的白蛋白有利于穩定包埋脆弱的組織（如日本荷葉），且獲得的MALDI信號強度提高2～4倍。He等[12]開發了一種新的基于聚賴氨酸（polylysine，PLL）的組織包埋方法，并將其成功地應用于干燥和脆弱馬兜鈴屬植物（aristolochia plant，AP）根組織的MALDI-MSI分析。與明膠包埋劑相比，PLL包埋技術不僅能很好地保持植物組織的拓撲結構，使植物組織具有良好的剛性，而且通過PLL嵌入介質，實現了高空間分辨率。Dannhorn[13]提出了一種新的組織樣品包埋方法，將新鮮冷凍標本低溫包埋到由羥丙基甲基纖維素（hydroxy propyl methyl cellulose，HPMC）和 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）組成的水凝膠基質中，該水凝膠不會在組織學或分析學上干擾標準組織表征方法。

對于一些像葉片、花瓣一樣較薄、無法通過包埋切片的植物可通過平壓方式轉移到平整表面的印跡質譜成像方法完成MSI分析，如圖2所示。Wu等[14]自制了金納米粒子（Au nanoparticles，AuNP）浸漬紙印跡MSI。研究結果表明，AuNP浸漬紙壓印技術是一種可行的方法，在葉片、花瓣和球莖成像方面具有很大的潛力，樣品制備量小。該方法綜合了濾紙優異的壓印能力和AuNP的高電離效率，可以避免不均勻的基質沉積和由此產生的圖像偽影。Liao等[15]比較了幾種樣品制備方法，建立了茶葉的聚四氟乙烯印跡法，采用質譜成像法研究了茶葉中特異性代謝物在組織內的空間分布。Freitas等[16]采用聚四氟乙烯壓印法，研究了薄荷葉中黃酮類化合物的空間分布，揭示了特定代謝物在植物組織中的主要位置。

圖2 印跡質譜成像操作[8]Fig. 2 Operation of imprinted mass spectrometry imaging[8]

采集和冷凍樣本后，需要進行組織切片。使用冷凍切片機來制備組織切片，根據組織類型，選擇適宜的冷凍溫度，一般為–30～–15 ℃。同時，對切片的厚度也有一定的要求，不合適的切片厚度可能會影響其耐久性或導致表面形成波紋，從而影響從組織中提取分析物的效率。因此，通常為MALDI MS成像準備5～20 μm厚的切片[17]。近來，Velickovic等[18]受“Swiss-rolling”法啟發，開發了一種樣品制備方法，采用一體式切片可以從卷曲的根組織切片上成像并識別整個根結構上的分子，該方法大大縮短了樣品制備的時間。

雖然MALDI-MSI是一種有效的分子成像技術，但由于其有限的靈敏度，難以對所有小分子代謝物進行全局成像。因此，可視情況對切片進行一定的預處理，盡可能去除干擾物如鹽和脂溶性成分，將離子抑制降至最低，如可對切片進行短時間的浸泡和沖洗。Chen等[19]連續用乙酸銨溶液洗滌、三氟乙酸蒸汽孵育和正己烷洗滌來預處理組織切片。與未處理的樣品相比，經預處理的組織測得的信號強度增加了4.7～31.5倍。除了增強信號強度外，預處理時間和洗滌溶劑的精細優化保留了目標藥物分子的空間分布。Sun等[20]提出了一種簡單的丙酮洗滌法，以提高MALDI-MS成像的靈敏度。該方法使小分子代謝物的離子強度明顯增強，除了高含量和易離子化的脂質外，在非目標分析中還可以觀察到160多種組織小分子代謝物離子，其中大部分離子在未經丙酮浸泡下無法檢測到。

4 基質選擇與噴涂

4.1 基質選擇

MALDI基質的選擇及應用是MS成像的另一個重要步驟。MALDI基質可吸收質譜儀中發射的強激光，幫助分析物實現解吸/電離[3]。MALDIMSI通常以2，5-二羥基苯甲酸（2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB）[21]、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）[22]、芥 子 酸（sinapic acid，SA）[23]等含有π共軛體系或芳香環、可以提供質子的有機酸小分子作為基質。高分子量分析物如蛋白質、糖蛋白、低聚糖等一般選用SA、2，6-二羥基苯乙酮（2，6-dihydroxyacetophenone，DHAP）來檢測；CHCA和2-巰基苯并噻唑（2-mercaptobenzothiazole，2-MBT）通常適用于中等分子量分析物的檢測如肽和脂質；DHB和9-氨基吖啶（9-aminoacridine，9-AA）一般用來分析低分子量化合物如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸。

然而在質譜儀中，基質電離后產生的碎片離子會在低分子量區域產生很強的背景干擾，使得分析質荷比在500以下的小分子樣品比較困難。因此，發展適用于小分子檢測成像的無背景干擾的基質已成為MALDI-MSI的重要研究方向。目前，開發了許多新的基質，如多羥基黃酮[24]、槲皮素[25]、3，4-二甲氧基肉桂酸（3，4-dimethoxycinnamic acid，DMCA）[26]、3-氨 基 鄰 苯 二 甲 酰 肼（3-aminophthalhydrazide，3-APH）[27]等。除了固體基質外，研發了許多離子液體基質，其在真空下穩定且溶解度較好。裴興麗等[28]選用離子液體基質2，5-二羥基苯甲酸丁胺（2，5-dihydroxybenzoate acid butylamine，DHB-BuN），其重復性和靈敏度均優于固體基質。此外，很多研究表明納米材料如硅基材料、碳基材料、金屬及金屬氧化物和二維材料[29]能夠作為新型的MALDI基質。趙玥禎等[30]將納米Fe3O4基質用于MALDI-MS分析糖類、甘油三酯和氨基酸樣品，顯著降低了背景噪音，提高了質譜峰強度和重復性。Palermo等[31]用氟化碳鏈修飾金納米顆粒來促進質譜對小分子的檢測，并對不同飲食的小鼠結腸中的代謝物進行成像。Chen等[32]提出使用ZnO納米顆粒代替TiO2納米顆粒來作為低分子量分子成像的基質，其分散體不會堵塞噴霧器且能保持高的重現性，可較好用于腦組織中低分子量成分的成像。

4.2 基質噴涂

MALDI基質噴涂方法及其結晶是質譜成像的重要步驟，直接影響MSI的靈敏度與重現性。常用的涂覆方法有干滴法、噴霧法和升華法。干滴法極易造成基質擴散，使基質在待測物上分布不均勻，降低重復性，在MALDI-MSI實際樣品成像分析中較少使用[33]。手動噴槍法操作比較簡單，但容易受到人為因素的影響使基質噴涂不均勻，因此自動噴霧系統應用越來越廣泛。劉曉寧等[34]等對比了3種基質涂覆方式（干滴法、噴槍法和超聲噴霧法），掃描電鏡圖顯示，使用超聲噴霧法得到的基質顆粒是3種方法中最小的，基質分布更加均勻。金芬等[35]對比了蒸鍍法與噴霧法將CHCA噴于甜瓜組織上的結果，表明蒸鍍方式的質譜響應值更高。Enomoto等[36]比較了噴槍與自動噴霧器對基質DHB的涂覆效果，結果自動噴霧器法所得到的代謝物信號強度更高。然而，很多商業化的自動基質噴霧器成本較高，開發噴涂效果好且經濟實惠的涂覆方法仍然是研究的課題。許旭等[37-38]與Huang等[39]分別使用超聲霧化器噴涂基質，與ImagePrep基質噴霧儀進行對比，超聲霧化器可以產生更小而致密的基質晶體，同時成本很低。Schaefermann等[40]開發了1種具有自動旋轉結構的新型基質沉積裝置，與普通噴涂法相比，該沉積裝置可在大約5 min內實現快速沉積同時成本低廉，且在質譜峰強度和分辨率方面沒有顯著差異。升華法在操作過程中無需加入有機溶劑，重結晶形成的基質晶體顆粒較小且均一性較好[41]，從根本上解決了待測物移位的問題。Schmidt等[11]對比了噴霧法與升華法涂覆基質的效果，結果表明升華法能保留更多完整的組織信息。Shimma等[42]采用真空升華法將9-AA涂覆在姜黃的干燥組織表面，顯示了姜黃中姜黃素類成分的分布。然而，升華法在檢測靈敏度、空間分辨率和數據再現性方面存在一些缺點。Morikawa等[43]提出了一種優化的基質沉積方法——升華再結晶，與自動噴涂法相比，優化后的方法具有良好的重現性和空間分辨率。此外，升華后的重結晶步驟顯著提高了檢測代謝物（包括氨基酸、核苷酸衍生物和脂質）的能力，升華法可檢測到19個峰，而升華再結晶法可以檢測到40個峰。

5 MALDI-MSI的應用

5.1 MALDI-MSI在食品分析中的應用

食品中含有多種元素，主要有糖、蛋白質、碳水化合物以及各類氨基酸等等，其含量比直接決定著食用價值。MSI可用于食品成分分布可視化，并通過其分子量識別食品相關成分，以進行營養分析和改善質量[44]。De Oliveira等[45]用MALDI-MSI比較確定巧克力中兒茶素/表兒茶素的含量水平，將其作為商用巧克力中可可含量的標識，從而提供1種可用于快速篩選成品和生產過程中可可含量的通用工具。Hickert等[46]采用MALDI-MSI研究了被鐮刀菌屬和曲霉屬真菌感染的葡萄和玉米，發現在這些霉變的食品中檢測到赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）和伏馬毒素B-和C-系列以及部分水解伏馬毒素，這些毒素的分布并不相同。研究這些真菌產生的有毒次生代謝產物在受污染物質中的分布有利于了解感染機制，減少食品加工過程中的污染。Li等[47]建立了基質輔助激光解吸電離MALDIMSI方法，對來自8個國家的咖啡豆胚乳中蔗糖、咖啡因、咖啡酰奎寧酸等內源分子的微觀分布進行分析，顯示不同產地咖啡豆的化學成分和相對含量不同。所建立的檢測方法，可用于對咖啡豆進行質量鑒定與產品追溯。

5.2 MALDI-MSI在藥物分析中的應用

在過去的10年中，MSI逐漸成為支持現代藥物研究和開發的有力工具，它可以提供關于組織中藥物的體內分布、代謝和遞送的數據，同時還提供了內源性代謝物、脂質和蛋白質的分布圖。這使得研究人員能夠在組織切片或臨床活檢中以細胞分辨率進行藥代動力學和藥效學測量[48]。Rao等[49]開發了一種MALDI-MSI方法用于定量可視化奧曲肽在小鼠組織中的空間分布。該方法能獲得高質量的奧曲肽的空間分布圖像，而且測定的奧曲肽的組織濃度-時間曲線與基于液相色譜-質譜/質譜測定的曲線一致。Pinto等[50]使用MALDI-MSI技術觀察外用甲真菌病指甲治療制劑中包含的3種抗真菌活性成分阿莫洛芬、環吡酮胺和萘替芬在人類趾甲中的分布和滲透情況，顯示阿莫洛芬在指甲中的分布更均勻，且對感染的指甲有更好的滲透性。Ntshangase等[51]將LC-MS/MS與MALDI-MSI結合起來研究兩種抗逆轉錄病毒藥物埃替格韋和替諾福韋在健康雌性SD大鼠腦中的空間分布，顯示替諾福韋的滲透率相對較低，兩種藥物在包括大腦皮層在內的各個腦區的分布不均。顯示MALDIMSI在原位直接可視化藥物分析的能力。Barre等[52]將激光定位與MALDI結合，將7種藥物的質譜信號強度提高了2個數量級。這種高靈敏度使MSI可以觀察到藥物在人軟骨以及狗肝組織中的分布。Sun等[53]使用高分辨率定量基質輔助激光解吸/電離傅里葉變換離子回旋共振-質譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization fourier-transform ion cyclotron resonance-mass spectrometry imaging，MALDI-FTICR-MSI）同時檢測、可視化和量化實驗性纖維化小鼠和特發性肺纖維化病人類患者肺中的內源性和外源性代謝物，并評估吡非尼酮治療對代謝物水平的影響，有助于改善目前可用的治療方法。K?llback等[54]提出了一種定量MALDI-MSI方法，使用飛行時間（time of flight，TOF）和傅立葉變換離子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR）2種不同類型的質譜儀，分析小鼠腦組織切片中體內給藥西酞普蘭的水平，得到的結果與使用液相色譜-串聯質 譜（liquid chromatography?tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）所得結果相似，為使MALDI-MSI成為一種完全定量驗證方法邁出了實質性的一步。

5.3 MALDI-MSI在醫學領域中的應用

MALDI-MSI已經發展成為一種高速分析方法，能夠以與常規臨床分析（如免疫組織化學分析）相當的速度進行高通量分析。這使得MALDI-MSI成為癌癥研究中的1個生物醫學工具，并可用于臨床分析。而且不像免疫組織化學那樣局限于對單一蛋白質的研究，MSI通過1次分析可以得到多種不同成分的全面信息，可以在細胞和分子水平上更好地理解異質性疾病[55]，有助于預防、診斷、預測治療結果或做出預后。Zhang等[56]建立了從腦中高效提取和富集神經節苷脂的方法，通過MALDIMSI獲得神經節苷脂在腦中的分布，結合ESI和MALDI對腦中神經節苷脂進行定性、半定量和原位分析，為阿爾茨海默病的生物研究提供了新的視角。Shariatgorgi等[57]將MSI用于全面繪制特定大腦區域的神經遞質網絡，利用反應基質的固有化學選擇性和溴化反應基質的獨特同位素模式，識別了未知分子物種。神經遞質系統的直接成像為探索各種神經疾病如何通過神經遞質調節影響特定腦區提供了一種方法。Kurreck等[58]利用MALDIMSI技術研究分析完整的人類前列腺組織標本，這些研究確定了能夠區分良性和惡性前列腺的代謝物，使MSI技術提供的信息有助于了解前列腺癌和其他惡性腫瘤的分子發病機制。Briggs等[59]用MALDI-MSI研究早期和晚期卵巢癌患者福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）組織切片上N-聚糖的分布。與早期卵巢癌患者相比，寡聚甘露糖、復雜中性、分型和唾液酸化N-聚糖家族的空間分布都局限于晚期卵巢癌患者的腫瘤區域。Sun等[60]開發了一種新型基質1，1′-聯萘-2，2′-二胺（1，1′-binaphthyl-2，2′-diamine，BNDM）用于同時定位和定量不同組織區域的代謝產物，成功表征了存活、壞死和結締組織區域大量代謝物的空間特征。基于原位組織代謝物的數據分析顯示了肺癌潛在的代謝差異，可為腫瘤微環境分析提供新的視角。

5.4 MALDI-MSI在植物研究中的應用

5.4.1 MALDI-MSI在植物生理過程研究中的應用

MALDI-MSI已被廣泛應用于植物學研究中的內源性分子成像，為更好地理解植物的各種生理過程提供了巨大的潛力[5]。Wang等[61]利用MALDITOF-MS觀察了草莓在4個不同成熟期（綠色到紅色草莓）中檸檬酸、可溶性糖和花青素的分布差異。Montini等[62]將靶向代謝產物分析與MALDI-MSI相結合，研究了4種不同高粱品種的種子籽粒吸脹、萌發和幼苗發育72 h內高梁苦苷及其循環產物和關鍵代謝產物的積累，以及這些代謝物在2個品系中的空間分布。O'neill等[63]用MALDI-MSI結合化學衍生方法，研究了玉米自交系B73和Mo17及其正反交后代根系中游離氨基酸的分布，顯示2種玉米根系中氨基酸豐度和分布存在差異，以及雜交種的雙親遺傳特性。Sugahara等[64]使用MALDITOF分析堇菜花的藍色花瓣中花青素與黃酮類輔色素的作用機制，并分析影響花青素化學穩定性與顏色變化的因素（包括自身結構、自堆積過程、金屬離子與pH的影響）。Nakamura等[65]使用基質輔助激光解吸/電離-質譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）技術結合基質升華法，研究成熟綠色和成熟紅色番茄果實的整體組織水平在生理變化期間的時空代謝變化，有助于提高對番茄生理變化的理解。

5.4.2 MALDI-MSI在植物代謝物研究中的應用

Zhan等[66]使用MALDI-TOF/TOF串聯質譜成像方法，在分析洋蔥鱗莖組織中異構二糖的空間分布時，通過碎片的相對強度來區分同分異構體。Liu等[67]利用MALDI-MSI技術以高分辨軌道阱（Orbitrap）質譜儀研究了棉籽中脂類的空間分布規律，有助于進一步了解棉籽中這些脂質的生物學功能。Li等[68]將MALDI-MSI技術應用于藥用植物丹參特征成分的組織分布研究，顯示不同產地丹參中的化合物豐度和含量存在差異。Lu等[69]綜合使用MALDI-MSI原位脂質成像、種子組織提取物的脂質組分析和組織特異性轉錄組3種分析方法，揭示了高油和低油甘藍型油菜種子脂肪代謝的組織特異性。Araujo等[70]應用MALDI-MSI研究了綠膿桿菌TC3.4.2R3與植物病原尖孢鐮刀菌（fusarium oxysporum）單培養和共培養過程中產生的次生代謝產物，發現代謝物之間存在相互作用。Deng等[71]采用MALDI-TOF-MSI研究了4種有毒糖生物堿在不同貯藏時間馬鈴薯塊莖不同部位中的空間分布和變化。Li等[72]使用自制的自動輔助基質應用系統噴涂DHB基質溶液，分析銀杏葉組織中各種代謝物的分布。Sarabia等[73]使用液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）和MALDI-MSI的組合來分析鹽脅迫下大麥根區代謝產物和脂類的空間分布，闡明植物根部對非生物脅迫（如鹽分脅迫）的耐受機制。

6 結 語

質譜成像可使組織中成分的分布可視化，顯示其結構組成、豐度及其空間分布信息，這些優勢使其在醫學、藥學、微生物學和植物學等多個生命科學領域廣受歡迎[74]。MALDI-MSI已經為包括蛋白質、肽、寡核苷酸和多糖等大分子的分析提供了全新的分析條件，但對于小分子物質，由于基質電離后產生的相關離子在低分子量區域的背景峰的干擾，常常難以檢測。需要不斷研發適于小分子檢測的基質，如納米材料基質、離子液體基質等。同時改進儀器的空間分辨率、特異性和靈敏度，從而獲得高質量的分析圖像。相信未來質譜成像技術將會有更大的突破，使高質量質譜成像用于臨床疾病的預防和診斷、藥物在組織中的可視化定量分布分析，并為更多領域提供新的有價值的見解。