黃芪對黑木耳活性成分及抗氧化特性的影響

蒙秋霞，徐全飛，聶建軍，潘保華，馮婉君，牛宇*

（1.山西農業大學資源環境學院省部共建有機旱作農業國家重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西農業大學農業經濟管理學院，山西 太原 030006）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus var.mongholicus） 或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus）的干燥根[1]，其味甘，微溫，無毒，具有補氣升陽、益衛固表、利水消腫、托瘡生肌等功效，可煎服、生用或蜜炙用，食藥用歷史非常悠久，在我國應用比較廣泛，暢銷于國內外[2-3]。目前已從黃芪中分離鑒定出200多種成分，其中多數為皂苷、多糖和黃酮類，具有抗氧化、抗腫瘤和提高免疫力等活性[4]。研究表明，黃芪水提物可通過誘導超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）和自由基水平發揮抗氧化作用[5]。

黑木耳（Auricularia heimuer）又稱木耳、黑菜等，子實體味道鮮美，富含膠質和多種營養成分，是一種既可食用又可藥用的大型真菌[6-7]。目前，對黑木耳中的多糖、蛋白質、黃酮類、多酚類和黑色素等活性成分均有研究，其中多糖為含量最高的成分，可顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性并顯著降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LD）活性和丙二醛（MDA）含量，并能清除自由基，且具有抗衰老、抗癌、清除自由基、降低血糖濃度、增強免疫力、護肝、止咳化痰等作用[8-10]。

我國黑木耳資源比較豐富，開發和利用黑木耳有很大的前景。黑木耳液體深層發酵相對子實體的培養，具備菌絲生長快、生產周期短的優勢，且發酵出來的菌絲菌齡大都一致，也有成本低、效率高、易于工業應用等諸多優點[11]。近年來，人們開始探索用生物活性物質和微量元素研發復合基質培養食用菌，通過科學方法和特殊工藝培育具有保健功能成分的菌類產品。文獻表明，在發酵培養基中添加刺五加、天麻等生物活性成分或硒等微量元素，可促進黑木耳菌絲的生長和活性物質產生，并增強其生物活性[12-14]。目前，黃芪對黑木耳液體發酵影響的相關研究較少，僅張勁松等[15]研究了黃芪水提物對包括黑木耳在內的5種食用菌菌絲體生長的影響，深層發酵基質中添加黃芪后黑木耳菌絲體的生長狀況、活性成分和抗氧化能力的變化未見報道。因此，本試驗以黑木耳作為研究對象，在其發酵基質中添加黃芪水提物，探索其對黑木耳菌絲體生長、活性成分含量和抗氧化活性的影響，為新型功能性食藥用菌產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪：山西省渾源縣的蒙古黃芪主根；黑木耳菌種（雪梅三號）：保存于山西省農科院農業資源與經濟研究所。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率檢測試劑盒、羥基自由基測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酵母浸膏、水楊酸：天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇、硝酸鋁、硫酸鎂、磷酸二氫鉀：天津市風船化學試劑科技有限公司；黃芪甲苷、槲皮素：北京北方偉業化工技術研究院；沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；香草醛、四氯苯醌、苯酚、氯化鐵：南京化學試劑股份有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；硫酸亞鐵：無錫市晶科化工有限公司；過氧化氫：天津市東方廣誠醫藥化工有限公司；三氯乙酸：天津市光復精細化工研究所；鐵氰化鉀：國藥集團化學試劑有限公司；無水氯化亞鐵：上海依赫生物科技有限公司；氫氧化鈉：天津市大陸化學試劑廠；亞鐵嗪、硼氫化鈉：美國Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限公司；維生素B1：天津力生制藥股份有限公司。所用試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、硫酸鎂0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、瓊脂2%。

液體種子培養基：黃豆芽汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.2%、酵母浸膏0.5%、硫酸鎂0.1%、維生素B10.01%，pH自然。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（SW-GJ-1FD）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；恒溫振蕩培養箱（BS-S）：國華電器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-4）：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；真空冷凍干燥機（Christ ALPHA 2-4 LD plus）、電熱恒溫鼓風干燥箱（HG-9040S）：浙江寧波東南儀器有限公司；紫外分光光度計（721型）：上海精密科學儀器有限公司；高速多功能粉碎機（L-500A型）：浙江省永康市松青五金工具廠。

1.3 方法

1.3.1 黃芪水提物的制備

黃芪主根切片、干燥、粉碎，過60目篩后，按照料液比1∶10（質量比）加入蒸餾水，攪拌沸煮1 h，冷卻后用4層紗布過濾，收集濾液，重復沸煮過濾兩次，合并濾液，減壓濃縮至適當體積，分裝置于-20℃冰箱18 h，于冷凍干燥機內凍干，用研缽研成粉末，過篩，即得黃芪水提物干粉，置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 黑木耳菌種的活化

配制PDA固體培養基，滅菌1.5 h后趁熱倒入平板，冷卻至水汽消失，接種黑木耳菌種，培養一段時間，每天觀察菌種生長情況，選擇長勢良好的菌種用于后續試驗。

1.3.3 添加黃芪水提物的黑木耳菌絲體生長情況測定

1.3.3.1 平板培養

精密稱取4 g黃芪水提物干粉溶于20 mL雙蒸水中，配制成0.2 g/mL的黃芪水提物母液備用。在50 mL的錐形瓶中分別添加黃芪水提物母液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL，再向錐形瓶中加入熱的PDA培養基至40 mL，搖勻，配制成黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的培養基。高壓蒸汽滅菌90 min后趁熱倒入平板，每個濃度3次重復，冷卻，待培養基水汽消失后用6 mm2打孔器接入活化好的黑木耳菌種。連續培養6 d后，記錄菌落直徑，計算菌絲平均生長速率。平均生長速率/（mm/d）=（菌落直徑-接種菌餅直徑）÷培養時間。

1.3.3.2 深層培養

錐形瓶中放入黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的液體種子培養基 45 mL，在每個錐形瓶中加入5 mL培養好的黑木耳液體深層發酵母液，3次重復，在恒溫培養箱溫度28℃、轉速100 r/min下培養7 d后，將所得深層發酵液于離心機中3 500 r/min離心20 min，棄上清，用洗瓶搖洗、離心2次，將沉淀置恒溫鼓風干燥箱中60℃干燥至恒重，稱重并計算菌絲體干重。

1.3.4 添加黃芪水提物深層發酵黑木耳菌絲體的制備

1.3.4.1 黑木耳深層發酵母液的制備

配制液體種子培養基，接入活化的黑木耳菌種，28℃下以轉速100 r/min恒溫振蕩培養7 d，得到黑木耳深層發酵母液。

1.3.4.2 添加黃芪水提物的深層發酵

配制50 mg/mL溶解于液體種子培養基的黃芪水提物母液。錐形瓶中加入80 mL液體種子培養基，然后處理組添加10 mL黃芪水提物母液，使其終濃度達到5 mg/mL，對照組添加10 mL液體種子培養基，2次重復，蒸汽滅菌，冷卻后各加入10 mL黑木耳深層發酵母液，置恒溫振蕩培養箱中，28℃下以轉速100 r/min培養7 d。

1.3.4.3 菌絲體干粉及待測溶液的制備

將培養好的處理組和對照組黑木耳深層發酵液分別于3 500 r/min離心20 min，棄上清，用洗瓶搖洗、離心2次后，將沉淀置恒溫鼓風干燥箱中60℃干燥至恒重，研磨稱重，密封保存于-20℃冰箱。

測定活性成分含量時，將菌絲體干粉從冰箱取出靜置至室溫后進行。精密稱取菌絲體干粉，用50%甲醇[固液比 1∶10（g/mL）]浸提 1 h，離心收集上清液，用雙蒸水稀釋得到 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、25.0 mg/mL的菌絲體抗氧化活性待測溶液。

1.3.5 菌絲體活性成分含量的測定

總皂苷測定采用濃硫酸/香草醛法[2]，標準品為黃芪甲苷；總黃酮測定采用硼氫化鈉/四氯苯醌法[16]，標準品為槲皮素；總酚酸測定采用福林酚法[17]，標準品為沒食子酸；多糖的提取采用醇析法[18]，測定采用硫酸/苯酚法[19]，標準品為葡萄糖。

1.3.6 黑木耳菌絲體抗氧化活性的測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制25 mg/L的DPPH-乙醇溶液。按試劑盒說明書所示添加試劑，搖勻，避光靜置1.5 h，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率的按下式計算。

式中：As為添加DPPH和待測樣品的混合液的吸光度；Ar為添加無水乙醇和待測樣品的混合液的吸光度；A0為添加DPPH和無水乙醇的混合液的吸光度。

1.3.6.2 羥基自由基清除能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液。取16支10 mL EP管，先在各管中加入1 mL FeSO4溶液和2 mL水楊酸-乙醇溶液，然后加入2 mL樣品（以雙蒸水作空白對照），混勻，再加入2 mL H2O2溶液，室溫（25℃）反應1 h，在510 nm處測其吸光度。羥基自由基清除率按下式計算。

式中：Aa為添加待測樣品和H2O2溶液的混合液的吸光度；Ab為添加待測樣品和雙蒸水的混合液的吸光度；Ac為添加H2O2溶液和雙蒸水的混合液的吸光度。

1.3.6.3 還原力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、1%鐵氰化鉀、10%三氯乙酸和0.1%氯化鐵溶液。取21支2.5 mL EP管，在各管中加入0.2 mL菌絲體溶液（以雙蒸水為空白對照）、0.5 mL磷酸緩沖液和0.5 mL鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加0.5 mL三氯乙酸溶液，靜置反應20 min，再加入0.5 mL氯化鐵溶液，靜置10 min，測定700 nm處的吸光度。

1.3.6.4 亞鐵離子螯合能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制2 mmol/L FeCl2溶液和5 mmol/L亞鐵嗪溶液。先在各管中加入0.5 mL樣品（以雙蒸水作空白對照）和0.1 mL FeCl2溶液，混勻后反應5 min，然后再加入0.1 mL亞鐵嗪溶液，靜置10 min，最后在562 nm處測定吸光度。亞鐵離子螯合率按下式計算。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為待測樣品的吸光度。

1.4 數據統計分析

各試驗設3個重復，結果表示為平均值±標準差；用Duncan's多重比較檢驗各個處理數據間的差異顯著性；用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 黃芪水提物對深層培養黑木耳菌絲生長的影響

不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況見圖1。

圖1 不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況Fig.1 Mycelial growth of A.heimuer treated with different concentrations of A.membranaceus aqueous extract

添加不同濃度黃芪水提物后，平板培養和深層培養中黑木耳菌絲的生長情況均出現明顯差異。由圖1（I）可見，平板培養中各處理黑木耳菌絲為白色絲狀，黃芪水提物的添加不影響菌絲顏色；菌落近圓形。如圖1（II）所示，菌絲體平均生長速率和干重在黃芪水提物濃度為2.5 mg/mL時最大，在5.0 mg/mL時次之，隨后在5.0 mg/L～30.0 mg/mL內隨黃芪水提物濃度的升高而呈減小趨勢。平板培養中，菌絲的致密度則隨黃芪水提物濃度的升高而增大，在黃芪水提物濃度為0和2.5 mg/mL時較稀疏，在5.0 mg/mL～30.0 mg/mL時較致密。深層培養7 d后，與對照組相比，黃芪水提物濃度在2.5 mg/mL～10.0 mg/mL時能極顯著促進黑木耳菌絲體生長（P＜0.01），在15.0 mg/mL時菌絲體干重與對照組差異不顯著（P＞0.01），在 20.0 mg/mL～30.0 mg/mL時抑制了菌絲體生長，菌絲體干重極顯著低于對照（P＜0.01）。

由圖1可知，在黃芪水提物添加濃度為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL時，可顯著促進黑木耳菌絲的生長，也可使黃芪水提物對菌落大小和菌絲致密度的提升作用發揮到最大，兩個濃度對菌絲體平均生長速率和干重的影響差異不顯著（P＞0.01），且較高的添加濃度還可使更多的黃芪活性物質進入培養基，有利于活性物質向菌絲體的遷移轉化。故而本研究采用5.0 mg/mL作為后續黑木耳深層發酵中黃芪水提物的添加濃度。

2.2 黃芪水提物對深層培養黑木耳菌絲體活性成分含量的影響

黃芪水提物對深層培養黑木耳菌絲體活性成分含量的影響見表1。

表1 黑木耳深層發酵菌絲體活性成分含量Table 1 Contents of active compounds in A.heimuer mycelia in submerged fermentation supplemented with A.membranaceus aqueous extract

由表1可見，添加黃芪水提物深層發酵后，黑木耳菌絲體中的活性成分含量均有不同程度的提高。其中胞內多糖的增加最為明顯，增量達到36.78 mg/g，其次為總酚酸、胞外多糖和總黃酮，說明黃芪水提物對這些成分的影響較大。相比之下，添加黃芪水提物深層發酵后黑木耳總皂苷的增量較小。

2.3 黃芪水提物對深層培養黑木耳菌絲體抗氧化活性的影響

2.3.1 DPPH自由基清除能力

黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH·scavenging capacity of A.heimuer mycelia

如圖2所示，黑木耳菌絲體對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的增加而升高。添加黃芪水提物共發酵的黑木耳菌絲體（M1）與常規深層發酵黑木耳菌絲體（M0）清除DPPH自由基的50%效應濃度（EC50值）分別為8.30 mg/mL和20.77 mg/mL。在試驗濃度范圍內，M1的DPPH自由基清除率與對照M0相比極顯著增強（P＜0.01），在菌絲體濃度為 12.5 mg/mL 時，M1與M0的DPPH自由基清除率差異最大，是M0的2.27倍，表明培養基中添加黃芪水提物發酵可顯著促進黑木耳菌絲體DPPH自由基的清除能力。

2.3.2 羥基自由基清除能力

黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力見圖3。

圖3 黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of A.heimuer mycelia

如圖3所示，經常規深層發酵或添加黃芪提取物的深層發酵后，黑木耳菌絲體均對羥基自由基有一定的清除能力，其清除率隨著菌絲體濃度的增加而變大。M1與對照M0清除羥基自由基的EC50值分別為16.55 mg/mL和27.14 mg/mL。在菌絲體濃度為7.5 mg/mL～25.0 mg/mL時，羥基自由基清除率極顯著提高（P＜0.01），其中在濃度為10.0 mg/mL時，M1與M0的羥基自由基清除率差異最大，是M0的1.38倍，說明黃芪提取物的添加可顯著提高深層發酵黑木耳菌絲體羥基自由基的清除能力。

2.3.3 還原力

黑木耳菌絲體的還原力見圖4。

圖4 黑木耳菌絲體的還原力Fig.4 Reducing capacity of A.heimuer mycelia

從圖4可見，隨著黑木耳菌絲體濃度的增加，還原力（OD700nm）逐漸增加，呈一定的量效關系。還原力為0.5時，M1與對照M0的濃度分別為17.25 mg/mL和20.91 mg/mL。添加黃芪提取物發酵后，在5.0 mg/mL～25.0 mg/mL濃度內M1與M0的還原力有顯著差異（P＜0.05），其中在濃度為5.0 mg/mL時差異最大，M1還原力是M0的1.58倍，說明添加黃芪提取物發酵對深層發酵黑木耳的還原力有一定的提高作用。

2.3.4 亞鐵離子螯合能力

黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力見圖5。

圖5 黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力Fig.5 Ferrous ion chelating capacity of A.heimuer mycelia

如圖5所示，經常規深層發酵或添加黃芪提取物的深層發酵后，黑木耳菌絲體均具有較強的亞鐵離子螯合能力，并表現出明顯的量效關系。M1與對照M0螯合亞鐵離子的EC50值分別為10.01mg/mL和26.94mg/mL?？梢?，添加了黃芪提取物發酵后，M1亞鐵離子螯合能力顯著提高，在菌絲體濃度為5.0 mg/mL時差異最大，是M0的1.97倍，說明添加黃芪水提物可促進深層發酵黑木耳菌絲體亞鐵離子螯合能力的提高。

3 討論與結論

本試驗發現，當培養液中黃芪水提物的濃度為2.5 mg/mL～5.0 mg/mL時，對黑木耳菌絲生長的促進作用最大，菌絲體干重最高，之后繼續增加黃芪水提物濃度，對菌絲生長的促進作用不再明顯，在高濃度范圍內，菌絲生長反而受到抑制。這一結果與已有報道一致。陳麗華等[20]研究了丹參、絞股藍、決明子、紅曲、銀杏葉、何首烏、葛根和苦蕎對黑木耳液體培養生物量的影響，認為它們中存在對黑木耳的生長具有促進和抑制作用的兩種因子，促進因子使其菌絲體干重增加，而濃度的提高使抑制因子的作用增強，從而導致菌絲體干重下降。至于其中促進因子和抑制因子的具體成分，及其影響黑木耳菌絲生長的作用機理有待進一步研究。

據張勁松等[21]報道，添加黃芪水提物可顯著提高深層發酵香菇菌絲體中的活性成分，其胞外多糖、胞內多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為常規發酵對照的 1.16、1.09、1.66、1.25、2.20 倍。本試驗也有類似發現，添加5 mg/mL黃芪水提物后，深層發酵黑木耳菌絲體中的活性成分含量顯著增加，其胞外多糖、胞內多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為對照的1.88、1.24、2.65、1.61、1.85 倍?？梢?，黃芪水提物能夠促進深層發酵食藥用菌活性成分的合成與積累。此外，添加5.0 mg/mL黃芪水提物后，深層發酵黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力和亞鐵離子螯合率分別為常規發酵對照菌絲體的2.27、1.38、1.58、1.97倍。該結果也與其他學者的報道類似，張穎等[14]研究了刺五加固體栽培基質對黑木耳子實體營養成分及其多糖化學組成、抗氧化性的影響，發現刺五加的添加明顯提高了黑木耳的營養成分和多酚含量，并改變了黑木耳單糖組成比例，其對氧自由基和ABTS+自由基的清除能力也分別提高了3.2倍和2.7倍。值得一提的是，在其他食藥用菌的培養基質中添加生物活性物質也取得相似的效果。如辛燕花等[22]報道，添加何首烏深層發酵后，靈芝菌絲體中多糖、總三萜和黃酮含量分別是對照的2.0、1.5倍和3.2倍；靈芝菌絲體中還原力、超氧陰離子自由基清除率和羥基自由基清除率分別是對照的4.5倍、1.5倍和2.0倍。由此可見，培養基質中添加生物活性物質，改變了黑木耳等食用菌化學成分的合成代謝途徑，從而促進了其生物量、活性物質含量和功能的提升。

本試驗結果表明，黃芪水提物的添加可促進深層發酵黑木耳菌絲體的生長，并可提升其活性物質含量和抗氧化活性。本研究可為黃芪的開發利用及新型食藥用菌產品的研發提供參考。后續可在黃芪添加對黑木耳和其他食藥用菌子實體的形成、生產性能、化學成分、生物活性的影響方面展開深入研究。