黑苦蕎麥殼高聚原花青素降解及其抗氧化活性分析

高潔，趙妍

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

黑苦蕎麥，屬廖科雙子葉植物[1]，加工過程中會產(chǎn)生大量的黑苦蕎麥殼，其質(zhì)量約占黑苦蕎麥籽粒的1/3[2]，研究發(fā)現(xiàn)黑苦蕎麥殼含約5%左右的酚類物質(zhì)[3]。其中最受關(guān)注的是原花青素，原花青素具有非常強的抗氧化能力[4]以及抗菌[5]、消炎[6]、抑制腫瘤[7]等生物活性價值。生物活性強弱主要取決于原花青素結(jié)構(gòu)和聚合度大小[8]。黑苦蕎麥殼原花青素主要由原花青素單體（兒茶素或表兒茶素）、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體等組成，按聚合度大小可劃分為低聚原花青素（聚合度≤4）和高聚原花青素（聚合度＞4）[9]。研究發(fā)現(xiàn)，黑苦蕎麥殼原花青素中高聚原花青素占比達(dá)到55%，由于聚合度高，分子量大，很難透過生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，一定程度上降低了其生物利用度和抗氧化活性[10]，因此將高聚原花青素轉(zhuǎn)化成低聚原花青素是提高黑苦蕎麥殼附加值的重要途徑之一。

目前，國內(nèi)外對于高聚原花青素的降解方法主要分為化學(xué)降解和生物降解兩種。化學(xué)降解主要通過酸[11]、堿[12]、氫化降解[13]等，將原花青素高聚體中C4-C8之間鏈接鍵斷裂，得到低聚體；生物降解技術(shù)則采用微生物及生物酶將原花青素聚合物苯環(huán)打開降解為低聚物[14]。原花青素可廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域，因此對其純度有非常高的要求，考慮到普通化學(xué)降解劑和生物降解菌參與降解反應(yīng)后不易進(jìn)行分離，勢必會影響產(chǎn)物的純度和后續(xù)應(yīng)用，故提出采用固體酸作為催化劑降解高聚原花青素的思路。通過查閱文獻(xiàn)資料證實，固體酸催化劑降解原花青素高聚物的想法是可行的，陳衛(wèi)航等[15]利用SO42-/TiO2固體酸降解葡萄籽高聚原花青素，發(fā)現(xiàn)納米級TiO2制備出的含H2SO4濃度為2 mol/L的SO42-/TiO2固體酸催化劑，降解率可達(dá)到61.18%；魏冠紅[16]采用固體酸I號強酸樹脂降解玫瑰紅葡萄籽中原花青素高聚體，聚合度從6.26下降到2.30，下降了3.96個單位。徐旺等[17]采用723型陽離子樹脂降解花生紅衣中高聚原花青素，得到平聚合度為2.55的低聚原花青素。

Amberlyst系列固體酸催化劑，它是用苯乙烯和二乙烯苯在特殊制孔劑作用下經(jīng)懸浮共聚成的珠體，再經(jīng)磺化反應(yīng)得到具有大孔網(wǎng)狀、帶有磺酸基團(tuán)的高分子聚合物，屬于磺酸型陽離子交換樹脂。它的最高使用溫度不超過120℃，適合高聚原花青素降解這類低溫催化反應(yīng)；金屬負(fù)載型固體酸催化劑（SO42-/TiO2）屬于高溫催化劑，最高使用溫度為220℃，在低溫條件下，催化劑活性較低[18]。而且Amberlyst系列固體酸催化劑具有非凝膠型孔結(jié)構(gòu)，比凝膠型樹脂（723型陽離子樹脂）具有更大的表面積和更強的穩(wěn)定性，從而更好地結(jié)合底物進(jìn)行催化反應(yīng)[19]。綜上，本研究考察不同種類固體酸催化劑的催化作用，以平均聚合度為評價指標(biāo)，探討了不同降解條件對黑苦蕎麥殼高聚原花青素 （black tartary buckwheat shell polymeric proanthocyanidins，BPPC）降解的影響，優(yōu)化了降解工藝，并評價了催化降解產(chǎn)物的抗氧化活性，為黑苦蕎麥殼的開發(fā)利用和深入研究提供了理論依據(jù)，具有一定的實際應(yīng)用價值和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑苦蕎麥（西農(nóng)9940），2021年產(chǎn)自陜西榆林；抗壞血酸（vitamin C，VC）、2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT），均為分析純：天津尖峰生物制品有限公司；固體超強酸[HND-32（SO42-/ZrO2）、HND-34（SO42-/Fe2O3）]，磺酸型陽離子交換樹脂 [Amberlyst-45（A-45）、Amberlyst-35（A-35）、Amberlyst-15（A-15）]：南大合成有限公司；氯化鐵、鐵氰化鉀（分析純）：天津市大港億中化工廠；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 [2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鄭州市中原科技玻璃儀器廠；紫外可見分光光度計 （UV-1800）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；紅外光譜儀（NEXUS670）：美國尼高力儀器公司；冷凍干燥機（LGJ-25C）：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將干燥后的黑苦蕎麥殼粉碎，過100目篩，使用石油醚對得到的黑苦蕎麥殼粉進(jìn)行充分脫脂。脫脂后的黑苦蕎麥殼粉采用溶劑法提取原花青素，提取劑為60%的乙醇溶液，料液比為 1∶15（g/mL），50℃水浴浸提60 min。采用乙酸乙酯作為萃取劑對黑苦蕎麥殼原花青素粗提液進(jìn)行分級，溶液分層后，水相為BPPC，經(jīng)-80℃凍干，得到高聚原花青素粉末。有機相為黑苦蕎麥殼低聚原花青素（black tartary buckwhea shell oligomeric proanthocyanidins，BOPC）。

1.3.2 固體酸降解工藝

將0.5 g高聚原花青素粉末加入10 mL去離子水中，溶解，然后在高聚原花青素溶液中加入一定質(zhì)量的固體酸催化劑，并將其置于已設(shè)置好相應(yīng)溫度和時間的加熱磁力攪拌器中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾催化劑終止反應(yīng)，即可得到高聚原花青素降解液。

1.3.3 黑苦蕎麥殼高聚原花青素固體酸降解單因素試驗

選擇 2 種固體超強酸 HND-32（SO42-/ZrO2）、HND-34（SO42-/Fe2O3）和3種磺酸型陽離子交換樹脂Amberlyst-45（A-45）、Amberlyst-35（A-35），Amberlyst-15（A-15）催化降解BPPC，以原花青素平均聚合度為評價指標(biāo)，在催化溫度為65℃、催化劑添加量為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的基礎(chǔ)上，研究催化時間（20、30、40 min）對黑苦蕎麥殼原花青素平均聚合度的影響，從而篩選出一種合適的催化劑。

對篩選出的催化劑的催化條件進(jìn)行工藝優(yōu)化，研究催化劑不同添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、催化時間（10、20、30、40、50 min）、催化溫度（45、55、65、75、85℃）對黑苦蕎麥殼原花青素平均聚合度的影響。

表1 催化劑理化參數(shù)Table 1 Physicochemical parameters of catalysts

1.3.4 黑苦蕎麥殼高聚原花青素固體酸降解正交優(yōu)化試驗

依據(jù)催化降解的單因素試驗結(jié)果，以各單因素為自變量，平均聚合度為因變量，設(shè)計正交試驗，見表2。

表2 試驗設(shè)計水平編碼Table 2 Levels and factors in the experimental design

1.3.5 原花青素平均聚合度的測定

采用分光光度法檢測樣品液的平均聚合度，見下式。

式中：m為原花青素質(zhì)量含量，μg；M為兒茶素相對分子質(zhì)量，290；n原花青素物質(zhì)的量，μmol。

1.3.5.1 原花青素質(zhì)量濃度測定

參照文獻(xiàn)[20]中方法，略作修改。在甲醇體系中，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制不同濃度的兒茶素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，分別加入4 mL含4%香草醛的甲醇溶液和2 mL濃鹽酸溶液混勻，于常溫下避光反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后取出，以甲醇代替樣品作為空白對照，測定500 nm處吸光度，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2.484 4X+0.048 9，R2=0.993 6。取1 mL樣品稀釋液，按以上步驟測定。

1.3.5.2 原花青素含量測定

參照文獻(xiàn)[21]中方法，略作修改。在乙酸體系中，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制兒茶素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL樣品加入5 mL含4%鹽酸和0.5%香草醛的乙酸溶液，避光于20℃下反應(yīng)10 min，以乙酸替代樣品作空白組，測定500 nm處的吸光度，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5.041 8X+0.053 6，R2=0.998 6。取1 mL樣品稀釋液，按以上步驟測定。

1.3.6 原花青素傅里葉紅外光譜掃描分析

參照文獻(xiàn)[22]，分別取2 mg左右的黑苦蕎麥殼高聚原花青素樣品和固體酸降解產(chǎn)物，加入200 mg KBr混勻，在瑪瑙研缽中充分研磨、壓片，在傅里葉紅外光譜儀中，首先對純KBr薄片進(jìn)行背景掃描，然后再對含有原花青素樣品的KBr薄片進(jìn)行掃描，得到紅外光譜圖。紅外光譜條件為掃描頻率：64次/s；掃描范圍：600 cm-1～4 000 cm-1，其分辨率為 4.0 cm-1。

1.3.7 原花青素體外抗氧化能力的測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻(xiàn)[23]中方法，略作修改。將100 μL樣品溶液加入到100 μmol DPPH甲醇溶液中，混勻后37℃下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度，空白組為甲醇。DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：A0和A分別代表空白組和樣品組的吸光度。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[24]中方法，略作修改。所有試劑采用50 mmoL/L磷酸鹽緩沖溶液配制。將50 μL樣品溶液加入到150 μL ABTS工作液中，混勻后30℃下避光反應(yīng)30 min，于734 nm處測定吸光度，空白組為磷酸鹽緩沖溶液。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：A0和A分別代表空白組和樣品組的吸光度。

1.3.7.3 亞鐵離子螯合能力的測定

參照文獻(xiàn)[25]中方法，略作修改。取0.5 mL樣品溶液，依次加入50 μL 2 mmoL/L氯化亞鐵溶液和0.2 mL 5 mmoL/L鐵氰化鉀溶液，混勻后30℃下反應(yīng)10 min，于562 nm處測定吸光度，空白組為超純水。亞鐵離子螯合能力計算公式如下。

式中：A0和A分別代表空白組和樣品組的吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復(fù)3次，通過SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s進(jìn)行顯著性分析，Origin 2019進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑苦蕎麥殼原花青素平均聚合度的測定

低聚、高聚原花青素占原花青素提取物比例及平均聚合度結(jié)果見表3。

表3 低聚、高聚原花青素占原花青素提取物比例及平均聚合度Table 3 Proportions of oligomeric and polymeric proanthocyanidins to proanthocyanidin extract and average degree of polymerization

2.2 固體酸催化劑的篩選

催化劑種類對原花青素平均聚合度的影響結(jié)果見圖1。

圖1 催化劑種類對原花青素平均聚合度的影響Fig.1 Effect of catalyst content on average polymerization degree of proanthocyanidins

原花青素平均聚合度越低，表明固體酸催化劑催化效果越好。由圖1可知，催化時間從20 min增加到40 min時，固體超強酸HND-32、HND-34均未呈現(xiàn)出良好的催化效果，其原因可能是HND-32、HND-34為高溫型催化劑，使用溫度范圍分別為80℃～220℃和80℃～380℃，在低溫條件下，催化劑活性較低，不適用該降解反應(yīng)[18]。磺酸型陽離子交換樹脂催化效果如下：A-35＞A-45＞A-15。在 A-35 為催化劑時，反應(yīng)進(jìn)行40 min，原花青素平均聚合度下降到2.32，A-15和A-45催化反應(yīng)時原花青素平均聚合度分別下降到4.56、3.02，A-35的催化效果顯著優(yōu)于A-15和A-45（p＜0.05）。這是因為高聚原花青素降解效果與陽離子交換樹脂酸容量有關(guān)，催化劑A-45的酸容量最大（5.5 mmol/g）、A-35 次之（5.2 mmol/g），A-15 最小（4.7 mmol/g），酸容量太大，會直接將原花青素降解為花青素，酸容量太小，不能完全將C4-C8鏈接鍵斷開[26]，因此選擇催化劑A-35較為合適。

2.3 黑苦蕎麥殼高聚原花青素固體酸降解單因素試驗

催化劑添加量對原花青素平均聚合度的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 催化劑添加量對原花青素平均聚合度的影響Fig.2 Effect of catalyst content on average polymerization degree of proanthocyanidins

催化劑添加量從6%上升至10%時，平均聚合度從4.74下降至2.62，變化顯著（p＜0.05），當(dāng)催化劑添加量大于10%時，降解液的平均聚合度趨于平穩(wěn)，無顯著差異（p＞0.05）。該結(jié)果表明，10%的催化劑添加量已可提供足夠多的酸性位點與底物相接觸，過量的催化劑對降解效果無顯著影響，考慮到能源消耗等問題，最終確定最佳催化劑添加比例為10%。

催化時間對原花青素平均聚合度的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 催化時間對原花青素平均聚合度的影響Fig.3 Effect of catalyst time on average polymerization degree of proanthocyanidins

在催化時間40 min時，降解液的平均聚合度下降至2.64，而超過此時間后，反應(yīng)液的平均聚合度變化不大（p＞0.05），加之在超過60℃下若過長時間反應(yīng)會導(dǎo)致原花青素內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，例如發(fā)生開環(huán)反應(yīng)[27]等，不再是活性強的低聚原花青素結(jié)構(gòu)，因此最終確定40 min為最佳催化時間。

催化溫度對原花青素平均聚合度的影響結(jié)果如圖4所示。

在45℃到85℃之間，原花青素的平均聚合度伴隨溫度的升高而逐漸下降，其中45℃～75℃區(qū)間，下降顯著（p＜0.05），說明原花青素降解效果良好；而在75℃以后，反應(yīng)液的平均聚合度下降不再明顯（p＞0.05）。而且原花青素含有多羥基結(jié)構(gòu)，溫度越高穩(wěn)定性越差，容易分解[27]，故最終確定75℃為最佳催化溫度。

2.4 黑苦蕎麥殼高聚原花青素固體酸降解正交優(yōu)化試驗結(jié)果分析

正交優(yōu)化試驗直觀分析見表4，正交優(yōu)化試驗方差分析見表5。

表5 平均聚合度方差分析Table 5 Analysis of variance of average degree of polymerization

由表4及表5可知，對平均聚合度來說，催化劑添加量和催化溫度對其有極顯著影響（p＜0.01），催化時間對其有顯著性影響，（p＜0.05）。各因素對高聚原花青素降解反應(yīng)的影響主次順序為：催化溫度＞催化劑添加量＞催化時間適宜降解工藝條件：A2B3C2，即催化劑添加量為10%，催化溫度為65℃，催化時間為40 min。此條件下，原花青素的平均聚合度從6.89下降至2.37。

2.5 傅里葉紅外光譜分析

對黑苦蕎麥殼高聚原花青素及其催化降解產(chǎn)物進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同樣品的紅外光譜圖對比Fig.5 FTIR spectrograms of different samples

高聚原花青素3396cm-1處為原花青素分子結(jié)構(gòu)中羥基由氫鍵作用引起的伸縮振動；1 610 cm-1、1 451 cm-1處是苯環(huán)骨架中C C的伸縮振動吸收峰；1 364 cm-1、1 263 cm-1、1 072 cm-1的吸收峰為原花青素分子結(jié)構(gòu)C環(huán)的C—O—C的伸縮振動。可以發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物特征峰對應(yīng)的區(qū)域與高聚原花青素極為相似，表明用A-35降解后，原花青素的酚羥基等重要官能團(tuán)沒有發(fā)生明顯變化，分子內(nèi)結(jié)構(gòu)沒有被破壞[28]，降解效果良好。

2.6 體外抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除能力分析

高聚原花青素降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力對比分析見圖6

圖6 高聚原花青素降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力對比分析Fig.6 Comparative analysis of DPPH radical scavenging capacity of degradation products of polymeric proanthocyanidins

考察DPPH自由基清除能力是常用的體外抗氧化測定方法，常用IC50值表示，IC50值越低表明物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力越強。由圖6可見，降解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力顯著低于BOPC和BHT（p＜0.05），但其明顯高于 BPPC（p＜0.05）且與 VC無顯著差異（p＞0.05）。可能因為BPPC經(jīng)過固體酸降解后，其平均聚合度下降，DPPH自由基清除能力得到顯著提高（p＜0.05），根據(jù)IC50計算，降解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力是BPPC的1.92倍。

2.6.2 ABTS+自由基清除能力分析

高聚原花青素降解產(chǎn)物的ABTS+自由基清除能力對比分析見圖7。

圖7 高聚原花青素降解產(chǎn)物的ABTS+自由基清除能力對比分析Fig.7 Comparative analysis of ABTS+radical scavenging capacity of degradation products of polymeric proanthocyanidins

由圖7可見，降解產(chǎn)物對ABTS+自由基的IC50值顯著低于BPPC，說明BPPC經(jīng)固體酸催化劑降解后，降解產(chǎn)物對ABTS+自由基的清除能力得到顯著提高（p＜0.05），與 VC無顯著性差異（p＞0.05），但是顯著低于BOPC和BHT（p＜0.05）。根據(jù)IC50計算，降解產(chǎn)物對ABTS+自由基的清除能力是BPPC的4.78倍。根據(jù)文獻(xiàn)報道，鄧兆雯[29]比較了不同聚合度的荔枝皮原花青素的抗氧化活性，表明原花青素的聚合度越低，其對ABTS+自由基清除能力越強，這可能是由于隨著原花青素聚合度的增加，原花青素分子中一部分酚羥基在分子內(nèi)部形成氫鍵，使具有活性的酚羥基大大減少，因而整體對ABTS+自由基的清除能力下降；反之隨著原花青素聚合度的下降，其活性酚羥基增加，對ABTS+自由基的清除能力上升。

2.6.3 亞鐵離子螯合能力分析

高聚原花青素降解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力對比分析見圖8。

圖8 高聚原花青素降解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力對比分析Fig.8 Comparative analysis of Fe2+chelating ability of degradation products of polymeric proanthocyanidins

鐵是機體內(nèi)一種重要且必需的元素，但鐵含量的過剩也會造成機體的損害。過量的亞鐵離子通過引發(fā)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生過氧自由基誘發(fā)脂質(zhì)氧化，是極好的促氧化劑，但當(dāng)其處于螯合狀態(tài)時，便失去了促氧化的能力[30]。故本試驗通過測定樣品對亞鐵離子的螯合作用，來判定其是否具有較好的間接抗氧化能力。結(jié)果如圖8所示，由于濃度大于1.0 mg/mL時，部分樣品螯合亞鐵離子能力能達(dá)到100%，無法比較。所以在選擇分別在0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的濃度條件下進(jìn)行試驗。結(jié)果表明高聚原花青素降解產(chǎn)物螯合亞鐵離子的能力與BOPC和BPPC相比無顯著性差異（p＞0.05），但均明顯強于VC（p＜0.05）。這表明原花青素螯合亞鐵離子能力與其平均聚合度關(guān)系不大。周瑋婧[25]比較了不同品種的荔枝皮原花青素的亞鐵離子螯合能力，發(fā)現(xiàn)不同品種的荔枝皮原花青素的聚合度雖然不同，但是亞鐵離子螯合能力卻無顯著性差異，與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文以黑苦蕎麥殼為原料，經(jīng)脫脂后提取得到原花青素粗提物，通過萃取分離，得到了高聚原花青素。從5種固體酸催化劑中篩選出適合降解黑苦蕎麥殼高聚原花青素的催化劑，確定磺酸型陽離子交換樹脂Amberlyst-35（A-35）為固體酸催化劑。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化獲得最佳的催化降解工藝參數(shù)如下：催化劑添加量10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、催化時間40 min、催化溫度65℃。在此條件下，降解后的原花青素平均聚合度為2.37。傅里葉紅外光譜顯示，原花青素功能基團(tuán)未被固體酸催化劑破壞，降解產(chǎn)物的DPPH、ABTS+自由基清除能力分別提高了1.92倍和4.78倍，亞鐵離子螯合能力變化不顯著。綜上，固體酸催化劑A-35降解作為一種效果好、操作便捷的方法，可用于黑苦蕎麥殼高聚原花青素的降解，從而得到聚合度低、抗氧化活性更強的低聚原花青素。