與牙髓干細胞相關的骨組織工程研究進展

魏代福　魏馨蕊　趙戩

【摘要】 牙髓干細胞來自成人或兒童的牙髓組織，非常容易獲得，且具有良好的增殖分化能力，被認為是在組織再生領域最有應用潛力的干細胞之一。牙髓干細胞在骨組織工程領域的研究由來已久，本文就牙髓干細胞的成骨分化潛能、相關的動物實驗和臨床試驗、炎癥牙髓干細胞和同種異體牙髓干細胞幾個方面的研究進展作綜述。

【關鍵詞】 牙髓干細胞 組織工程 成骨分化 骨再生

Advances of Bone Tissue Engineering Related to Dental Pulp Stem Cells/WEI Daifu， WEI Xinrui， ZHAO Jian. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： -175

[Abstract] With excellent multilineage differentiation potential and high proliferation rate， dental pulp stem cells are considered as one of the most promising stem cells in the field of tissue engineering， which can be easily obtained from dental pulp tissues of adults and children. Potential applications of dental pulp stem cells in bone tissue engineering have been studied for a long time， and this article mainly discusses it’s osteogenic differentiation potential， relevant animal experiments and clinical trials， as well as allogenic pulp stem cells and stem cells derived from inflammatory dental pulp tissues.

[Key words] Dental pulp stem cells Tissue engineering Osteogenic differentiation Bone regeneration

First-author’s address： School and Hospital of Stomatology， Laborartory of Periodontics， China Medical University， Shenyang 110002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.042

組織工程是基于細胞或蛋白質與生物材料相結合來生成新組織的多學科領域，其中，骨組織再生一直以來都是學者努力探索的方向。成體干細胞是在成體組織或器官中發現的未分化細胞，可以自我更新，并能夠分化成多種細胞系的細胞。從各個組織中分離出的干細胞具有不同的生物特性以及不同的成骨分化能力，其中骨髓來源的干細胞是被研究最多的一種，而來源于牙髓的干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）也因為其優秀的成骨分化潛能和易獲得性受到廣泛研究，來自脫落乳牙牙髓的干細胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED）同樣具有多向分化的能力。有研究表明，在生長因子、轉錄因子和受體分子的調控下，DPSCs可以分化成成骨細胞、脂肪細胞、成牙本質細胞以及神經細胞等[1]。

1 牙髓干細胞的成骨分化能力

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）促進骨再生主要與其成骨分化能力有關。造血干細胞和MSCs產生引起骨吸收的破骨細胞和介導骨形成的成骨細胞，對于骨組織的重建至關重要。骨組織內的MSCs在未受到組織損傷和骨改建重塑的信號刺激時，一般都是處于相對靜止的狀態，而在受到一些成骨相關刺激因子（如骨成型蛋白）刺激后，可立即分化成成骨細胞。牙髓干細胞的成骨分化潛能已經被文獻證實，地塞米松、L-抗壞血酸和β-甘油磷酸補充劑可以廣泛誘導其向成骨細胞分化。為了進一步證實其成骨分化能力，骨特異性蛋白如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、Osterix和矮小相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的表達也已被證實[2]。

許多基因和生長因子都可以調節牙髓干細胞成骨分化。除了Runx2等早已認為是MSCs成骨分化中關鍵的轉錄因子外，近些年研究發現，HOX轉錄因子在胚胎發育過程中能夠調節骨骼模式，并在成人骨組織中表達，HOX基因在成人骨組織再生和骨折愈合過程中起到重要作用[3]。微核糖核酸（MicroRNAs）可以通過調節轉化生長因子-β/骨成型蛋白和Wnt/β-catenin信號通路來調節成骨分化基因表達[4]。Jaukovi?等[5]探究白細胞介素-17和堿性成纖維細胞生長因子對DPSCs和SHED的影響時發現，前者對DPSCs和SHED的早期成骨分化起促進作用，然而后者則起到了較為強烈的抑制作用。還有學者發現LncRNA LEF1-AS1的表達與DPSCs的成骨分化有關，并且其過表達能夠促進成骨分化，可與mi-R-24-3p協同作用來調節骨再生進程[6]。

2 動物實驗

近些年來，有關牙髓干細胞成骨的動物實驗研究有許多報道，主要可以歸納到以下幾個方面。

2.1 DPSCs促進骨再生的有效性 近些年，學者們開展了大量的動物實驗來探究牙髓干細胞的體內成骨分化能力，包括DPSCs/SHED與羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）或β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）等支架材料植入免疫缺陷動物的脛骨、顱骨、頜骨以及皮下等處的研究[1]。有許多實驗比較了單獨應用支架材料和聯合應用支架材料及DPSCs/SHED對骨缺損區治療效果的差異[7-11]，大多數動物實驗的結果都顯示了人類牙髓干細胞優秀的成骨能力，與支架復合可以產生比單獨使用支架材料更大的骨增量。也有少數實驗未發現牙髓干細胞明顯的體內成骨優勢，如Annibali等[7]將β-TCP單獨植入和聯合DPSCs植入小鼠顱骨缺損區，12周后通過Micro-CT和正電子成像術比較分析新生骨密度差異，發現二者無明顯差異，推測可能是DPSCs發揮成骨分化作用的最佳條件未滿足。

2.2 DPSCs促進骨再生的機制探索 為了闡明MSCs植入體內后是直接通過成骨分化參與骨再生進程還是通過旁分泌效應間接促進骨再生，Collignon等[12]將熒光標記的小鼠牙髓干細胞載入膠原，并植入到小鼠顱頂缺損處。通過免疫組化分析發現DPSCs在移植后3個月出現在愈合的缺損中，并且它們在軟骨細胞樣細胞中迅速分化，表達所有預期的特征標記。表明植入的DPSCs能夠在缺損區微環境中存活，并通過類似軟骨內骨化過程直接參與修復，但不排除DPSCs旁分泌作用的影響。DPSCs在治療骨質疏松癥方面的研究也有了新的進展，Kong等[13]將肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因和熒光素酶基因修飾的DPSCs導入去卵巢的小鼠體內，發現DPSCs可以存活1個月以上，大多數的DPSCs都分布在肺和肝臟，僅有少部分存于骨骼。DPSCs或DPSCs-HGF移植可明顯減少去卵巢所致的股骨遠端干骺端松質骨丟失，且DPSCs-HGF具有更強的緩解骨丟失的能力。提示DPSCs-HGF系統灌注治療去卵巢所致骨丟失是一種潛在的治療方法，其猜測這可能與旁分泌機制有關。

2.3 含DPSCs注射式凝膠及DPSCs膜片技術 除了目前常用的支架材料，如羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、膠原海綿等，注射凝膠和無支架的DPSCs膜片技術也受到學者們的關注。Hu等[14]比較了在豬牙周炎骨缺損模型中直接注射DPSCs和植入DPSCs膜片兩種方法促進骨再生效果的差異，術后12周檢測發現兩種方法均能有效促進骨再生，而膜片植入組的新生骨量明顯大于注射組。為探究載有MSCs的水凝膠在體內成骨的能力，Jang等[15]將混入DPSCs的共聚物溶液注射進小鼠的背部皮下，溶液在體內立即形成水凝膠。6周后取出水凝膠，經Micro-CT掃描、基因表達檢測和組織學染色，發現DPSCs在體內的水凝膠中的分化為成骨細胞，提示了這種方法或許可以作為一種侵入性小的骨組織再生手段。此外Xia等[16]也探究了一種可注射型支架上DPSCs的增殖、成骨分化以及骨基質礦化形成的能力，發現在復合了納米氧化鐵的磷酸鈣水門汀支架上DPSCs的堿性磷酸酶活性和成骨基因表達比在單獨的磷酸鈣水門汀支架要高出2～3倍。并且納米氧化鐵還能提升干細胞附著條件，具有良好的應用前景。有些學者還研究了無支架的DPSCs膜片移植技術，Fujii等[17]將用某種向日葵黃質衍生物（helioxanthin derivative，HD）處理過的DPSCs膜片移植到小鼠顱骨缺損區，8周后影像學觀察發現移植區有明顯的骨再生，并且再生量要比DPSCs的骨成型蛋白處理組要多。該研究團隊后來又將標記有PKH26的向日葵黃質衍生物處理的DPSCs膜片移植到小鼠脛骨骨折中，14 d后取出骨折部位的骨組織進行免疫熒光染色發現DPSCs膜片定植于骨折區域，并促進骨形成，表示無支架DPSCs膜片技術可作為DPSCs應用于骨再生的一種選擇[18]。

2.4 DPSCs胞外囊泡的成骨能力 MSCs來源的胞外囊泡具有組織修復和抗炎的特性，Imanishi等[19]探究了DPSCs的胞外囊泡在骨再生中發揮的作用，提取了DPSCs的胞外囊泡并將之與膠原結合注入小鼠顱骨缺損區，設對照組為載有DPSCs的膠原組，4周后取出植入區的骨塊發現實驗組和對照組產生的骨量相似，提示DPSCs的胞外囊泡或許也可以作為骨組織再生的一種有效的手段。

大量的動物實驗已經證實了牙髓干細胞體內促進骨再生的良好應用前景，并且牙髓干細胞體內應用方式也受到學者們的廣泛關注，但是要構建最佳的DPSCs成骨分化微環境以最大化發揮其促進骨再生能力則還需要進一步的研究[20]。

3 臨床試驗

除動物實驗之外，近些年也有部分DPSCs成骨研究的臨床試驗的報道，大多數試驗都是探索DPSCs在人體各部位應用的有效性。Barbier等[21]將從患者第三磨牙中提取出的DPSCs與膠原混合植入拔牙窩，6個月后發現加DPSCs的植入組在新生骨密度和根尖骨隔的高度變化上與單獨植入膠原組無明顯差異，這與當初部分學者的類似試驗得出的結果相反[22]。最近也有學者將DPSCs和膠原海綿植入牙周炎的骨缺損區，經過6個月和12個月的復查，發現與僅植入海綿組相比，實驗組有著更大程度的骨再生，并且探診深度和附著水平獲得更顯著的改善[23]。此外，還有學者將牙髓干細胞和HA-膠原海綿支架植入腭裂患者的牙槽骨裂區，用于關閉裂隙，試驗設對照組一（骨成型蛋白-2處理組）和組二（髂骨移植組）。結果表明，6個月后DPSCs組和組二新生骨量相似，明顯高于組一。此外，關于術后并發癥，組一術后腫脹發生率為37.5%，組二供區疼痛發生率為87.5%，而DPSCs組未發現并發癥[24]。Hernández等[25]選取了22例帕金森病老年患者，將其分為實驗組和對照組，將載有DPSCs的膠原植入實驗組牙周骨缺損區域，而對照物則無DPSCs植入，并在術前和術后6個月采集受試者唾液標本，測定抗氧化劑、超氧化物歧化酶、過氧化脂質和白細胞介素的總濃度。6個月后，影像學檢查發現實驗組的植入區骨密度要高于對照組，并且與對照組相比，實驗組超氧化物歧化酶水平顯著更高而IL-1β水平則較低，其推測DPSCs改善受試者骨密度可能與升高超氧化物歧化酶和降低IL-1β水平有關。

雖然絕大多數臨床試驗表明DPSCs在人體內許多部位均能發揮良好的效果，但目前與DPSCs成骨相關的臨床試驗仍然較少，牙髓干細胞治療的應用方向和具體的應用方式方法的確立還需要未來更多的臨床試驗來奠定基礎。

4 炎癥牙髓干細胞及同種異體牙髓干細胞

一些學者還探究了來源于炎癥牙髓的DPSCs成骨特性。Li等[26]提取了2例牙髓炎患者的牙髓干細胞并將其與β-TCP混合植入患者牙周骨缺損處，9個月后植骨區域顯示良好的骨再生，其將炎癥牙髓的牙髓干細胞和正常的牙髓干細胞比較發現，雖然細胞原代培養成功率和生長狀態受到一定程度影響，但炎癥牙髓干細胞仍表達了健康牙髓來源干細胞的標志物，并保持了其多向分化能力。Xue等[27]用辛伐他汀處理炎癥牙髓干細胞后，發現低劑量的辛伐他汀可以促進炎癥牙髓干細胞的增殖能力，并降低其炎癥反應、調節血管內皮因子的生成。Li等[28]比較了單獨使用β-TCP、聯用β-TCP和豬炎癥牙髓干細胞以及聯用β-TCP和豬正常的牙髓干細胞對豬牙周骨缺損的影響，影像學顯示，牙髓干細胞組骨組織增量更顯著。并且正常的牙髓干細胞的成骨效果要強于炎癥牙髓干細胞，有著更強的骨保護素表達。對于這類牙髓干細胞的評價，目前大多數學者認為其具備某些情況下替代正常DPSCs的潛力，但仍需要進一步研究來明確其特性。

由于牙髓干細胞免疫原性較低，且有著良好的免疫調節作用，有學者采用異體的未經人類白細胞抗原配型的SHED聯合海綿支架植入拔牙窩的報道，6個月后臨床檢查和影像學顯示骨再生良好，且未出現安全方面問題[29]。除了牙髓來源的干細胞外，還有許多其他來源的同種異體間充質干細胞的細胞移植臨床試驗，絕大多數都未出現不良反應，然而異體MSCs的臨床應用依然存在很多倫理和安全方面的問題，還有待進一步的探究。

5 展望

牙髓干細胞近些年來受到學者們的廣泛關注，大量實驗已經證實了其組織再生能力，但是MSCs移植的生物安全性（遺傳不穩定性、致瘤性等）及其發生機制還值得進一步探索。臨床試驗和治療應當嚴格按照干細胞應用相關質控標準進行，最大化降低干細胞應用風險。目前有關牙髓干細胞促進骨再生的研究中，體外實驗和動物實驗較多，但臨床試驗較少，未來需要更多的臨床試驗來證明其臨床應用的優勢。此外，目前的研究對于牙髓干細胞的加工方法、移植方法（包括支架選擇和細胞移植數量）以及細胞移植安全性評判尚缺乏同一的標準，需要制訂一套應用標準來最大化提升其療效和應用安全性。

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（收稿日期：2021-09-23） （本文編輯：占匯娟）