丹紅通精方對精索靜脈曲張模型大鼠生精功能的影響*

何超拔，王友煉，袁少英，耿立果，覃湛，金明昱，張兆磊，王偉光

廣東省中醫院珠海醫院，廣東 珠海 519015

精索靜脈曲張(varicocele，VC)是指精索內蔓狀靜脈叢的異常擴張、伸長和迂曲。普通成人患病率約為15%[1]，其中20%～50%患者伴精液質量異常和睪丸組織學異常，并影響男性的生育能力。生精細胞的大量凋亡與VC不育癥密切相關，其細胞凋亡的機制主要與線粒體自噬相關蛋白通道、促細胞凋亡相關蛋白通道[2-3]以及環境毒素增加而誘導支持細胞腫瘤壞死因子受體超家族因子6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，Fas)配體蛋白水平上升有關[4]。VC屬于中醫學“筋瘤”范疇，治療以活血化瘀為主，并根據具體情況辨證加減，如佐以清熱祛濕、疏肝行氣、滋補肝腎等[5]。對于腎虛血瘀型VC不育癥患者，中藥治療的妊娠率可以達到與手術治療相當的效果[6]。丹紅通精方是廣東省名中醫袁少英教授基于腎虛血瘀理論制定的治療VC不育癥的經驗方，具體藥物組成：蒲黃 10 g，五靈脂10 g，水蛭3 g，丹參20 g，黃芪30 g，紅景天15 g，桃仁10 g，紅花6 g，穿破石10 g，牡蠣 30 g，川牛膝10 g，黃精10 g，枸杞子10 g，具有活血化瘀、補腎養陰之效。前期相關研究表明，丹紅通精方可顯著改善VC不育癥患者的精液質量[7]。本研究旨在通過構建VC大鼠模型探索其治療VC不育癥的現代醫學機制，為其在臨床的廣泛應用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物8周齡SPF級SD雄性大鼠40只，體質量(290±15) g，購于廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵) 2008-0002，動物質量合格證號：0094460。飼養于中山大學附屬第五醫院SPF級實驗動物中心，使用許可證號為：SYXK(粵)2018-0188。自由飲水、進食，溫度(24±2) ℃，濕度50%～70%，定期清潔消毒。

1.2 藥物及試劑蒲黃、五靈脂、水蛭、丹參、黃芪、紅景天、桃仁、紅花、穿破石、牡蠣、川牛膝、黃精、枸杞子顆粒(國藥集團江陰天江藥業有限公司，批號：19060431、19061801、19050711、19120571、19050811、19121901、19121291、19060813、19060513、19060624、19080724、19031881、19080332)。大鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)檢測試劑盒及FAS抗體、Fas配體(fas ligand，FasL)抗體(廣州市欣福聯生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0391C、E-EL-R0026C、E-EL-0031C、A0233、A0234)；原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記技術(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(美國Promega公司，批號：15595-026)；Bouin′s固定液(北京索萊寶科技有限公司，批號：G2300)。

1.3 儀器JY-9000型偉力數碼彩色精子質量檢測系統(北京偉力新世紀科技發展有限公司)；BX53型熒光正置顯微鏡(日本OLYMPUS)；Pannoramic 250 Flash 型高分辨數字病理切片掃描系統(匈牙利3DHISTECH公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥采用隨機數字表法將40只SD雄性大鼠分為假手術組、模型組及丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各8只。除假手術組外，其余組大鼠參照Turner腎靜脈縮窄術建立VC病理模型[8]，具體操作如下：戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，固定于操作臺，剃毛消毒，取腹正中切口，依次切開皮膚、肌肉、腹膜，找到左腎靜脈，順著腎靜脈找到精索內靜脈，于下腔靜脈與精索內靜脈之間放上24 G針頭，將針頭與左腎靜脈一起結扎，觀察發現左腎淤血明顯，然后小心抽出針頭。隨即可見左腎靜脈擴張和左腎淤血消失，此時左腎靜脈結扎處的直徑減半，表示手術成功。假手術組只打開腹腔并找到左腎靜脈，不結扎。術后1周，各組大鼠開始灌胃，按照人與大鼠的體表面積進行換算[9]，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按1.3 g·kg-1·d-1、2.5 g·kg-1·d-1、5.0 g·kg-1·d-1標準給藥，假手術組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水，早晚各1次，8周為1個療程。

2.2 精液質量分析灌胃結束1周后再次麻醉SD大鼠，快速打開腹腔，剝離大鼠睪丸及附睪組織。取左側附睪組織稱其質量后置于水浴箱中預溫的Hams′F10培養液中剪碎，37 ℃溫育30 min，使用 JY-9000型偉力數碼彩色精子質量檢測系統檢測精子活力及精子總數。

2.3 TUNEL檢測睪丸細胞凋亡率取左側睪丸，用冷生理鹽水反復沖洗，電子天平稱其質量，取部分睪丸組織用Bouin′s液固定，24 h后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋。切取4 μm厚睪丸組織石蠟切片，脫蠟、脫水、透明后，其余步驟按TUNEL試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下組織切片中細胞核呈棕褐色或棕黃色的細胞為TUNEL陽性細胞，觀察每張切片的5個視野，記錄生精細胞數目及凋亡的生精細胞數目，并計算生精細胞凋亡率。

2.4 Western Blot 檢測大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達水平取大鼠左側睪丸組織，用冷生理鹽水反復沖洗，組織剪剪碎組織，放入RIPA 組織裂解液中，在玻璃勻漿器中勻漿破碎細胞，操作在冰上進行，每次勻漿約1 min，間隔5 min 勻漿1 次，共5 次。4 ℃ 下放置過夜后12 000 r·min-1離心約 5 min，取上清液，分裝保存。依據BCA 蛋白定量檢測試劑盒的操作說明書檢測樣品蛋白濃度；將分離膠置于電泳槽內加入電泳液；取樣品蛋白體積2倍的加樣緩沖液，每孔60 μg上樣；開始電泳，分離膠恒壓100 V、濃縮膠恒壓120 V，直到溴酚藍跑至濃縮膠末端；剝離凝膠轉至PVDF 膜上；將PVDF膜采用TBST漂洗5 min，之后采用5%脫脂牛奶搖床封閉1.5 h；TBST 洗膜10 min后，4 ℃孵育一抗(稀釋比例為11 000)過夜；TBST洗膜3次，每次 10 min，室溫孵育二抗(稀釋比例為11 000)2 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，在暗室內顯影、定影。采用Quantity one軟件分析相關蛋白表達水平。

2.5 ELISA檢測血清性激素的水平取大鼠下腔靜脈血，離心后取血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書的要求檢測大鼠血清中FSH、LH和DHT的水平。

3 結果

3.1 各組VC大鼠附睪精液質量比較最終造模成功的SD大鼠共32只，假手術組、模型組及丹紅通精方低劑量組各6只，丹紅通精方中劑量組、高劑量組各7只。結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠的精子總數和運動精子百分比明顯降低，不運動精子百分比明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的精子總數和運動精子百分比明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；丹紅通精方中劑量組、高劑量組大鼠不運動精子的百分比明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1 各組VC大鼠附睪精液質量比較

3.2 丹紅通精方對大鼠睪丸組織細胞凋亡的影響假手術組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，生精上皮飽滿，各級生精細胞層次清晰，管腔內精子濃度高，可見不同發育形態的精子，未見明顯凋亡的精子細胞。模型組大鼠睪丸組織生精小管排列紊亂，邊界萎縮、塌陷，生精上皮結構錯亂，各級生精細胞層次不清，管腔內精子稀少。丹紅通精方低劑量組大鼠睪丸組織可見部分結構完整的生精小管，形態不一，生精上皮萎縮，細胞稀疏，管腔塌陷，管腔內可見少量精子細胞。丹紅通精方中劑量組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，生精上皮飽滿，各級生精細胞層次清晰，管腔內可見不同發育時期精子及少量精子細胞凋亡。丹紅通精方高劑量組大鼠睪丸組織生精小管排列整齊，邊界完整清晰，各級生精細胞層次清晰，管腔內精子濃度高，可見大量凋亡的精子細胞。細胞凋亡率比較發現，與假手術組比較，模型組大鼠睪丸組織細胞凋亡率升高；與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠睪丸組織細胞凋亡率降低；與丹紅通精方中劑量組比較，丹紅通精方低劑量組、高劑量組大鼠睪丸組織細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組VC大鼠睪丸組織細胞凋亡率比較

注：A：假手術組；B：模型組；C：丹紅通精方低劑量組；D：丹紅通精方中劑量組；E：丹紅通精方高劑量組圖1 丹紅通精方對大鼠睪丸組織細胞凋亡的影響(×400)

3.3 各組VC大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白表達比較與假手術組比較，模型組大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，丹紅通精方低劑量組、中劑量組大鼠睪丸組織中Fas、FasL蛋白的表達水平顯著降低，丹紅通精方高劑量組大鼠睪丸組織中FasL蛋白的表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，Fas蛋白的表達水平雖有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 各組SD大鼠睪丸組織Fas、FasL蛋白表達Western Blot圖

3.4 各組VC大鼠血清性激素水平比較與假手術組比較，模型組大鼠血清中LH、FSH水平升高，DHT水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，丹紅通精方高劑量組大鼠血清中LH水平升高，丹紅通精方各給藥組大鼠血清中FSH的水平降低，DHT的水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組VC大鼠睪丸組織Fas、FasL蛋白表達比較

表4 各組VC大鼠血清性激素水平比較

4 討論

現代醫家對VC不育癥的病因病機論述不盡一致，如賈玉森教授認為補腎法應貫穿VC不育癥整個治療過程[10]；張耀圣教授認為清陽不升、濁陰不降為因，腎虛血瘀為果，主張健脾益氣，升清降濁[11]；鄭軍狀等[12]認為，VC應以肝腎立論，肝氣郁結、經絡瘀阻、腎精不足是本病的基本病機，基本治則為疏肝通絡強精。盡管各家論述有所側重，但始終離不開腎虛與血瘀兩方面，即腎虛血瘀是VC不育癥基本病機[13-14]。袁少英[15]認為瘀血內阻是VC的根本病因，瘀血日久，化熱傷陰傷氣，耗傷腎精腎氣，故瘀熱傷陰是VC不育癥的主要病機。故VC不育癥患者辨證當以化瘀為前提，并輔以補腎養陰生精之品，改善VC導致睪丸生精功能的損傷，調節性激素的水平[13，16]。丹紅通精方是袁少英教授30余年實踐經驗的自創代表方，由蒲黃、五靈脂、水蛭、丹參、黃芪、紅景天、桃仁、紅花、穿破石、牡蠣、川牛膝、黃精、枸杞子組成，體現活血化瘀、養陰生精的學術思想。方中紅景天益氣補血活血，水蛭破血通經、逐瘀消癥，“力攻積久之滯”；蒲黃、五靈脂合用即失笑散，是化瘀止痛的要藥，四藥合用為君，共奏活血化瘀、通絡止痛、補益氣血之效，起到推陳出新、驅邪不傷正的效果。黃精、枸杞子共同組成二精丸，《本草經疏》曰：“枸杞子，潤而滋補，兼能退熱，而專于補腎、潤肺、生津、益氣，為肝腎真陰不足、勞乏內熱補益之要藥。”《本經逢原》曰：“黃精，寬中益氣，使五藏調和，肌肉充盛，骨髓強堅，皆是補陰之功。”丹參可活血涼血、清瘀熱；穿破石清熱活血，諸藥合用，可補腎填精，活血清熱養陰，共為臣藥。黃芪可大補脾腎之氣，升舉陽氣，益氣養血，為氣中血藥；桃仁、紅花可活血止痛、化瘀通絡；牡蠣性味咸，微寒，入肝腎經，可軟堅散結，共為佐藥，可活血化瘀、升舉陽氣；牛膝既能活血，又引藥下行至病所，具有畫龍點睛之筆為使藥。前期的研究結果表明，丹紅通精方能改善VC不育癥患者精子濃度、精子總活力、精子前向運動率、精子低滲腫脹率、精子頂體酶，降低精漿缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的水平，其作用機制可能與改善生殖系統缺氧狀態有關[7]。但其是否可通過性激素或Fas/FasL通路改善精液參數尚未明確。

本次研究的結果顯示，造模成功的VC大鼠精子總數及活力下降，DHT水平降低，FSH、LH反饋性升高；服用丹紅通精方可顯著提高VC不育模型大鼠的精子總數，改善精子活力，其中丹紅通精方中劑量組、高劑量組大鼠的不動精子百分數降低，與已有的研究結果一致，表明丹紅通精方可改善VC大鼠的精液參數。

精子的生長及分化受下丘腦-腺垂體-睪丸軸的內分泌水平調控。LH可促進睪丸間質細胞分泌雄激素，以刺激精子的發生。FSH促進支持細胞分泌雄激素結合球蛋白，與雄激素結合，保持生精小管內較高的活性雄激素水平，促進精子發生。而支持細胞分泌的抑制素和間質細胞分泌的雄激素可反饋性抑制下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropinreleasing hormone，GnRH)和腺垂體FSH、LH的分泌。支持細胞分泌的抑制素減少，導致FSH、LH反饋性升高。VC大鼠由于睪丸缺氧、局部高溫及氧化應激等機制導致睪丸組織細胞不同程度凋亡[17]，從而導致生精功能障礙。研究表明，FSH、LH在促性腺激素抑制模型中可獨立維持精子的發生[18]，給予不同劑量的丹紅通精方后，睪丸間質細胞分泌的雄激素增多，對下丘腦GnRH的負反饋作用減弱，VC不育大鼠血清中DHT水平升高，反饋性降低FSH水平，提高LH水平。即丹紅通精方可通過負反饋抑制作用增加LH的分泌，減少FSH的分泌；還可促進間質細胞分泌DHT，促進精子的發育和成熟，二者共同作用改善精子濃度及活力。

Fas、FasL是兩種重要的調控細胞凋亡的蛋白質，在人體的子宮、睪丸、甲狀腺、腦等器官廣泛表達，對生殖系統具有重要的作用。Lee等[19]證明了大鼠的睪丸遭受理化損傷后(如輻射暴露或給藥)，Fas會在睪丸中大量表達。Francavild S等[20]發現，在生殖細胞停滯患者中 Fas表達上升，表明某些不育患者中Fas過量表達可能導致精子質量低下。也有研究表明，Fas在成熟精子的表達可作為細胞凋亡的生物標志物[21]。張培海等[22]認為大多補腎活血類中藥可以抑制FasL的過度表達，減少生精細胞的凋亡進而改善精液質量。對于Fas系統具體的調節機制，有研究者認為[23-25]，睪丸細胞凋亡主要涉及FasL依賴性，內源性和外源性凋亡途徑的直接或間接調節。一方面，FasL誘導信號復合體(death-inducing signaling complex，DISC)激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，然后激活caspase-3、caspase-6、caspase-7級聯反應，導致細胞凋亡；另一方面，caspase-8的激活有助于調控線粒體通路作用于B 細胞淋巴瘤-2(B cell leukemia，Bcl-2) /Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)，上調caspase-9、caspase-3誘導凋亡。本次研究中，與假手術組比較，模型組大鼠的睪丸組織破壞嚴重，顯微鏡下可見生精小管塌陷、排列紊亂，各級生精細胞層次不清，管腔內精子稀少。TUNEL及Western Blot的結果表明，與模型組比較，服用不同劑量的丹紅通精方后，大鼠的睪丸組織凋亡率明顯下降，凋亡相關因子Fas、FasL蛋白的表達降低，表明丹紅通精方可以通過下調Fas、FasL蛋白的表達水平，降低VC大鼠睪丸細胞的凋亡率，改善大鼠的生精功能。

綜上，丹紅通精方可明顯改善VC大鼠睪丸的生精功能及精液質量，其作用機制可能與調控性激素LH、FSH、DHT及凋亡相關蛋白Fas、FasL的表達水平有關。